放射自顯影術(shù)-課件

第七章放射自顯影術(shù)

利用放射性核素放出的核射線使感光材料中的鹵化銀感光，形成圖像，來記錄、檢查和測量標(biāo)本中放射性示蹤劑的部位及強(qiáng)弱的方法，稱為放射自顯影術(shù)（autoradiography,ARG）§1放射自顯影的原理

一、放射自顯影的過程放射自顯影術(shù)的原理和普通光學(xué)攝影的原理基本相同，都是使感光材料曝光后，發(fā)生化學(xué)變化，經(jīng)過顯影和定影處理，得到圖像。1ppt課件（一）感光材料中的溴化銀被帶電粒子作用，釋放出電子。AgBr+β→Ag++Br+e-（二）該電子立即被帶正電荷的銀離子所俘獲.e-+Ag+→Ag（三）很多帶正電荷的銀離子被還原，在溴化銀分子中形成潛影。Ag……Ag→nAg

（四）潛影經(jīng)顯影、定影處理后，即顯示放射自顯影圖像，其圖像銀粒黑化的程度取決于組織標(biāo)本中放射性活度的多少，呈正比關(guān)系。

2ppt課件二、潛影的形成和消退（一）潛影的形成感光乳膠中的溴化銀以微晶體顆粒懸浮于明膠中，溴化銀晶體是由Ａg+和Ｂr-的點(diǎn)陣組成，在制備乳膠的過程中，使點(diǎn)陣產(chǎn)生缺陷，這些缺陷便構(gòu)成潛影形成的敏化中心（sensitivityspeck），當(dāng)核射線、光線、熱、壓力或張力等作用于溴化銀時(shí)，離子中的電子便向敏化中心移動，形成帶陰電荷的靜電層，然后帶正電荷的銀離子便向此處聚集而變?yōu)殂y原子。3ppt課件4ppt課件

盡管聚集于感光中心的銀離子只占溴化銀結(jié)晶原含量的十億分之一，然而在顯影過程中發(fā)揮重要的催化作用，使溴化銀結(jié)晶還原成金屬銀顆粒，因而也稱為顯影中心。這種顯影中心形成的過程便稱為潛影形成。（二）潛影消退潛影消退是指已形成潛影的鹵化銀晶體，在水、氧作用下，已生成的極少量銀原子又退變成離子返回晶格，而失去原有的催化作用。為避免這種現(xiàn)象發(fā)生，在曝光期間，常保持干燥、低溫，甚至隔氧，或者在暗盒中充填氮?dú)饣蚨趸細(xì)怏w等。

5ppt課件§2放射自顯影的材料一、感光材料的種類及選擇（一）原子核乳膠１、液體核乳膠（liquidnuclearemusion)：由溴化銀與明膠按８０∶２０的比例組成的懸浮液體，在常溫下為液態(tài)，低溫下呈膠凍狀，貯存于４℃冰箱中，使用時(shí)在暗室內(nèi)取出所需量放４０℃恒溫水浴中熔化，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體要求，用去離子水或雙蒸餾水適當(dāng)稀釋。為了使乳膠易于流布，防止乳膠脆裂，減少氣泡及降低本底，必要時(shí)可加入十分之一體積的硬化劑溶液，6ppt課件乳膠型號核-2核-４ＨＷ-３ＨＷ-４銀晶體直徑０.170.240.10～0.110.14適用范圍α粒子所有帶電粒子所有帶電粒子（電鏡自顯影用）中國原子能科學(xué)研究院生產(chǎn)的幾種核乳膠

7ppt課件２、核乳膠干板（Nuclearemulsionplate)

是將液體核乳膠均勻地涂布于玻片上，經(jīng)干燥后制成。專用于宏觀及光鏡自顯影，其乳膠層的厚度視實(shí)驗(yàn)要求而定。３、揭膜核乳膠（strippingfilmemulsion)

又稱脫底核乳膠膜。制備方法與核乳膠干板一樣。不同的是，將核乳膠干版上的膜揭下來供放射自顯影用。多用于光鏡自顯影的定量研究。8ppt課件（二）氚片（Tritiumfilm)

為溴化銀或碘化銀與明膠組成。專用于低能β射線（如３Ｈ）的整體或臟器宏觀放射自顯影。

（三）Ｘ線片（Ｘ-rayfilm)

為溴化銀或碘化銀與明膠組成。片基為醋酸纖維素膜，在膜的兩面都涂上乳膠層，其乳膠中的銀粒較粗，直徑為２.５×１０-６

m。由于乳膠層每面厚1.5～3.0×10-5

m，分辨力較低，只用于宏觀自顯影。9ppt課件（一）常用放射性核素及物理特性１、射線種類（１）α粒子：質(zhì)量大，作用于核乳膠時(shí)，電離密度大，射程短，容易被吸收，其運(yùn)動徑跡細(xì)而呈直線型，形成的潛影清晰，有較好的分辨力。（２）β粒子：低能β粒子（如3Ｈ、１４Ｃ等）徑跡均短，形成的潛影清晰，有較好的分辨力，目前應(yīng)用較多的是３Ｈ、１４Ｃ。（３）γ射線：又稱γ光子，它本身不帶電，由于射程遠(yuǎn)，穿透力強(qiáng)，在乳膠中形成潛影的幾率較小，因而形成放射自顯影圖像極難，故一般很少選用。10ppt課件核素半衰期（T1/2）β粒子最大能量（mev)β粒子平均能量（mev）在乳膠干板中的平均射程（×10-6

m）3H12.33年0.1860.0050.514C5730年0.1560.051532P14.28天1.710.69570035S87.4天0.1670.0552045Ca１６５天0.2580.105059Fe44.6天0.460.128089Sr50.5天1.4880.57600131Ｉ8.04天0.6060.205160ARG常用的幾種放射性核素及物理特性

11ppt課件２、物理半衰期在放射自顯影實(shí)驗(yàn)中，要注意選擇適宜的半衰期，半衰期太短將難以保證足夠的曝光時(shí)間，造成操作不便。目前多半選用長物理半衰期的放射性核素，以便于標(biāo)本的處理及產(chǎn)生良好的圖像。３、能量選擇放射性核素示蹤劑的合適能量，也是獲得理想的自顯影圖像的關(guān)鍵。能量越大，在核乳膠中的射程越長，分辨力越差。能量抵的核素能獲得較高的分辨力和清晰的圖像，故在自顯影實(shí)驗(yàn)中首選低能的放射性核素，如３Ｈ、１４Ｃ。12ppt課件（二）放射性核素的示蹤劑量幾種常用示蹤劑的參考劑量

標(biāo)記物用途劑量（kBq/kg)３Ｈ-化合物整體動物、臟器３７～６４０１４Ｃ-化合物整體動物、臟器３.７～３７３５Ｓ-化合物整體動物、臟器１８.5４５Ｃa-CaCl2整體、骨骼、牙齒３.７～７.４１２５Ｉ-ＮaI甲狀腺０.７４～１.８５１３１Ｉ-NaI甲狀腺０.７４～１.８５３Ｈ-TdR體外細(xì)胞組織培養(yǎng)１８.５～１８５/ml培養(yǎng)液13ppt課件§3放射自顯影的基本技術(shù)和方法

一、放射自顯影技術(shù)的主要類型

（一）宏觀自顯影是指用肉眼或放大鏡觀察放射自顯影圖像形成的黑度強(qiáng)弱來判斷放射性核素示蹤部位及數(shù)量。這種自顯影技術(shù)觀察的范圍較大，而分辨力較低。一般用于小動物的整體標(biāo)本或大動物的臟器、肢體研究。（二）光鏡自顯影術(shù)又稱微觀自顯影，觀察的范圍較小，要憑借光學(xué)顯微鏡才能觀察到，主要用于組織切片、細(xì)胞涂片及離體組織受體與抗原定位等自顯影。

14ppt課件（三）電鏡自顯影術(shù)

電子顯微鏡自顯影術(shù)是將電子顯微鏡和放射自顯影兩種技術(shù)的各自優(yōu)點(diǎn)加以綜合利用的一種實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)。目前已被用于細(xì)胞、亞細(xì)胞及生物大分子水平的放射性核素示蹤研究。二、放射自顯影的基本方法

（一）示蹤劑的引入方法

示蹤劑的引入方法要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蠖捎?。一般采取以下方法?5ppt課件１、在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，采用靜脈、肌肉、腹腔及灌胃途徑引入體內(nèi)。２、在體外實(shí)驗(yàn)中，如為培養(yǎng)的組織或細(xì)胞，則可直接加入培養(yǎng)瓶中；如為切片標(biāo)本，則可直接加在切片標(biāo)本上進(jìn)行保溫；如為神經(jīng)解剖特殊示蹤自顯影，則可將示蹤劑濃縮１００～２００倍后，用大腦立體定位儀直接注射到神經(jīng)核團(tuán)中；對有的不能通過血腦屏障的示蹤劑，常用腦室或腦池注射。16ppt課件（二）標(biāo)本制備方法１、組織切片：包括冰凍切片和石蠟切片。石蠟切片組織清晰，染色良好，應(yīng)在可能條件下，盡量采用。2、體液中的有形成分：可直接或離心濃縮后，制成涂片。3、培養(yǎng)的細(xì)胞：可將蓋玻片于培養(yǎng)基中制成單層細(xì)胞標(biāo)本，或?qū)腋∫褐瞥赏科?、電鏡標(biāo)本：用超薄切片機(jī)制成超薄切片。17ppt課件（三）自顯影片的制備方法１、接觸法將標(biāo)本或切片直接與核乳膠表面緊密接觸，曝光完畢后再進(jìn)行顯影、定影等程序后，即可進(jìn)行閱片分析。該法簡單，但分辨力較差，適用于宏觀自顯影術(shù)。２、濕貼法將樣品切片直接貼在乳膠膜上，不再分開，經(jīng)顯影、定影、水洗、晾干、染色和封固后供閱讀分析。此法簡便，樣品定位分析方便，分辨力較高。缺點(diǎn)是乳膠中的明膠在染色時(shí)會吸附較多染料對閱讀分析有一定影響。18ppt課件４、液體乳膠法將標(biāo)本切片或涂片表面均勻地涂布液體核乳膠，晾干后經(jīng)曝光，顯定影、水洗、干燥、染色及封固后供閱讀分析。該法分辨力很高，樣品定位精確，應(yīng)用范圍廣。具體操作方法是：選擇好所需的核乳膠型號，在暗室內(nèi)，置４０℃水浴中融化，適當(dāng)稀釋、攪勻，吸取配好的乳膠滴到載有組織切片或細(xì)胞的玻片一端，用細(xì)玻棒往一個方向輕拉涂布，乳膠則隨著棒子移動。平放晾干后，放暗盒中曝光。再經(jīng)顯定影等一系列處理即可。19ppt課件（四）曝光

１、曝光量-示蹤劑量曝光即是樣品內(nèi)放射性示蹤劑放出的射線對感光材料輻照而感光。放射性示蹤劑量直接影響曝光過程。２、曝光時(shí)間曝光時(shí)間取決于樣品內(nèi)放射性強(qiáng)弱，如放射性強(qiáng)，則曝光時(shí)間宜短，放射性弱時(shí)，則曝光時(shí)間宜長?？偟膩碚f，影響因素較多，要考慮示蹤核素的特點(diǎn)，引入的方式及劑型，代謝的特點(diǎn)，感光材料和自顯影的選擇及制備等因素。20ppt課件（五）顯像處理１、顯影顯影過程是使感光材料中已感光的銀鹽還原成金屬銀。顯影是通過顯影液完成的。目前最常用的顯影液是由顯影劑、促進(jìn)劑、保護(hù)劑及抑制劑組成。顯影劑主要起還原作用，常用米吐爾（硫酸甲苯對氨基苯酚）及海得爾（對苯二酚）等。促進(jìn)劑是提供堿性環(huán)境，增加顯影作用，常用碳酸鈉。保護(hù)劑是中和還原劑的氧化產(chǎn)物，延長顯影液的作用效果，常用亞硫酸鈉。抑制劑能抑制未形成潛影的銀鹽的分解，防止本底升高，常用溴化鉀。目前常用的顯影液Ｄ-１９b配方如表所示。21ppt課件水（５０℃）５００ml米吐爾２.０g無水亞硫酸鈉７２.０g海得爾８.８g無水碳酸鈉４８.０g溴化鉀４.０g加水至全量１０００mlD-19b顯影液配方

按表中配方依次加入藥品試劑，待前一種溶解后再加下一藥品，最后全溶后加水至1000ml。配好的顯影液盛于棕色瓶中，避光，低溫保存。顯影時(shí)間一般在２～4分鐘。22ppt課件２、停影顯影結(jié)束后，立即將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至１％冰醋酸液中，其作用是因?yàn)轱@影液為堿性溶液，僅用水洗，則只能洗去表面的堿。而內(nèi)在的堿要用上述冰醋酸液來中和清洗，才能得到停顯效果。停影液的配方是98％冰醋酸15ml加水至全量1000ml。停顯時(shí)間不少于５秒。３、定影顯影結(jié)束后，取出標(biāo)本用蒸餾水漂洗后再浸入定影液中處理，及時(shí)終止顯影反應(yīng)，溶去乳膠中未顯影的溴化銀晶體，讓金屬銀顆粒保留，形成固定影像。

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定影液由定影劑、保護(hù)劑、停顯劑和堅(jiān)膜劑組成。定影劑的作用是溶去未感光的銀晶體，常用海波（硫代硫酸鈉）。保護(hù)劑的作用是與酸反應(yīng)形成亞硫酸氫根離子，而抑制海波被酸分解，常用亞硫酸鈉。停顯劑是終止顯影液的繼續(xù)作用，常用醋酸。堅(jiān)膜劑能防止乳膠層在定影和水洗過程中發(fā)生脫落、擦傷，常用鉀礬。常用的定影液為酸性堅(jiān)膜定影液。即KodakF-５定影液，其配方如表所示。24ppt課件F-5定影液配方

水(50℃)600ml海波240.0g無水亞硫酸鈉15.0g28%醋酸(冰醋3份加水8份)48ml硼酸(結(jié)晶)7.5g鉀礬15.0g加水至全量1000ml配制注意事項(xiàng)與顯影液相同，定影時(shí)間一般在4～8分鐘。25ppt課件

4、水洗定影結(jié)束后，用流水沖洗10～20分鐘，以除去顯定影時(shí)殘留在乳膠表面的各種化學(xué)物質(zhì)。5、干燥沖洗干凈的標(biāo)本片，在室溫下自然干燥或人工干燥，干燥時(shí)要保持環(huán)境干凈，以免空氣中灰塵落入，影響自顯影片的質(zhì)量。26ppt課件§4放射自顯影的影響因素

一、自顯影的本底在自顯影中，除了標(biāo)本內(nèi)的放射性示蹤劑外，其它原因造成的銀粒顯影，稱為自顯影的本底。本底過高，可以掩蓋標(biāo)本低水平放射自顯影的測量及降低分辨力。常見造成本底增高的因素有：暗室紅燈過亮；標(biāo)本制作過程中受外環(huán)境放射性的影響；顯影時(shí)間過長；溫度過高；乳膠受到壓力和張力作用；其它化學(xué)物質(zhì)影響；感光材料超過使用期限等。27ppt課件二、自顯影的分辨力

放射自顯影的分辨力是指標(biāo)本中放射性示蹤劑與其在乳膠中所形成的影像的符合程度。分辨力高低可用半距離(HD)和用半半徑(HR)來表示。半距離：是指在放射源兩側(cè)影像中的銀顆粒減少到放射源本身影像粒數(shù)目一半時(shí)的距離。半半徑：是指以點(diǎn)狀源為中心，以某一距離為半徑制圓形，而在這一圓內(nèi)包括了該點(diǎn)狀源造成的銀?？倲?shù)的一半。半距離和用半半徑越小，放射自顯影的分辨力越高。28ppt課件三、自顯影的效率所謂自顯影的效率是指標(biāo)本在曝光期間，所含放射性示蹤劑每100次衰變所產(chǎn)生的顯影銀顆粒數(shù)目。影響自顯影效率的因素有：示蹤核素所放射線的能量；標(biāo)本的厚度；乳膠的厚度及乳膠中溴化銀顆粒大??；乳膠的敏感性；乳膠與放射源的距離；曝光時(shí)間的長短及曝光期間氧與水的多少和顯影時(shí)間是否充分。

29ppt課件§5自顯影的閱讀與分析

自顯影圖像出來后，正確閱讀和分析圖像是判斷結(jié)果的重要環(huán)節(jié)。一、宏觀自顯影直接用肉眼或借助一般放大鏡觀察，也可用光密度計(jì)測量。主要根據(jù)放射性示蹤劑所在部位的黑度來判斷，黑度越大，其光密度越高，表示該處放射性越強(qiáng)，放射性示蹤劑分布越多。分析時(shí)要注意定位準(zhǔn)確，并注意對比條件一致和本底情況。一般情況下，此法可得出標(biāo)本中示蹤劑分布的準(zhǔn)確位置及定量。30ppt課件二、光鏡自顯影在光學(xué)顯微鏡下，用油鏡或高倍鏡觀察顯影銀粒分布的位置和數(shù)量，一般以該單位面積上的銀粒數(shù)來確定其放射性強(qiáng)弱。觀察中，如用高倍鏡，則銀粒呈棕黑色點(diǎn)狀；如用油鏡，