微生物基本試驗原理和操作培訓(xùn)課件

微生物基本試驗原理和操作碳源和氮源利用試驗

檸檬酸鹽試驗

葡萄糖酸鹽試驗

2微生物基本試驗原理和操作檸檬酸鹽試驗

原理：有些細菌能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，分解檸檬酸鈉生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基呈堿性。能利用檸檬酸鹽作唯一碳源的細菌，也能利用銨鹽作為唯一氮源，銨鹽被分解為氨而產(chǎn)生堿性。3微生物基本試驗原理和操作西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基成分

MgSO4-7H2O0.2gNH4H2PO41gK2HPO41g檸檬酸鈉5g氯化鈉5g瓊脂20g0.2%溴麝香草酚藍溶液40ml蒸餾水1000ml4微生物基本試驗原理和操作結(jié)果：陽性者表面上長有菌落，培養(yǎng)基變?yōu)樗{色。

5微生物基本試驗原理和操作葡萄糖酸鹽試驗

原理：檢查細菌是否具有氧化葡萄糖作為唯一碳源，并具有還原2-酮基葡萄糖酸鹽與班氏試劑混合加熱生成黃紅色酮類的能力。6微生物基本試驗原理和操作方法：接種大量待檢菌于培養(yǎng)基內(nèi)，35，24-48小時，0.5ml培養(yǎng)基加班氏試劑3滴左右，加熱煮沸后觀察結(jié)果。7微生物基本試驗原理和操作葡萄糖酸鹽蛋白胨肉湯成分

蛋白胨0.15g酵母浸膏0.1g磷酸二氫鉀0.1g葡萄糖酸鉀（或鈉）4g蒸餾水100ml8微生物基本試驗原理和操作結(jié)果：出現(xiàn)黃色到橙紅色沉淀為陽性，無顏色變化為陰性。

9微生物基本試驗原理和操作碳水化合物的代謝試驗

氧化-發(fā)酵試驗（OF試驗）糖醇發(fā)酵試驗

B—半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）

甲基紅試驗

VP試驗

膽汁七葉苷試驗

10微生物基本試驗原理和操作氧化-發(fā)酵試驗（OF試驗）

原理：細菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的稱為氧化型；在無氧條件下降解葡萄糖的稱為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細菌稱為產(chǎn)堿型。利用此試驗可以區(qū)別細菌的代謝類型。11微生物基本試驗原理和操作Hugh-Leifson二氏培養(yǎng)基（O-F培養(yǎng)基）成分蛋白胨2g磷酸氫2鉀0.3克氯化鈉5g葡萄糖10g0.2%溴麝香酚藍溶液12ml瓊脂2.5g蒸餾水1000ml12微生物基本試驗原理和操作方法：將待檢菌接種于二支Hugh-Leifson培養(yǎng)基的試管中，均用接種針穿至管底，其中五支加入滅菌的液體石蠟約1厘米厚。35，培養(yǎng)48小時觀察結(jié)果。培養(yǎng)基顏色變黃即為產(chǎn)酸。13微生物基本試驗原理和操作結(jié)果

代謝類型

加蠟封口管

開放管發(fā)酵型產(chǎn)酸產(chǎn)酸氧化型不變色產(chǎn)酸產(chǎn)堿型不變色不變色

14微生物基本試驗原理和操作糖醇發(fā)酵試驗

原理：各種細菌因含有發(fā)酵不同糖、醇類的酶，所以分解糖、醇類的能力各不相同。分解糖、醇類后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可因菌種不同而異，有的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，有的僅產(chǎn)酸，故用于鑒別細菌。15微生物基本試驗原理和操作糖、醇類試驗培養(yǎng)基成分

蛋白胨水或肉膏湯100ml所需的糖、醇或苷類0.5或1g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.1ml16微生物基本試驗原理和操作結(jié)果

接種的細菌，若能耐分解培養(yǎng)基中的糖類產(chǎn)酸時，則使培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)。若產(chǎn)氣可使半固體培養(yǎng)基內(nèi)或液體培養(yǎng)基中的倒管內(nèi)出現(xiàn)氣泡。若不分解則無變化。17微生物基本試驗原理和操作B—半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）

原理：有的細菌可產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，此酶可分解鄰-硝基酚-B-D-半乳糖苷（ONPG）。ONPG為無色，經(jīng)B-半乳糖苷酶水解后，可產(chǎn)生黃色的鄰硝基酚，即使?jié)舛群艿鸵材軝z出。18微生物基本試驗原理和操作結(jié)果

呈現(xiàn)黃色為陽性反應(yīng)。迅速及遲緩分解乳糖的細菌ONPG試驗為陽性，本試驗可作為遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定方法。19微生物基本試驗原理和操作甲基紅試驗

原理：某些細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可進一步被分解為甲酸、乙酸、乳酸等，而使培養(yǎng)基的pH下降至4.5以下，加入甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色（陽性）。

20微生物基本試驗原理和操作甲基紅試驗

原理：有些細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)（如醇、酮、醛、氣體和水），則培養(yǎng)基的酸堿度仍在6.2以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色（陰性）。21微生物基本試驗原理和操作葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基成分

多價蛋白胨7g葡萄糖5g磷酸氫二鉀5g蒸餾水1000ml22微生物基本試驗原理和操作

方法：被檢菌接種于上述培養(yǎng)基內(nèi)，于35℃培養(yǎng)48小時，于2ml培養(yǎng)液內(nèi)加甲基紅指示劑2滴，立即觀察結(jié)果。23微生物基本試驗原理和操作結(jié)果：紅色為陽性；桔紅色為弱陽性；黃色為陰性。24微生物基本試驗原理和操作VP試驗

原理：有些細菌在葡萄糖的代謝過程中生成丙酮酸，丙酮酸進一步脫羧后可產(chǎn)生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣的氧氧化為二乙酰（丁二酮），進而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中的精氨酸所含的胍基發(fā)生反應(yīng)，生成紅色化合物，即VP反應(yīng)陽性。培養(yǎng)基中的胍基太少時，加入少量含胍基的化合物，如肌酸或肌酸酐等，可加速此反應(yīng)。

25微生物基本試驗原理和操作

試劑：甲液：6%a-萘酚乙醇溶液乙液：40%氫氧化鉀溶液26微生物基本試驗原理和操作方法：將被檢菌接種葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基后，于35培養(yǎng)48小時，于2ml培養(yǎng)基內(nèi)加入甲液1ml和乙液0.4ml，振搖后觀察結(jié)果。27微生物基本試驗原理和操作結(jié)果：于數(shù)分鐘內(nèi)呈紅色為陽性；如無紅色出現(xiàn)，而且于35℃中4小時后仍如故者即為陰性。本試驗較為敏感。28微生物基本試驗原理和操作膽汁七葉苷試驗

原理：在10-14%膽汁存在下，測定細菌水解葡萄糖苷七葉苷為七葉亭和葡萄糖的能力。29微生物基本試驗原理和操作

膽汁七葉苷培養(yǎng)基成分

蛋白胨5g

牛肉浸膏3g

牛膽汁（膽汁）40g

七葉苷1g

檸檬酸鐵0.5g

瓊脂15g

蒸餾水1000ml30微生物基本試驗原理和操作結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蛏詈稚珵殛栃?。有生長物時，并不表示七葉苷裂解，僅表示膽汁濃度不能抑制D群鏈球菌外的細菌生長。31微生物基本試驗原理和操作各種酶類試驗

過氧化氫酶（觸酶）試驗

氧化酶試驗

血漿凝固酶試驗

硝酸鹽還原試驗?zāi)懼芙庠囼灜h(huán)腺苷酸（cAMP）試驗

32微生物基本試驗原理和操作過氧化氫酶（觸酶）試驗

原理：有些細菌具有過氧化氫酶，能將過氧化氫酶分解為水。試劑：3%過氧化氫溶液。33微生物基本試驗原理和操作方法：①玻片法：用牙簽挑取18～24小時培養(yǎng)的菌苔，置于潔凈的玻片上，滴加3%過氧化氫溶液1～2滴。②試管法：取不含血液的18～24小時培養(yǎng)物一接種環(huán)于試管內(nèi)，加入1ml3%過氧化氫溶液。3%過氧化氫溶液應(yīng)置于棕色瓶內(nèi)冷藏。34微生物基本試驗原理和操作結(jié)果：產(chǎn)生大量氣泡為陽性，不產(chǎn)生氣泡為陰性。35微生物基本試驗原理和操作血漿凝固酶試驗

原理：凝固酶能凝固血漿纖維蛋白，是鑒定金黃色葡萄球菌的主要試驗。本試驗分玻片法和試管法，玻片法主要是檢測結(jié)合凝固酶，試管法是為了肯定玻片法試驗結(jié)果和對玻片法試驗陰性者進行復(fù)查，檢測游離凝固酶。36微生物基本試驗原理和操作血漿凝固酶試驗原理：結(jié)合凝固酶為金黃色葡萄球菌細胞表面含有，游離凝固酶為金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種胞外酶，兩酶均可作用于血漿中的纖維蛋白原，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，形成凝塊。37微生物基本試驗原理和操作

方法：玻片法：在玻片上加一滴滅菌生理鹽水，取葡萄球菌18-24小時肉湯培養(yǎng)物一環(huán)，或挑取平板上一個單個菌落制成濃菌懸液，再加一接種環(huán)新鮮人或兔血漿與菌懸液混勻。同時做陽性菌和陰性菌對照試驗，立刻觀察凝塊的形成。本試驗應(yīng)先在生理鹽水中乳化，檢查有否自凝現(xiàn)象。防止出現(xiàn)假陽性結(jié)果。陽性結(jié)果一般在5-20秒內(nèi)出現(xiàn)，若3-4分鐘后仍無凝固，可考慮為玻片法試驗陰性。

38微生物基本試驗原理和操作試管法：將潔凈小試管中加0.5ml未稀釋的人或兔血漿，加0.5ml培養(yǎng)18-24小時的葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物一滿環(huán)，或挑取平板上的純菌落，輕輕轉(zhuǎn)動（不要搖動）試管混勻。放35水浴中4小時，每隔30分鐘檢查一次有無凝固。檢查時不要振動或搖動試管，可輕輕將試管傾斜以觀察有無凝塊。大多數(shù)金黃色葡萄球株在35℃4小時可以凝固血漿，如果陰性對照。枸椽酸鹽抗凝的血漿可產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

39微生物基本試驗原理和操作

氧化酶試驗

原理：某些細菌具有氧化酶，在有氧和細胞色素C時，使還原型細胞色素C氧化，氧化型細胞色素C再使二甲基對苯二胺氧化，產(chǎn)生玫瑰紅至暗紫色。有時菌落本身帶有紅色，不易觀察，可再加入a-萘酚乙醇溶液，使生成深藍色的靛酚藍。40微生物基本試驗原理和操作

試劑：1．

1%鹽酸二甲基對苯二胺（或四甲對苯二胺）水溶液2．

1%a-萘酚95%乙醇溶液41微生物基本試驗原理和操作

方法：取18-28小時的新鮮培養(yǎng)物，用無菌濾紙條，蘸取菌落少許，滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺1-2滴，觀察結(jié)果。42微生物基本試驗原理和操作

結(jié)果：一分鐘內(nèi)出現(xiàn)紫紅色為陽性。若菌落本身有色素，則再滴加a-奈酚1-2滴，出現(xiàn)藍色則為陽性。43微生物基本試驗原理和操作硝酸鹽還原試驗

原理：硝酸鹽還原反應(yīng)有兩個過程，其一是硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，其二是繼續(xù)將亞硝酸鹽進一步分解為氨、氮、氧化氮等氣體終末產(chǎn)物。44微生物基本試驗原理和操作硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基成分

蛋白胨1g

硝酸鉀0.1g

蒸餾水100ml45微生物基本試驗原理和操作方法：將待檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)1-4天，將甲、乙試劑各加0.1ml于試管內(nèi)，混勻觀察結(jié)果

46微生物基本試驗原理和操作

結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性。如無紅色出現(xiàn)，應(yīng)加少量鋅粉，如仍無紅色說明亞硝酸鹽進一步分解成氮、氨等氣體，應(yīng)判為陽性；如加鋅粉出現(xiàn)紅色，說明還原劑鋅粉使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，待檢菌無還原硝酸鹽的能力，為陰性。47微生物基本試驗原理和操作膽汁溶解試驗

原理：在特定時間和溫度條件下測定膽鹽溶解細菌的能力。溶菌的機理尚未定論，有人認為膽鹽或膽汁能激活肺炎鏈球菌的自溶酶，使菌體發(fā)生溶解。48微生物基本試驗原理和操作試劑：10%去氧膽酸鈉溶液或牛膽汁

49微生物基本試驗原理和操作平板法：10%去氧膽酸鈉溶液一接種環(huán)，加于血瓊脂平板的試驗菌落上，置于35孵育30分鐘，肺炎鏈球菌菌落消失為陽性。陰性者菌落仍存在。50微生物基本試驗原理和操作環(huán)腺苷酸（cAMP）試驗

原理：B群鏈球菌（無乳鏈球菌）能產(chǎn)生一種因子（cAMP因子），這種因子在綿羊血或牛血培養(yǎng)基上與金黃色葡萄球菌β-溶血素起協(xié)同作用，促進β-溶血素的活性。因此在兩種細菌的交界處溶血力增加，出現(xiàn)箭頭形溶血區(qū)。51微生物基本試驗原理和操作方法：首先在羊血平板上接種一長條金黃色葡萄球菌（藥敏質(zhì)控菌）再將被檢菌與金黃色葡萄球菌接種線垂直接種一短條，兩者不能相交，應(yīng)相距3mm左右，同時在被檢菌接種線對側(cè)，用同樣方法接種陰性和對照菌，35℃培養(yǎng)過夜，如放在CO2燭缸內(nèi)結(jié)果更為好看（金黃色葡萄球菌用ATCC25923為佳）。52微生物基本試驗原理和操作結(jié)果：在被檢菌接種線與金黃色葡萄球菌接種線處出現(xiàn)一個矢狀加強溶血區(qū)，為CAMP陽性。陰性無加強溶血區(qū)。

53微生物基本試驗原理和操作氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗

吲哚試驗

硫化氫試驗

苯丙氨酸脫氨酶試驗

氨基酸脫羧酶試驗（賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸）

脲酶試驗

明膠液化試驗

54微生物基本試驗原理和操作吲哚試驗原理：細菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚（靛基質(zhì)），經(jīng)與試劑中的對二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色。55微生物基本試驗原理和操作蛋白胨水培養(yǎng)基成分蛋白胨（或胰胨）10-20g氯化鈉5g蒸餾水1000ml56微生物基本試驗原理和操作

kovac氏試劑對二甲氨基苯甲醛10g純戊醇150ml純濃鹽酸50ml

先將試劑溶于醇中，緩慢加入鹽酸即成。

57微生物基本試驗原理和操作

方法：挑取純培養(yǎng)物接種蛋白胨水培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)1-2天，沿管壁徐徐加入kovac氏試劑0.5ml，使成兩層，觀察結(jié)果。58微生物基本試驗原理和操作結(jié)果：在兩者液面交界處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。59微生物基本試驗原理和操作硫化氫試驗

原理：細菌分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）和含硫化物生成硫化氫，硫化氫遇鉛或鐵離子生成黑色的硫化物。由此間接地檢測細菌是否產(chǎn)生硫化氫。

60微生物基本試驗原理和操作培養(yǎng)基：三糖鐵培養(yǎng)基或克氏雙糖鐵培養(yǎng)基

61微生物基本試驗原理和操作結(jié)果：培養(yǎng)基黑為陽性，無變化為陰性。

62微生物基本試驗原理和操作苯丙氨酸脫氨酶試驗

原理：細菌產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，能使苯丙氨酸脫去氨基生成苯丙酮酸，苯丙酮酸與鐵離子作用生成綠色絡(luò)合物。63微生物基本試驗原理和操作苯丙氨酸培養(yǎng)基成分

DL苯丙氨酸0.2g（L苯丙氨酸0.1g）

酵母浸膏0.3g

氯化鈉0.5g

磷酸氫二鈉0.1g

瓊脂1.2g

蒸餾水100ml64微生物基本試驗原理和操作試劑：10%三氯化鐵溶液：將10克三氯化鐵溶于100ml蒸餾水中即成。

65微生物基本試驗原理和操作方法：將待檢菌接種于培養(yǎng)基斜面上，35培養(yǎng)24小時，滴加三氯化鐵試劑，觀察結(jié)果。66微生物基本試驗原理和操作結(jié)果：培養(yǎng)基斜面上顯綠色為陽性，不變色為陰性。

67微生物基本試驗原理和操作氨基酸脫羧酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分

蛋白胨5g酵母浸膏3g葡萄糖1g6%溴甲酚紫灑精溶液1ml蒸餾水1000ml將上述成分溶于蒸餾水，然后加進所需氨基酸（賴氨酸，鳥氨酸、精氨酸），使其濃度為０.５％。對照管不加氨基酸。69微生物基本試驗原理和操作方法：取待檢菌接種于氨基酸脫羧培養(yǎng)基和對照管中，封滅菌液體石蠟，35培養(yǎng)24小時以上觀察結(jié)果。70微生物基本試驗原理和操作注意事項培養(yǎng)基pH應(yīng)偏酸，有利于酶的形成。加封液體石蠟造成厭氧環(huán)境，在厭氧環(huán)境下氨基酸脫羧生成的胺才穩(wěn)定，另外也可避免出現(xiàn)假陽性。

如對照管不變色則不能判斷結(jié)果。

71微生物基本試驗原理和操作

結(jié)果：接種待檢菌的測定的培養(yǎng)基是紫色，對照管是黃色為陽性；兩管均是黃色為陰性。72微生物基本試驗原理和操作脲酶試驗原理：某些細菌能產(chǎn)生脲酶。脲酶可分解尿素，尿素