DB50T 1407-2023 新城疫病毒免疫層析（膠體金）檢測技術(shù)規(guī)范

ICS65.020CCSB41DB50重 慶 市 地 方 標 準DB50/T1407—2023新城疫病毒免疫層析（膠體金）檢測技術(shù)規(guī)范2023-05-25發(fā)布 2023-08-25實施重慶市市場監(jiān)督管理局?發(fā)布DB50/T1407DB50/T1407—2023前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由重慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會提出、歸口并組織實施。本文件起草單位：重慶市動物疫病預(yù)防控制中心、重慶理工大學。I新城疫病毒免疫層析（膠體金）檢測技術(shù)規(guī)范范圍（膠體金本文件適用于檢測泄殖腔拭子、咽拭子、組織樣品、雞胚尿囊液及細胞培養(yǎng)液中的新城疫病毒。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T39707 醫(yī)療廢物處理處置污染控制標準SN/T2984 檢驗檢疫動物病原微生物實驗活動生物安全要求細則術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。檢測原理（NC膜（多克隆抗體捕（T線TBalb/C小鼠免疫球蛋白抗體結(jié)合，形成第二條結(jié)合線（質(zhì)控線，簡稱C線），若C線不顯示紅色，則檢測結(jié)果無效。膠體金試紙卡結(jié)構(gòu)如圖1所示：圖1 膠體金試紙卡結(jié)構(gòu)示意圖1設(shè)備與耗材（1000.3μm顆粒過濾效率≥99.999（最22000℃～＋40（0.001、玻璃勻漿器（5mL）、移液器、棉拭子、塑料滴管、離心管。材料膠體金試紙卡可制備或采用商品化產(chǎn)品。試紙卡制備方法見附錄A。應(yīng)室溫或冷藏保存。樣品稀釋液可配制或采用商品化的PBS試劑（pH7.2）。配制按如下配方：氯化鈉（NaCl）8g、氯化鉀（KCl）0.2g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.44g、（KH2PO4）0.241000pH至7.2，分裝，121℃、15min高壓滅菌。樣品前處理一般要求樣品前處理應(yīng)符合SN/T2984的規(guī)定。泄殖腔和咽拭子0.8mL～1.0mL2℃～8℃，12,000r/min10min，取上清液待檢。樣品24小時的，應(yīng)冷凍保存。組織樣品稱取組織塊0.5g，置于勻漿器中，加pH7.2PBS試劑1mL，研磨完全后取出組織勻漿液，置2℃～8℃，12,000r/min離心10min，取上清液待檢。雞胚尿囊液尿囊液樣品置2℃～8℃，12,000r/min離心2min，取上清液待檢。細胞培養(yǎng)液反復(fù)凍融32℃～8℃，12,000r/min2min，取上清液待檢。樣品檢測2～3滴（100μL～150μL）。25min～10min，觀察結(jié)果。結(jié)果判定陽性當試紙卡出現(xiàn)兩條紫紅色條帶（TC線），結(jié)果判為陽性，記為“＋”。陰性當試紙卡僅出現(xiàn)一條紫紅色條帶（C線），結(jié)果判為陰性，記為“－”。無效C線，不論是否出現(xiàn)T線，結(jié)果均判為無效。廢棄物處理GB/T39707的規(guī)定。3附 錄 A（資料性）新城疫病毒膠體金試紙卡的制備單克隆抗體制備利用雜交瘤技術(shù)，通過細胞融合，篩選制成特異性新城疫病毒（NDV）單克隆抗體。該抗體針對NDV血凝素，決定了試紙卡的特異性。多克隆抗體制備羊抗NDV抗體 用純化的NDV免疫山羊后，提取羊血清中的免疫球蛋白制成羊抗NDV抗體該抗體可與金標抗體——NDV抗原抗體復(fù)合物結(jié)合形成夾心抗原抗體復(fù)合物用于膠體金試紙卡硝酸纖維膜（NC膜）的捕獲線。羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗體用Balb/C小鼠的免疫球蛋白作為抗原，免疫山羊后，提Balb/C（NC膜的質(zhì)控線，可與金標抗體結(jié)合，以此檢驗試紙卡的有效性。金標抗體制備30nm膠體金顆粒，將NDV18μg/mL進行標記，1BSA膠體金結(jié)合墊制備將玻璃纖維膜浸泡于80mMNa2B4O7·10H2O，0.1％PVA，0.1％Tween?20，0.3％BSA的處理410～124～5h50mm寬度，即制成膠體金結(jié)合墊。膠體金樣品墊制備樣品墊浸泡于80mMNa2B4O7·10H2O，0.1％PVA，0.1％Tween?20，0.3％BSA的處理液中，在37℃的溫度下干燥2h后，切成40mm寬度，用于過濾樣品中的有形成分，同時保證NDV抗原不變性。樣品墊置于試紙卡的最前端，樣品孔的下端。試劑條板制備（NC膜NC膜噴樣NC（