流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理培訓課件

目錄1淋巴細胞的分類2淋巴細胞亞群檢測方法3淋巴細胞亞群檢測原理4淋巴細胞亞群的免疫功能5淋巴細胞亞群的臨床意義7/25/20231流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理T淋巴細胞細胞免疫B淋巴細胞體液免疫NK細胞固有免疫淋巴細胞的分類淋巴細胞占外周血白細胞總數(shù)的20%-40%7/25/20232流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理檢測方法采用流式細胞術(shù)（FCM）是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞(或生物學顆粒)的理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)7/25/20233流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理FCM檢測對象：單細胞懸液或生物顆粒；檢測參數(shù)：多參數(shù)；檢測特點：單細胞水平分析；檢測速度：高速，最高達上萬個細胞/秒；檢測結(jié)果：精度高、準確性好；可對目標細胞進行分選；7/25/20234流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理熒光抗體直接標記第一抗體熒光二抗間接標記免疫熒光染色主要有兩種方法。間接標記的方法難以進行多色標記，而且操作復雜，所以一般首選直接熒光染色檢測原理7/25/20235流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理常用熒光素<499nm藍色熒光（Blue）

500-549nm，綠色熒光（Green）550-584nm，黃色熒光（Yellow）

585-615nm，橙色熒光（Orange）616-700nm，紅色熒光（Red）

≥700nm，遠紅外熒光（Far-Red）7/25/20236流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理常用熒光素熒光素分子激發(fā)光波長（nm）發(fā)射光波長（nm）中文名FITC488525異硫氰酸熒光素PE488575藻紅蛋白PerCP490675多甲藻葉綠素蛋白APC633660別藻青蛋白PE-Cy5488670藻紅蛋白-花青素5PE-Cy7488755藻紅蛋白-花青素77/25/20237流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理免疫熒光染色FCM可檢測下列細胞成分：表面標記物胞漿標記物核內(nèi)標記物可溶性成分7/25/20238流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理聯(lián)合CD45的四色方案第一種是用CD45/CD3/CD4/CD8做四色標記，主要可以檢測T3細胞、T4細胞、T8細胞這三種不同的亞群CD45-FITCCD4-RD1CD8-ECDCD3-PC57/25/20239流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理聯(lián)合CD45的四色方案第二種是用CD45/CD3/CD19/CD16和（或）CD56做第二管的標記，用于檢測T3細胞、B細胞和NK細胞CD45-FITCCD56-RD1CD19-ECDCD3-PC57/25/202310流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理檢測目的相互協(xié)作共同參與123功能比例數(shù)量7/25/202311流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理T、B細胞相互作用7/25/202312流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理7/25/202313流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理主要檢測項目淋巴細胞總T細胞T4細胞T8細胞NK細胞B細胞7/25/202314流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理總T淋巴細胞CD3+T4細胞CD3+CD4+CD8-T8細胞CD3+CD8+CD4-B細胞CD3-CD19+NK細胞CD3-CD（16+56）+淋巴細胞的免疫標志7/25/202315流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理總T細胞增高提示體內(nèi)的T細胞免疫功能增強見于臨床某些自身免疫性疾病（如SLE）、重癥肌無力、慢性活動性肝炎、甲狀腺功能亢進、淋巴細胞性甲狀腺炎、器官移植排斥反應(yīng)、T細胞性白血病等7/25/202316流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理總T細胞降低提示體內(nèi)的T細胞免疫功能減弱見于某些白血病、應(yīng)用免疫抑制劑藥、放療過程中、先天性細胞免疫缺陷、艾滋病、多發(fā)性骨髓瘤、傳染性單核細胞增多癥，以及過勞等造成機體免疫功能處于相對較低的其他一些情況7/25/202317流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理7/25/202318流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理7/25/202319流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理T4細胞增高提示體內(nèi)存在細菌等病原微生物感染，主要見于臨床各種細菌性感染性疾病。器官移植發(fā)生排斥反應(yīng)支氣管哮喘SLE活動期某些免疫增強藥物的有效結(jié)果注意:晝夜變化（傍晚的峰值可為上午的兩倍）7/25/202320流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理T4細胞降低提示體內(nèi)存在病毒等病原微生物，主要見于臨床各種病毒感染性疾病，以HIV感染時減少最為明顯T4細胞減少也可見于γ免疫球蛋白缺乏癥、胸腺發(fā)育不良、嚴重聯(lián)合免疫缺陷病、嚴重創(chuàng)傷、大手術(shù)等7/25/202321流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理T8細胞主要功能：特異性直接殺傷靶細胞兩條途徑：一是分泌穿孔素、顆粒酶及淋巴毒素等直接殺傷靶細胞二是通過Fas/FasL途徑誘導細胞凋亡。7/25/202322流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理7/25/202323流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理殺傷特點：連續(xù)性殺傷特異性殺傷MHC限制性7/25/202324流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理T8細胞增高提示體內(nèi)存在病毒或胞內(nèi)寄生菌等病原微生物感染主要見于HIV、HBV、CMV、EB等病毒感染也可見于結(jié)核桿菌感染等7/25/202325流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理T8細胞降低移植排斥反應(yīng)可見于γ免疫球蛋白缺乏癥胸腺發(fā)育不良嚴重聯(lián)合免疫缺陷病糖尿病等7/25/202326流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理T4/T8細胞比值增高是T4淋巴細胞增高或T8淋巴細胞減少所致見于某些自身免疫性疾病，如SLE、多發(fā)性硬化、器官移植排斥反應(yīng)、自身免疫性溶血性貧血等7/25/202327流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理T4/T8細胞比值降低是T4細胞減少或T8細胞增高所致見于艾滋病、再生障礙性貧血、某些白血病、傳染性單核細胞增多癥、免疫缺陷綜合征、某些病毒感染、惡性腫瘤、結(jié)核病等一般來說，導致T4/T8比值倒置，以全身性、侵襲和破壞機體免疫系統(tǒng)的感染引起的倒置變化幅度最大臨床抗感染治療有效時，可以觀察T4/T8細胞比值的逐步恢復7/25/202328流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理T4/T8細胞比值臨床意義器官移植受者免疫功能監(jiān)測個體化免疫治療療效判斷受者需要的是一種恰當?shù)拿庖咭种疲瑢⒚庖吖δ芸刂圃谳^低的一個范圍內(nèi)。需要經(jīng)常性監(jiān)測受者的免疫功能，T4/T8細胞比值是非常好的一個監(jiān)測指標當受者T4/T8細胞比值出現(xiàn)小于0.2的情況時，必須立即停用免疫抑制藥，等待免疫功能的適當恢復7/25/202329流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理T4/T8細胞比值與腫瘤惡性腫瘤患者術(shù)前T4/T8細胞比值低，手術(shù)后比值恢復正常當發(fā)生癌轉(zhuǎn)移時,T3、T4細胞數(shù)明顯減少的同時T8細胞數(shù)明顯增多T4/T8比值明顯降低,提示惡性腫瘤患者晚期細胞免疫功能更低,預后更差7/25/202330流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理產(chǎn)生抗體提呈抗原③免疫調(diào)節(jié)

B細胞的功能7/25/202331流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理B細胞增高提示機體體液免疫功能被增強此時體內(nèi)高親和力抗體的產(chǎn)生也增加見于臨床各種細菌性感染B細胞增高也見于B細胞白血病7/25/202332流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理B細胞減少見于原發(fā)及繼發(fā)性免疫功能低下，臨床可出現(xiàn)反復發(fā)作的呼吸道及消化道感染見于嚴重病毒性感染、使用免疫抑制劑制藥等情況見于原發(fā)性B細胞缺陷?。ㄈ缧月?lián)無丙種球蛋白血癥）和重癥聯(lián)合免疫缺陷（T細胞同時缺如）體液免疫功能不良者則減少在生命垂危時可呈現(xiàn)極度減少

7/25/202333流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理自然殺傷細胞表面標記CD3-、CD56+、CD16+表面受體（1）殺傷細胞活化受體（KAR）結(jié)合靶細胞表面糖類配體，促使NK發(fā)揮殺傷作用。（2）殺傷細胞抑制受體（KIR）識別自身細胞表面MHC-I類分子，產(chǎn)生抑制信號無須致敏即直接殺傷靶細胞,抗感染與抗腫瘤,免疫調(diào)節(jié)7/25/202334流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理NK細胞作用及效應(yīng)機制

抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）天然細胞毒性

NK細胞介導的凋亡NK細胞產(chǎn)生的細胞因子NK細胞受體7/25/202335流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理

NK細胞通過ADCC作用殺傷病毒感染的靶細胞7/25/202336流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理NK細胞殺傷靶細胞電鏡圖7/25/202337流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理NK細胞NK細胞是機體抗某些病毒、細菌、寄生蟲、真菌感染的重要免疫因素，NK細胞異常在病毒感染時尤其突出。NK細胞減少見于薩科奇病毒、腦心肌炎病毒、流感病毒、EB病毒、HSV-Ⅰ型等感染。NK細胞也參與Ⅱ型超敏反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)，IL-2治療后外周血NK細胞數(shù)量增加。7/25/202338流式淋巴細胞亞群檢測技術(shù)原理NK細胞NK細胞與腫瘤性疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)一般而言，腫瘤患者NK細胞數(shù)量較正常人減少，且減少的程度與腫瘤病情的嚴重程度密切相關(guān)，病情好轉(zhuǎn)，NK細胞數(shù)量回升因此，NK細胞數(shù)量是腫瘤臨床病情判斷、療效監(jiān)測的指標。7/25/202339