燈盞花素對(duì)缺血再灌注大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡的影響

燈盞花素對(duì)缺血再灌注大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡的影響龔明玉1，張力2，杜超1，周曉慧1（1承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000；2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放療科，河北承德067000）［摘要］目的：研究燈盞花素(breviscapine)對(duì)在體大鼠缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：40只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血再灌注組（IR組），燈盞花素組。燈盞花素組大鼠于術(shù)前1周分別腹腔注射不同劑量的燈盞花素（25，50mg.kg-1.d-1），另2組給等量生理鹽水。以左冠狀動(dòng)脈前降支穿線結(jié)扎法制備心肌缺血模型，松開結(jié)扎線造成再灌注。采用Annexinv-PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞的凋亡情況；電鏡觀察各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：燈盞花素可明顯降低缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞的凋亡率（P＜0.05，P＜0.01），且較IR組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷程度減輕。結(jié)論：燈盞花素對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制心肌細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的?！娟P(guān)鍵詞】燈盞花素；細(xì)胞凋亡；心??；缺血再灌注；超微結(jié)構(gòu)EffectofBreviscapineAgainstMyocardialIschemiaReperfusiononMyocardialCellUltrastructureandApoptosisinRatsGONGMing-yu，ZHANGLi，DUChao，etal（1ChengdeMedicalCollege，HebeiChengde067000,China2DepartmentofRsdiationOncology,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,HebeiChengde067000,China）ABSTRACT:Objective:Toexploretheeffectandmechanismofbreviscapineagainstmyocardialischemiareperfusioninjuryinrats.Methods:40SDratsweredividedintoshamoperationgroup,ischemiareperfusiongroupandbreviscapinegrouprandomly.Ratsinbreviscapinegroupwereinjectedwithbreviscapine25、50mg.kg1.d-1respectivelypriortoischemiareperfusion.othertwogroupsweregivenNSinsteadofbreviscapineequallyataweekbeforetheoperation.Theischemiareperfusionheartmodelwasestablishedbyligatingtheleftanteriordescendingbranchofcoronaryartery.ApoptosisofmyocyteswasdetectedafteroperationinallgroupsbyflowcytometrywithAnnexinⅤ-EGFPandpropidiumiodiode(PI)staining.Theultrastructuralalterationswereobservedunderthetransmissionelectronmicroscopy.Results:breviscapinecoulddecreasetheoccurrencerateofmyocardialapoptosisduringischemiareperfusioninjuryobviously（P＜0.05，P＜0.01）;Thedegreeofinjuringonultrastructuresofmyocardialcellinbreviscapinegroupisratheralleviatedthaninischemiareperfusiongroup.Conclusion:breviscapinemayprotectmyocardialcellsduringischemiareperfusioninjuryandtheprotectivemechanismmaybeobtainedbyinhibitingmyocardialapoptosis.KEYWORDSbreviscapine;apoptosis;Cardiomyocyte;ischemiareperfusion;myocardiacultrastructures心肌缺血再灌注可導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡,凋亡在心肌細(xì)胞死亡中發(fā)揮了重要的作用[1-2]。細(xì)胞凋亡的多少?zèng)Q定著缺血再灌注心肌損傷的嚴(yán)重程度，有效抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，是促進(jìn)缺血再灌注后心功能恢復(fù)和減輕心肌致死性損傷的一條重要途徑。近年來研究發(fā)現(xiàn),在引發(fā)缺血之前使用藥物預(yù)處理可減少缺血再灌注損傷,縮小急性心肌缺血所致的梗塞面積[3],抑制缺血再灌注過程中心肌細(xì)胞凋亡和超微結(jié)構(gòu)損傷[4]。燈盞花素具有活血化瘀，抗血小板凝集等多種作用，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用，但它對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制尚不清楚。本研究旨在觀察缺血再灌注后大鼠心肌細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)和燈盞花素對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響及初步機(jī)制。1材料與方法1.1材料1.1.1試劑燈盞花素注射液（吉林龍?zhí)┲扑幑煞萦邢薰荆?，AnnexinⅤ-EGFP凋亡試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）。1.1.2動(dòng)物健康SD大鼠40只，體重（220+20）g，雌雄各半。（購自天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)scxk津2009-001）1.2方法1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理：40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：燈盞花素I組、燈盞花素II組、假手術(shù)組和缺血再灌注組，每組10只。燈盞花素2個(gè)組大鼠于手術(shù)前1周分別腹腔注射不同劑量的燈盞花素（25，50mg.kg-1.d-1），連用7d；假手術(shù)組和缺血再灌注組術(shù)前分別給予相應(yīng)容積的生理鹽水，時(shí)間同燈盞花素組。1.2.2心肌缺血再灌注模型的制備燈盞花素組和缺血再灌注組大鼠均心肌缺血再灌注模型，具體方法如下：10%烏拉坦腹腔注射麻醉（1ml/100g）大鼠，仰臥位固定，用針型電極插入大鼠四肢皮下記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖。于胸骨左緣3-4肋間切開胸壁，暴露心臟，在左心耳與肺動(dòng)脈干之間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，同時(shí)在結(jié)扎線與血管之間穿一直徑2mm，長5mm的硅膠管，結(jié)扎30min；然后剪斷縫合線，取出硅膠管，再灌注2h，以往已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)此缺血再灌注時(shí)間足以引起心肌細(xì)胞凋亡[5,~6]。假手術(shù)組僅分離前降支，但不結(jié)扎。1.2.3Annexinv/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測再灌注后取梗死區(qū)邊緣心肌組織5mm3，機(jī)械法制備單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾。取1ml細(xì)胞，1500r/min、4℃、離心5min，收集細(xì)胞。加入1ml\冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。將細(xì)胞重懸于500μlBindingBuffer，加入5μlAnnexinV-EGFP和5μlPropidiumIodide(PI)，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15min,上機(jī)檢測，自動(dòng)計(jì)算凋亡心肌細(xì)胞的百分比。結(jié)果判定：AnnexinⅤ-/PI-為正常細(xì)胞,AnnexinⅤ+/PI-為凋亡細(xì)胞,AnnexinⅤ+/PI+為壞死細(xì)胞。1.2.4電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完畢后，取缺血再灌注部位的心肌，常規(guī)電鏡樣品包埋,半薄切片，光鏡選區(qū)定位，超薄切片，鈾、鉛雙染，透射電鏡(JEOL100CX2Ⅱ)下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較用t2結(jié)果2.1流式細(xì)胞儀檢測Annexinv-EGFP標(biāo)記的心肌細(xì)胞凋亡情況缺血再灌注組與假手術(shù)組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01），燈盞花素組細(xì)胞凋亡率均明顯低于缺血再灌注組（P＜0.05，0.01），提示燈盞花素可抑制缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。（見附表及圖1-4）表1各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡情況（n=10，±S）組別給藥劑量（mg.kg-1.d-1）細(xì)胞凋亡率假手術(shù)組-5.45±1.21缺血再灌注組-19.80±2.74﹡燈盞花素I組2517.20±2.13▲燈盞花素II組5012.40±1.89▲▲與假手術(shù)組比較﹡P＜0.01；與缺血再灌注組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。2．2心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變2．2．1假手術(shù)組：心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化輕微，粗細(xì)肌絲清晰可見，肌小節(jié)一致，肌原纖維明暗帶清楚，線粒體結(jié)構(gòu)正常，嵴排列規(guī)則。（圖５）2．2．２缺血再灌注組：心肌細(xì)胞嚴(yán)重水腫，部分肌節(jié)周期性結(jié)構(gòu)破壞，肌絲斷裂、溶解，線粒體腫脹，嵴部分?jǐn)嗔?，染色質(zhì)濃縮邊集，呈新月體樣改變。（圖６）2．2．３燈盞花素組：較缺血再灌注組心肌纖維超微結(jié)構(gòu)損傷程度明顯減輕，多數(shù)心肌纖維仍腫脹，線粒體輕度腫脹，外膜完整，肌原纖維較規(guī)則。肌膜不平整，肌漿網(wǎng)輕度擴(kuò)張，凋亡細(xì)胞明顯減少。（圖７）３．討論近年來，盡管再灌注治療方法迅速發(fā)展，包括溶栓、PCI及GABG，但急性心肌梗死死亡率仍很高，再灌注損傷是主要原因之一。因此，減輕再灌注損傷具有重要的臨床意義。心肌缺血再灌注損傷可以產(chǎn)生4種類型的心功能障礙：心肌頓抑、無復(fù)流現(xiàn)象、再灌注心律失常和致死性再灌注損傷。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡參與心肌缺血再灌注損傷過程[7]。抑制心肌細(xì)胞凋亡能夠減少缺血再灌注后的心肌梗死體積幾乎達(dá)到50%～70%，改善心功能[8]。因此抗凋亡對(duì)防治心肌缺血再灌注損傷具有十分重要的意義。為了防治心肌缺血再灌注損傷，人們進(jìn)行了多方面的研究。研究證實(shí)，有些中藥可保護(hù)缺血再灌注心肌且毒副作用較小[9，10]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用燈盞花素使缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡減少，超微結(jié)構(gòu)減輕，得到了與上述研究一致的結(jié)果[11]。Kajstarn等[12]研究發(fā)現(xiàn)，梗塞后急速、大量的心肌細(xì)胞缺失是由壞死所致，而隨后心肌細(xì)胞的缺血性死亡則與凋亡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)IR組在缺血邊緣區(qū)由于存在側(cè)枝循環(huán)和終末端動(dòng)脈吻合，心肌缺血缺氧的情況較輕，心肌受到的損傷程度較小，但卻觸發(fā)了內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活途徑，出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮邊集，呈新月體樣改變的心肌細(xì)胞凋亡改變，與Kajstarn等研究結(jié)果一致。有研究表明[13-15]，氧化應(yīng)激、鈣反常、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等均參與了心肌缺血再灌注損傷，細(xì)胞凋亡是再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。燈盞花素是國內(nèi)臨床上治療心腦血管疾病的常用藥之一，它是從中藥燈盞花中分離得到的黃酮類化合物,現(xiàn)代藥理研究表明燈盞花具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、增強(qiáng)局部腦血流、抑制凝血因子Ⅳ活性、抑制蛋白激酶C移位激活、抗凋亡等作用[16-17]。本實(shí)驗(yàn)超微電鏡顯示燈盞花素使缺血中心區(qū)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕,心肌細(xì)胞肌原纖維排列較整齊,凋亡心肌細(xì)胞減少，流式細(xì)胞儀法顯示,心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于IR組。不同濃度燈盞花素對(duì)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷和心肌細(xì)胞凋亡均有明顯的抑制作用,且有隨濃度增高效果越顯著,但達(dá)到一定濃度后保護(hù)作用就不再明顯提高。證實(shí)燈盞花素對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過抑制心肌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。參考文獻(xiàn)：[1]KovacevicM,SimicO,JonjicN,etal.Apoptosisandcardiopulmonarybypass.JCardSurg,2007,22:129.[2]FreudeB,MastersTN,RobicsekF,etal.Apoptosisisinitiatedbymyocardialischemiaandexecutedduringreperfusion[J].JMolCellCardiol,2000,32(2):197.[3]姜淑芳,鞏曉興,苗中云.白藜蘆醇對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].解放軍保健醫(yī)學(xué)雜志,2007,9(1):34.[4]趙淑敏,孔祥玉,周健,等.黃芪預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用[J].中國臨床康復(fù),2005,9(24):256.[5]DaitokuH,HattaM,MatsuzakiH,etal.Differentialcontributionofnecrosisandapoptosisinmyocardialischemiareperfusioninjury.AmJPhysiolHeartCirPhysiol,2004,286（5）：H1923.[6]DasS,CordisGA,MaulikN,etal.Pharmacologicalpreconditioningwithresveratrol:aroleofCREB-dependentBCL-2signalingviaadenosineA3receptoractivation.AmJPhysiolHeartCirlPhysiol,2005,288(1)H328.[7]SarasteA,PulkkiK,KallajokiM,etal.Apoptosisinhumanacutemyocardialinfarction[J].Circulation,1997,95(2):320.[8]LeeP,SataM,LeferDJ,etal.FaspathwayisacriticalmediatorofcardiacmyocytedeathandMIduringischemia-reperfusioninvivo[J].AmJPhysiolHeartCricPhysiol,2003,284(2):H456.[9]賀運(yùn)河，古繼紅，陳光賢，等.益氣活血法對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2007,5(8):707.[10]張英，黃維義，林燕.姜黃素抗心肌缺血再灌注損傷作用及其機(jī)制研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(22):2736[11]RuixingY，Al-GhazaliR，WenwuL，etal.Pretreatmentwithprobucolattenuatescardiomyocyteapoptosisinarabbitmodelofischemia/reperfusion.ScandJClinLabInvest，2006，66(7):549.[12]KajsturaJ，ChengW，ReissK，etal.Apoptoticandnecroticmyocytecelldeathsareindependentcontributingvariablesofinfarctsizeinrats[J].LabInvest，1996，74(1):86.[13]KevinLG,NovalijaE，StoweDF.Reactiveoxygenspeciesasmediatorsofcardiacinjuryandprotection:therelevancetoanesthesiapractice[J].AnesthAnalg,2005，101(5):1275[14]張艷芳,張俊河,楊廷桐,等.白細(xì)胞介素1及白細(xì)胞介素8在心肌缺血再灌注損傷中的動(dòng)態(tài)演變及藥物干預(yù)效果[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2007，11(45):9083[15]YellonDM,HausenloyDJ.Myocardialreperfusioninjury[J].NEnglJMed