觀察-平滑肌肌動(dòng)蛋白在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No：30472268）作者簡介：謝敏，女，主治醫(yī)師，碩士學(xué)位，研究方向?yàn)槟I臟疾病現(xiàn)工作單位：成都市婦女兒童中心醫(yī)院兒童腎臟科觀察a-平滑肌肌動(dòng)蛋白在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織中的表達(dá)謝敏周建華朱國琴華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，武漢430030【摘要】目的觀察a-平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SMA）在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠中的表達(dá)情況，探討其與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系。方法采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)制備腎間質(zhì)纖維化模型,將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組，每組分別于術(shù)后7、14、21天各處死10只大鼠，取梗阻側(cè)腎組織行HE、Masson染色觀察腎間質(zhì)纖維化程度。行免疫組化方法檢測兩組大鼠不同時(shí)間段a-平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SMA）表達(dá)水平。結(jié)果假手術(shù)組中，腎小球、腎小管和間質(zhì)細(xì)胞均無α－SMA，與假手術(shù)相比，模型組手術(shù)后7天，腎間質(zhì)中α－SMA陽性細(xì)胞數(shù)增多，呈進(jìn)行性升高趨勢，其與腎間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)。結(jié)論a-平滑肌肌動(dòng)蛋白在腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用?！娟P(guān)鍵詞】α－SMA；腎間質(zhì)纖維化；單側(cè)輸尿管梗阻Theexpressionofα－SMAinUnilateralUreteralObstructicRatsXIEMin,ZHOUJian-hua,ZHUGuo-qin.DepartmentofPediatrics,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,ChinaCorrespondingAuthor:ZHOUJian-hua,E-mail:jhzhou@【ABSTRACT】ObjectiveToobservetheexpressionofα－SMAinunilateralureteralobstructic（UUO）rats.MethodsUUOwasinducedinSDratsbyligationoftheleftureter.SixtymaleSDratswererandomlydividedintosham-operatedgroup,andUUOgroup.10ratsineachgroupweresacrificedatday7,day14andday21afteUUOorSham-operation.TubulointerstitialfibrosiswasexaminedbyHE,Massonstaining,theexpressionofa-smoothmuscleactin（a-SMA）wasdetectedbyimmunohistochemicalmethod.ResultsInshamedgroup,therewasnoexpressionofa-SMAintubulointerstitialregion.Comparedwithsham-operatedgroup,theexpressionofa-SMAincreasedatday7,andincreasedcontinuallyinUUOmodelgroup.Itwasshowedthatthedegreeofrenalfibrosiswaspositivelycorrelatedwiththeexpressionofa-SMA.Conclusiona-SMAplayanimportantroleintheprogressoftubulointerstitialfibrosis.[keywords]α－SMA;Renalinterstitialfibrosis;Unilateralobstruction腎間質(zhì)纖維化(renalinterstitialfibrosis,RIF)幾乎是所有腎臟疾病的共同最終結(jié)局[1]，大量研究[2]證明,各種原因?qū)е碌穆阅I功能衰竭與腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)系較與腎小球損傷的關(guān)系更為密切。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，腎小管上皮/內(nèi)皮間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化、物理因素以及多種化學(xué)因子的共同作用，在誘導(dǎo)、促進(jìn)RIF過程中發(fā)揮重要作用[3]。本研究旨在觀察α－SMA在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠中的表達(dá)水平及與腎間質(zhì)纖維化程度的關(guān)系。1材料與方法1.1材料(1)動(dòng)物：普通級雄性SD大鼠，8周齡，體重180～200g（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）(2)試劑：小鼠抗大鼠α－SMA多克隆抗體、山羊抗小鼠IgG、SABC免疫組化試劑盒均購于武漢博士德公司，DAB顯色試劑盒購于華美公司。1.2方法1.2.1動(dòng)物分組及模型制備：雄性Sprague-Dawley普通級大鼠45只，體重180～200g（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），隨機(jī)分為2組：①假手術(shù)組（SHAM）：30只，大鼠開腹后不結(jié)扎輸尿管，縫合腹腔，作為對照組。②模型組（UUO）30只，大鼠以10％水合氯醛300mg.kg-1,腹腔注射，麻醉后，將大鼠右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪毛后常規(guī)消毒，行左側(cè)腹切口，分離左側(cè)輸尿管，用0#絲線結(jié)扎兩道，上一道結(jié)扎點(diǎn)位于左腎下極水平，然后結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸尿管，逐層縫合肌肉、皮膚層制作大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型（UUO）。各組術(shù)后分別于7、14、21天處死大鼠，每組平行處死10只。留取腎組織固定于10％中性甲醛緩沖液。常規(guī)石蠟包埋切片，經(jīng)HE+Masson染色證實(shí)UUO造模成功。1.2.2檢測方法腎臟組織病理學(xué)：HE﹑Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理改變，腎小管間質(zhì)損傷。采用盲法半定量評估腎小管間質(zhì)損傷評分：200倍光鏡下，每張切片至少觀察40個(gè)皮質(zhì)區(qū)視野，根據(jù)皮質(zhì)區(qū)腎間質(zhì)纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤、腎小管擴(kuò)張或萎縮判斷，將腎間質(zhì)纖維化程度分為6個(gè)級：0級：正常；1級：病變范圍<10％；2級：病變范圍10％～25％；3級：病變范圍26％～50％；4級：51％～75％；5級：病變范圍>75％[4]。免疫組化染色：α－SMA染色按照前述的免疫組化試劑盒操作步驟進(jìn)行操作，腎間質(zhì)α－SMA表達(dá)按以下方法評估：0分為腎間質(zhì)無α－SMA表達(dá)；1分為輕度表達(dá)，即表達(dá)α－SMA皮質(zhì)腎間質(zhì)不超過視野33％；2分為中度表達(dá)，即上述面積為33％～66％；3分為重度表達(dá)，上述面積超過67％；4分為極重度表達(dá)，即在重度表達(dá)基礎(chǔ)上，大片腎小管萎縮，被大片表達(dá)α－SMA組織代替。計(jì)算20個(gè)腎皮質(zhì)高倍視野(×200)分值、求和、取均值，得該動(dòng)物腎間質(zhì)α－SMA表達(dá)分值[5]。1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)以SPSS11.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用ANOVA檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1腎小管間質(zhì)病理改變假手術(shù)組腎小管及間質(zhì)均無明顯病變；UUO手術(shù)組，術(shù)后7天梗阻側(cè)腎臟即出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)輕度增寬，腎小管擴(kuò)張，以遠(yuǎn)端小管為明顯。術(shù)后7、14天腎間質(zhì)增寬明顯出現(xiàn)纖維化表現(xiàn)，間質(zhì)大量淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤；術(shù)后21天可見彌漫性炎性細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)廣泛出現(xiàn)纖維化改變。見表1，圖1圖1假手術(shù)組、模型組術(shù)后7,14,21d腎間質(zhì)纖維化程度（Masson染色×200）假手術(shù)組術(shù)后7d假手術(shù)組術(shù)后14d假手術(shù)組術(shù)后21d模型組術(shù)后7d模型組術(shù)后14d模型組術(shù)后21d表1：各組腎小管間質(zhì)纖維化程度、α-SMA表達(dá)指標(biāo)時(shí)間n假手術(shù)組模型組統(tǒng)計(jì)量P腎間質(zhì)纖維化評分術(shù)后7d100.2±0.451.4±0.5Z=1.98<0.05術(shù)后14d100.4±0.542.8±0.4Z=2.61<0.01術(shù)后21d100.6±0.553.4±1.1Z=2.51<0.01統(tǒng)計(jì)量--F=1.70F=9.04--P-->0.05<0.05--α-SMA術(shù)后7d100.2±0.441.2±0.83Z=1.77>0.05術(shù)后14d100.2±0.442.4±0.54Z=2.61<0.01術(shù)后21d100.2±0.443.8±0.44Z=2.61<0.01統(tǒng)計(jì)量--H=0.38H=10.64--P-->0.05P<0.01--2.2α－SMA免疫組化結(jié)果假手術(shù)組中，腎小球、腎小管和間質(zhì)細(xì)胞均無α－SMA，UUO手術(shù)后7天，腎間質(zhì)中α－SMA陽性細(xì)胞數(shù)增多，可見少許腎小管細(xì)胞有α－SMA表達(dá)；術(shù)后14天，較多腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α－SMA；術(shù)后21天，腎間質(zhì)出現(xiàn)大量表達(dá)α－SMA的細(xì)胞，腎小管破壞區(qū)域也可見大量腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α－SMA。見表1，圖2圖2假手術(shù)組、模型組術(shù)后7,14,21dα－SMA表達(dá)（免疫組化×200）假手術(shù)組術(shù)后7d假手術(shù)組術(shù)后14d假手術(shù)組術(shù)后21d模型組術(shù)后7d模型組術(shù)后14d模型組術(shù)后21d2.3腎小管間質(zhì)纖維化與α－SMA表達(dá)的相關(guān)性分析腎小管間質(zhì)纖維化與α－SMA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.83,P<0.01）。3討論慢性腎臟疾病其過程不可逆轉(zhuǎn)，必然進(jìn)展到終末期腎衰竭,大多數(shù)病人需要進(jìn)行透析及腎移植來維持生命[6]。慢性腎臟病的主要特點(diǎn)是進(jìn)行性腎功能不全和廣泛的腎間質(zhì)纖維化。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，致纖維化信號（如TGF-β﹑CTGF﹑PDGF等）傳遞，大量促纖維化因子和血管活性物質(zhì)釋放，間質(zhì)內(nèi)原有的和新合成的基質(zhì)蛋白開始沉積基質(zhì)蛋白合成增加降解減少，最終導(dǎo)致腎臟損害[7]。許多研究已證明，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞是纖維形成的主要效應(yīng)細(xì)胞，在增加ECM成分合成中發(fā)揮重要作用[8]。成纖維細(xì)胞增殖活化是纖維化形成的關(guān)鍵步驟，活化的成纖維細(xì)胞發(fā)生功能和表型改變，轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)-SMA的肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast,MFB），這種轉(zhuǎn)變在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生中具有重要的意義[9]。α-SMA是細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白,現(xiàn)主要用于檢測腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化[10]。α-SMA表達(dá)增高表明細(xì)胞由靜止表型轉(zhuǎn)化為增殖表型,正常腎臟中僅有血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)α-SMA,腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α-SMA標(biāo)志著腎小管上皮細(xì)胞具有肌成纖維細(xì)胞特性,分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM),參與腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)程[11]。本實(shí)驗(yàn)采用UUO方法建立大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，觀察了梗阻過程中大鼠腎間質(zhì)的病理變化。UUO的特點(diǎn)是進(jìn)行性小管萎縮及間質(zhì)纖維化。我們觀察到假手術(shù)組各時(shí)期腎小管及間質(zhì)均無明顯病變，腎小球、腎小管和間質(zhì)細(xì)胞均無α－SMA。UUO模型組，術(shù)后7天梗阻側(cè)腎臟即出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)輕度增寬，腎小管擴(kuò)張，以遠(yuǎn)端小管為明顯，此時(shí)少許腎小管細(xì)胞有α－SMA表達(dá)。隨梗阻時(shí)間延長，腎間質(zhì)大量淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)區(qū)明顯增寬逐漸出現(xiàn)纖維化表現(xiàn)，同時(shí)較多腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α－SMA。術(shù)后21天腎間質(zhì)廣泛出現(xiàn)纖維化改變，腎間質(zhì)出現(xiàn)大量表達(dá)α－SMA的細(xì)胞，腎小管破壞區(qū)域也可見大量腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α－SMA。腎小管間質(zhì)纖維化與α－SMA表達(dá)的相關(guān)性分析顯示腎小管間質(zhì)纖維化程度與α－SMA表達(dá)呈正相關(guān)。本研究證實(shí)，腎小管上皮細(xì)胞可轉(zhuǎn)分化為MFB，且在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與進(jìn)展中其重要作用，小管間質(zhì)MFB標(biāo)志性抗原-SMA的表達(dá)多少與腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展呈顯著正相關(guān)。如果能在早期干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為MFB，將為腎間質(zhì)纖維化的治療提供新靶點(diǎn)。參考文獻(xiàn)EddyAA.Molecularbasisofrenalfibrosis.PediatrNephrol,2000,15:290~301zhangM,FraserD,PhillipsA.ERK,P38,andSmadsignalingpathwaysdifferentiallyregulatetransforminggrowthfactor-beta1autoinductioninproximaltubularepithelialcells.AmJPathol,2006,169(4):1282.Kostadinova-KunovskaS,JovanovicR,JanevskaV,etal.Morphologyofrenalinterstitialfibroblasts.Prilozi.2012Jul;33(1):15-25.CataniaJM,ChenG,arrishAR.Roleofmatrixmetalloproteinasesinrenalpathophysiologies[J].AmJPhysiol,2007,292(3):F905-F911.ParkSH,ChoiMJ,SongIK,ChoiSY,MakniK,JarrayaF,KhabirA,etal.Renalalpha-smoothmuscleactin:anewprognosticfactorforlupusnephritis[J].Nephrology.2009Aug;14(5):499-505.MaYY,SunD,YinZC,etal.Transplantationofendothelialprogenitorcellsalleviatesrenalinterstitial