分子生物學(xué)常用技術(shù)精選課件

分子生物學(xué)常用技術(shù)第十七章分子生物學(xué)常用技術(shù)第十七章分子生物學(xué)常用技術(shù)凝膠電泳分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)DNA的物理圖譜DNA序列測(cè)定基因芯片2ppt精選版分子生物學(xué)常用技術(shù)凝膠電泳2ppt精選版第一節(jié)凝膠電泳

(gelelectrophoresis)電泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:遷移率Q:電荷量r:粒子半徑（分子量）η:介質(zhì)粘度

3ppt精選版第一節(jié)凝膠電泳

(gelelectrophoresis)電泳的用途分離鑒定純度測(cè)定分子量凝膠電泳的種類(lèi)瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳

4ppt精選版電泳的用途4ppt精選版一、瓊脂糖凝膠電泳

(agarosegelelectrophoresis)

分離核酸原理操作要點(diǎn)應(yīng)用范圍5ppt精選版一、瓊脂糖凝膠電泳

(agarosegelelectro（一）分離核酸原理

電荷效應(yīng)

分子篩效應(yīng)

分子構(gòu)象6ppt精選版（一）分離核酸原理電荷效應(yīng)6ppt精選版1.電荷效應(yīng)核酸是兩性電解質(zhì)

pH=3.5,正電荷pH=8.0~8.3,負(fù)電荷，正極7ppt精選版1.電荷效應(yīng)核酸是兩性電解質(zhì)7ppt精選版8ppt精選版8ppt精選版2.分子篩效應(yīng)小分子移動(dòng)快，大分子移動(dòng)慢9ppt精選版2.分子篩效應(yīng)小分子移動(dòng)快，大分子移動(dòng)慢9ppt精選版3.分子構(gòu)象閉環(huán)超螺旋>線狀DNA>開(kāi)環(huán)DNA+-10ppt精選版3.分子構(gòu)象閉環(huán)超螺旋>線狀DNA>開(kāi)環(huán)DNA+-10p（二）操作要點(diǎn)支持物凝膠濃度的選擇

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)電泳緩沖液樣品制備電泳條件

DNA電泳染色

DNA片段的回收11ppt精選版（二）操作要點(diǎn)支持物11ppt精選版1.支持物12ppt精選版1.支持物12ppt精選版商品化的瓊脂糖13ppt精選版商品化的瓊脂糖13ppt精選版瓊脂糖種類(lèi)普通低熔點(diǎn)高純高篩分熔點(diǎn)80~90℃<70℃80~90℃80~90℃機(jī)械強(qiáng)度中差高高分辨率中差中高14ppt精選版瓊脂糖種類(lèi)普通低熔點(diǎn)高純高篩分熔點(diǎn)80~90℃<70℃80~2.凝膠濃度的選擇15ppt精選版2.凝膠濃度的選擇15ppt精選版凝膠的制備16ppt精選版凝膠的制備16ppt精選版17ppt精選版17ppt精選版18ppt精選版18ppt精選版3.DNAmarker19ppt精選版3.DNAmarker19ppt精選版DNAmarker20ppt精選版DNAmarker20ppt精選版DNA長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線21ppt精選版DNA長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線21ppt精選版4.電泳緩沖液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.022ppt精選版4.電泳緩沖液Tris-乙酸(TAE)pH8.0225.樣品制備上樣緩沖液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚藍(lán)/二甲苯青

23ppt精選版5.樣品制備上樣緩沖液23ppt精選版點(diǎn)樣24ppt精選版點(diǎn)樣24ppt精選版6.電泳條件潛水電泳恒壓電泳低壓:1~2V/cm

中壓:8~10V/cm

高壓電泳：>幾十V/cm溫度：15~25℃25ppt精選版6.電泳條件潛水電泳25ppt精選版潛水電泳26ppt精選版潛水電泳26ppt精選版7.電泳染色溴乙錠(ethidiumbromide,EB)

結(jié)構(gòu)及染色原理染色方法加入凝膠液中

電泳結(jié)束后染色27ppt精選版7.電泳染色溴乙錠(ethidiumbromide,EEB染色原理28ppt精選版EB染色原理28ppt精選版29ppt精選版29ppt精選版紫外燈下顯色30ppt精選版紫外燈下顯色30ppt精選版8.DNA片段的回收低熔點(diǎn)瓊脂糖法

透析袋電洗脫法(>5kb)DEAE-纖維素膜法(0.5~5kb)31ppt精選版8.DNA片段的回收低熔點(diǎn)瓊脂糖法31ppt精選版（三）應(yīng)用范圍

DNA的分離、純化和鑒定限制性酶切圖譜分析重組體的分離、鑒定雜交分析

PCR產(chǎn)物的分離鑒定32ppt精選版（三）應(yīng)用范圍DNA的分離、純化和鑒定32ppt精選版瓊脂糖凝膠電泳33ppt精選版瓊脂糖凝膠電泳33ppt精選版二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

分離原理操作要點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用范圍34ppt精選版二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegel（一）分離原理電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)35ppt精選版（一）分離原理電荷效應(yīng)35ppt精選版PAGE支持物單體－丙烯酰胺(Acr)

交聯(lián)劑－甲叉雙丙烯酰胺(Bis)

催化劑－過(guò)硫酸胺(AP)

加速劑－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)36ppt精選版PAGE支持物單體－丙烯酰胺(Acr)36ppt精選版聚丙烯酰胺凝膠37ppt精選版聚丙烯酰胺凝膠37ppt精選版（二）操作要點(diǎn)凝膠的分類(lèi)凝膠濃度的選擇凝膠液的配制凝膠中DNA的檢測(cè)DNA片段的回收38ppt精選版（二）操作要點(diǎn)凝膠的分類(lèi)38ppt精選版1.凝膠的分類(lèi)非變性凝膠：dsDNA變性凝膠:ssDNA尿素甲酰胺SDS39ppt精選版1.凝膠的分類(lèi)非變性凝膠：dsDNA39ppt精選版2.凝膠濃度的選擇40ppt精選版2.凝膠濃度的選擇40ppt精選版41ppt精選版41ppt精選版3.凝膠液的配制

試劑(ml)制備濃度(%)3.55.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml42ppt精選版3.凝膠液的配制試劑制備濃度(%)3.55.0PAGE裝置43ppt精選版PAGE裝置43ppt精選版44ppt精選版44ppt精選版45ppt精選版45ppt精選版46ppt精選版46ppt精選版電泳47ppt精選版電泳47ppt精選版4.凝膠中DNA的檢測(cè)溴乙錠染色法

銀鹽染色法甲醛還原放射自顯影法Ag+－DNA

Ag（黑褐色）

48ppt精選版4.凝膠中DNA的檢測(cè)溴乙錠染色法Ag+－DNAAg（5.DNA片段的回收壓碎浸泡法<1kb

純度高，回收率低49ppt精選版5.DNA片段的回收壓碎浸泡法49ppt精選版（三）PAGE優(yōu)點(diǎn)機(jī)械強(qiáng)度好、化學(xué)穩(wěn)定性高分辨率高載樣量大回收的DNA純度高

50ppt精選版（三）PAGE優(yōu)點(diǎn)機(jī)械強(qiáng)度好、化學(xué)穩(wěn)定性高50ppt精選版（四）PAGE應(yīng)用范圍分離、純化和鑒定RNA和小分子DNA

DNA序列分析

PCR產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)的檢測(cè)和分析51ppt精選版（四）PAGE應(yīng)用范圍分離、純化和鑒定RNA和小分子DNA第二節(jié)分子雜交

分子雜交的基本原理固相支持物探針幾種常用雜交技術(shù)52ppt精選版第二節(jié)分子雜交

分子雜交的基本原理52ppt精選版一、分子雜交的基本原理核酸的變性和復(fù)性53ppt精選版一、分子雜交的基本原理核酸的變性和復(fù)性53ppt精選版分子雜交DNA-DNA54ppt精選版分DNA-DNA54ppt精選版DNA-RNA55ppt精選版DNA-RNA55ppt精選版雜交條件靶分子探針雜交袋雜交爐56ppt精選版雜交條件靶分子56ppt精選版雜交種類(lèi)被檢核酸種類(lèi)和方法原位雜交斑點(diǎn)雜交Southern雜交Northern雜交Western雜交反應(yīng)介質(zhì)液相雜交固相雜交()57ppt精選版雜交種類(lèi)被檢核酸種類(lèi)和方法57ppt精選版二、固相支持物固相支持物的特性結(jié)合能力強(qiáng)不影響雜交反應(yīng)結(jié)合牢固非特異性吸附少機(jī)械性能良好

58ppt精選版二、固相支持物固相支持物的特性58ppt精選版固相支持物的種類(lèi)硝酸纖維素濾膜(nitrocellulosefiltermembrane)

尼龍膜(nylonmembrane)59ppt精選版固相支持物的種類(lèi)硝酸纖維素濾膜59ppt精選版1.硝酸纖維素濾膜

特點(diǎn)吸附ssDNA和RNA雜交信號(hào)本底低不足不適于重復(fù)雜交濾膜較脆不適于電轉(zhuǎn)移印跡法對(duì)DNA小片段(<200bp)結(jié)合能力弱60ppt精選版1.硝酸纖維素濾膜特點(diǎn)60ppt精選版2.尼龍膜特點(diǎn)結(jié)合能力強(qiáng)

可反復(fù)雜交

韌性強(qiáng)

適于電轉(zhuǎn)移印跡法對(duì)DNA小片段(10bp)結(jié)合能力強(qiáng)不足雜交信號(hào)本底較高

61ppt精選版2.尼龍膜特點(diǎn)61ppt精選版分子生物學(xué)考試時(shí)間：2005.1.11(晚7:00-9:00)地點(diǎn)9教講演廳(150人)9-2-1(50人)9-2-2(50人)9-3-1(50人)答疑：1.10(9:00-11:30;3:00-5:30)地點(diǎn)：逸夫樓3樓生化實(shí)驗(yàn)室62ppt精選版分子生物學(xué)考試時(shí)間：2005.1.11(晚7:00-9:0三、探針(probe)探針的概念探針的類(lèi)型

標(biāo)記物的種類(lèi)標(biāo)記方法63ppt精選版三、探針(probe)探針的概念63ppt精選版1.探針的概念特異結(jié)合和檢測(cè)靶分子的活性物質(zhì)抗原－抗體配體－受體同源DNA/RNA64ppt精選版1.探針的概念特異結(jié)合和檢測(cè)靶分子的活性物質(zhì)64ppt精選2.探針的類(lèi)型基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針蛋白質(zhì)或多肽探針65ppt精選版2.探針的類(lèi)型基因組DNA探針65ppt精選版3.標(biāo)記物的種類(lèi)放射性同位素(32P,3H,35S,125I,14C)

非放射性標(biāo)記物生物素地高辛熒光素酶

66ppt精選版3.標(biāo)記物的種類(lèi)放射性同位素(32P,3H,35S,4.核酸探針的放射性標(biāo)記方法

DNA缺口平移標(biāo)記法隨機(jī)引物標(biāo)記法

DNA的5’末端標(biāo)記

67ppt精選版4.核酸探針的放射性標(biāo)記方法

DNA缺口平移標(biāo)記法67缺口翻譯特點(diǎn)均一標(biāo)記制備dsDNA探針68ppt精選版缺口翻譯特點(diǎn)68ppt精選版隨機(jī)引物標(biāo)記法(randompriming)

隨機(jī)引物6nt含有各種可能的排列順序特點(diǎn)放射比活性>缺口翻譯操作簡(jiǎn)便DNA/cDNA探針69ppt精選版隨機(jī)引物標(biāo)記法(randompriming)隨機(jī)引物6970ppt精選版70ppt精選版DNA的5’末端標(biāo)記(5’endlabeling)

堿性磷酸酶＋T4多核苷酸激酶標(biāo)記原理制備寡核苷酸探針制備短的DNA/RNA探針

71ppt精選版DNA的5’末端標(biāo)記(5’endlabeling)

堿性DNA的5’末端標(biāo)記72ppt精選版DNA的5’末端標(biāo)記72ppt精選版四、Southern雜交Southernblotting/DNAblotting1975年，EdwenSouthern等印跡(blotting):轉(zhuǎn)移

blot:aspotormark,esp.ofink

blotting73ppt精選版四、Southern雜交Southernblotting1.印跡的方法

毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法

電轉(zhuǎn)移法

真空轉(zhuǎn)移法

74ppt精選版1.印跡的方法毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法74ppt精選版毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法75ppt精選版毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法75ppt精選版電轉(zhuǎn)移法76ppt精選版電轉(zhuǎn)移法76ppt精選版真空轉(zhuǎn)移法77ppt精選版真空轉(zhuǎn)移法77ppt精選版78ppt精選版78ppt精選版2.Southern雜交的步驟79ppt精選版2.Southern雜交的步驟79ppt精選版3.Southern雜交的應(yīng)用基因的定性及定量分析基因的酶切圖譜分析基因突變分析RFLP80ppt精選版3.Southern雜交的應(yīng)用基因的定性及定量分析80p五、Northern雜交

RNAblotting

步驟

總RNA/mRNA→變性電泳分離→轉(zhuǎn)移→雜交→放射自顯影/化學(xué)顯色

應(yīng)用檢測(cè)組織/細(xì)胞中mRNA的大小、量比較不同組織/細(xì)胞中基因的表達(dá)情況

81ppt精選版五、Northern雜交RNAblotting81ppNorthern雜交82ppt精選版Northern雜交82ppt精選版六、Western雜交免疫印跡(immunoblotting)

SDS→轉(zhuǎn)移→蛋白－第一抗體→標(biāo)記的第二抗體(探針)→檢測(cè)

應(yīng)用蛋白質(zhì)的定性定量分析83ppt精選版六、Western雜交免疫印跡(immunoblottin84ppt精選版84ppt精選版免疫印跡85ppt精選版免疫印跡85ppt精選版

Southern,Northern&Western

待測(cè)物質(zhì)

支持物

探針

轉(zhuǎn)移方式Southern

DNANC單鏈核酸

毛細(xì)管/電/真空

Northern

RNANC/尼龍單鏈核酸

毛細(xì)管/電/真空

Western

蛋白質(zhì)NC/PVDF

抗體電轉(zhuǎn)移

86ppt精選版Southern,Northern&Wes七、原位雜交

(insituhybridization)定義種類(lèi)細(xì)胞內(nèi)原位雜交組織切片原位雜交

基本程序細(xì)胞/組織固定預(yù)雜交雜交沖洗雜交信號(hào)檢測(cè)分析結(jié)果

87ppt精選版七、原位雜交

(insituhybridization)組織切片88ppt精選版組織切片88ppt精選版89ppt精選版89ppt精選版八、斑點(diǎn)雜交

(dothybridization)

90ppt精選版八、斑點(diǎn)雜交

(dothybridization)

90p第三節(jié)PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)PCR的發(fā)展簡(jiǎn)史PCR的基本原理和步驟PCR的影響因素PCR的種類(lèi)PCR的應(yīng)用91ppt精選版第三節(jié)PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)91ppt精選版一、PCR的發(fā)展簡(jiǎn)史1971年,Korana提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想1985年,Mullis等發(fā)明了PCR技術(shù)1988年,PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR儀

92ppt精選版一、PCR的發(fā)展簡(jiǎn)史1971年,Korana提出核酸體外擴(kuò)二、PCR的基本原理和步驟基本原理－DNA復(fù)制三個(gè)步驟變性(denaturation)退火(annealing)延伸(extension)93ppt精選版二、PCR的基本原理和步驟基本原理－DNA復(fù)制93ppt精PCR的原理94ppt精選版PCR的原理94ppt精選版PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物cycle12345n長(zhǎng)片段

246810短片段

002822長(zhǎng)＋短

21222324252n95ppt精選版PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物cycle12345n長(zhǎng)片段246810標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10X擴(kuò)增緩沖液：10ul模板DNA:0.1~2ug

引物：各0.2~1umol/L4種dNTP:各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5U總體積：100ul96ppt精選版標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10X擴(kuò)增緩沖液：10ul9697ppt精選版97ppt精選版三、PCR的影響因素

模板引物

TaqDNA聚合酶

4種dNTP

Mg2+循環(huán)條件

98ppt精選版三、PCR的影響因素

模板98ppt精選版模板

DNARNAcDNA對(duì)模板的純度要求低99ppt精選版模板DNA99ppt精選版引物長(zhǎng)度：15～30ntG+C含量：40~60%堿基的隨機(jī)分布避免引物自身和引物之間的互補(bǔ)引物的3’端引物的5’端引物濃度：0.2~1umol/L100ppt精選版引物長(zhǎng)度：15～30nt100ppt精選版TaqDNA聚合酶

2.5U/100ul－20℃保存最后加

101ppt精選版TaqDNA聚合酶2.5U/100ul101ppt精底物4種dNTP的濃度相等終濃度：200umol/L102ppt精選版底物4種dNTP的濃度相等102ppt精選版Mg2+

濃度:1.5～2.0mmol/L過(guò)高:非特異擴(kuò)增

過(guò)低:反應(yīng)產(chǎn)物減少103ppt精選版Mg2+濃度:1.5～2.0mmol/L103ppt精循環(huán)條件變性溫度和時(shí)間:90~96℃,30~60s退火溫度和時(shí)間:40~60℃,30~60sTm=4(G+C)+2(A+T)

延伸溫度和時(shí)間70～75℃(72℃)<1kb,1min;3～4kb,3～4min;10kb,15min循環(huán)次數(shù):25～35

104ppt精選版循環(huán)條件變性溫度和時(shí)間:90~96℃,30~60s10四、PCR的種類(lèi)反轉(zhuǎn)錄PCR原位PCR(insituPCR)實(shí)時(shí)PCR(realtimePCR)重組PCR(recombinantPCR)錨定PCR(anchoredPCR)反向PCR(inversePCR)105ppt精選版四、PCR的種類(lèi)反轉(zhuǎn)錄PCR105ppt精選版原位PCR原位雜交＋PCR程序固定細(xì)胞/組織樣品→PCR前處理→PCR擴(kuò)增→原位雜交及檢測(cè)

106ppt精選版原位PCR原位雜交＋PCR106ppt精選版實(shí)時(shí)PCR的原理107ppt精選版實(shí)時(shí)PCR的原理107ppt精選版五、PCR的應(yīng)用分子生物學(xué)研究臨床醫(yī)學(xué)108ppt精選版五、PCR的應(yīng)用分子生物學(xué)研究108ppt精選版分子生物學(xué)研究基因克隆

DNA序列測(cè)定基因的體外定點(diǎn)突變

突變分析(PCR-SSCP)

基因定量

109ppt精選版分子生物學(xué)研究基因克隆109ppt精選版臨床醫(yī)學(xué)病原體診斷

遺傳病的基因診斷

腫瘤檢測(cè)

法醫(yī)學(xué)

110ppt精選版臨床醫(yī)學(xué)病原體診斷110ppt精選版第四節(jié)DNA序列測(cè)定

Sanger雙脫氧鏈終止法(1977)

Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法(1977)111ppt精選版第四節(jié)DNA序列測(cè)定Sanger雙脫氧鏈終止法(197Sanger雙脫氧鏈終止法原理－DNA復(fù)制

反應(yīng)條件模板引物

dNTP（其中一種帶放射性標(biāo)記）

ddNTP

DNA聚合酶112ppt精選版Sanger雙脫氧鏈終止法原理－DNA復(fù)制112pptDNA的復(fù)制113ppt精選版DNA的復(fù)制113ppt精選版2’,3’-雙脫氧核苷酸(ddNTP)114ppt精選版2’,3’-雙脫氧核苷酸(ddNTP)114ppt精選版115ppt精選版115ppt精選版116ppt精選版