DNA提取與鑒定課件

實驗指導(dǎo)老師劉曉穎張萍萍陳彥王劍峰李紹飛

2012-02生物化學(xué)大實驗實驗指導(dǎo)老師生物化學(xué)大實驗1生物化學(xué)大實驗實驗一：動物基因組的制備及其鑒定1實驗二：動物基因組的制備及其鑒定2實驗三：動物基因組的制備及其鑒定3實驗四：糖類化合物的提取及TLC分析1實驗五：糖類化合物的提取及TLC分析2實驗六：Sephadex-G50層析法分離蛋白質(zhì)實驗七：SDS測定蛋白質(zhì)分子量實驗八：聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)的等電點生物化學(xué)大實驗實驗一：動物基因組的制備及其鑒定12生物化學(xué)大實驗實驗一：動物基因組的制備及其鑒定1實驗二：動物基因組的制備及其鑒定2實驗三：動物基因組的制備及其鑒定3實驗四：糖的分離鑒定—硅膠G薄層層析實驗五：Sephadex-G50層析法分離蛋白質(zhì)實驗六：蛋白質(zhì)的FPLC分離與定量測定生物化學(xué)大實驗實驗一：動物基因組的制備及其鑒定13實驗要求（1）實驗前要預(yù)習(xí)相關(guān)的內(nèi)容，弄懂原理，了解實驗的設(shè)計思路，找出實驗操作的關(guān)鍵步驟，試劑的配制方法及用量，數(shù)據(jù)處理的方法等。（2）實驗過程中，要認(rèn)真，規(guī)范的操作。學(xué)會安排實驗時間和實驗順序。如實記錄實驗中出現(xiàn)的現(xiàn)象和數(shù)據(jù)。（3）使用儀器時要按照說明書去做。發(fā)現(xiàn)故障應(yīng)停止使用。節(jié)約試劑。公用試劑用完后，要及時放回原處。（4）實驗報告要及時完成。報告上要注明實驗日期及溫度。在報告的結(jié)果討中，對實驗現(xiàn)象，結(jié)果和數(shù)據(jù)等可進行分析；也可對實驗中遇到的問題及實驗中需要改進的地方進行討論。（5）一般試劑都應(yīng)用蒸餾水或無離子水(即離子交換水)配制，有特殊要求的除外。（6）試劑(特別是液體)一經(jīng)取出，不得放回原瓶，以免因量器或藥勺不清潔而沾污整瓶試劑。取固體試劑時，必須使用潔凈干燥的藥勺。（7）使用易燃、易爆、有腐蝕性甚至有毒的化學(xué)藥品時應(yīng)注意安全，必要時應(yīng)戴手套，帶口罩或防毒面罩，并在通風(fēng)櫥中進行。（8）實驗紀(jì)律：不遲到和缺席。實驗室的衛(wèi)生要輪流值日。實驗要求（1）實驗前要預(yù)習(xí)相關(guān)的內(nèi)容，弄懂原理，了解實驗的設(shè)4成績評定平時成績：考勤實驗技能測試和實驗報告等70～60%期末理論考試：30～40%成績評定5動物組織ＤＮＡ的提取與鑒定劉曉穎張萍萍動物組織ＤＮＡ的提取與鑒定劉曉穎張萍萍6分離純化核酸原則與要求1.應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性完整的一級結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求)

2.排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染

純化的核酸樣品不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑或過高濃度的金屬離子，蛋白質(zhì)、脂類、多糖分子的污染應(yīng)降低到最低程度；無其他核酸分子的污染，例如提取DNA分子時，應(yīng)去除RNA分子3.減少化學(xué)因素對核酸的降解

避免過堿、過酸對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4～10條件下進行分離純化核酸原則與要求1.應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性74.減少物理因素對核酸的降解

強烈振蕩、攪拌，將細(xì)胞突置于低滲液中，細(xì)胞裂解、反復(fù)凍貯等造成的機械剪切力以及高溫煮沸等條件都能明顯破壞大分子量的線性DNA分子．對于分子量小的環(huán)狀質(zhì)粒DNA及RNA分子，威脅相對小一些。5.防止核酸的生物降解

細(xì)胞內(nèi)、外各種核酸酶作用于磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結(jié)構(gòu)。DNA酶需要Mg2+，Ca2+的激活，因此實驗中常利用金屬二價離子螯合劑EDTA，檸檬酸鹽，可基本抑制DNA酶的活性

RNA酶不但分布廣泛，極易污染，而且耐高溫、耐酸堿，不易失去活性，所以生物降解是RNA提取過程的主要危害因素。進行核酸分離時最好用新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬上進行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮或一70℃的冰箱中。4.減少物理因素對核酸的降解8DNA在細(xì)胞內(nèi)的分布核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子，原核生物的染色體DNA、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子；有些噬菌體DNA為單鏈環(huán)狀分子；DNA在細(xì)胞內(nèi)的分布核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中995％的真核生物DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，其他5％為細(xì)胞器DNA，如線粒體、葉綠體等RNA分子主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，約占75％，另有10％在細(xì)胞核中，15％在細(xì)胞器中。大多數(shù)生物體內(nèi)RNA分子均為單鏈線性分子并具有不同的結(jié)構(gòu)特點，如真核生物mRNA分子多數(shù)在3＇端帶有polyA結(jié)構(gòu)。

DNA提取與鑒定課件10DNA的性質(zhì)

DNA是很惰性的化學(xué)物質(zhì)，雙鏈由氫鍵緊密相連，其堿基對外側(cè)受磷酸和糖的保護，并由于其內(nèi)部的堿基堆積力而進一步加強，使DNA在細(xì)胞內(nèi)比其他成分更具化學(xué)耐久性。因此在氯仿等使蛋白質(zhì)變性的條件下，DNA分子仍然穩(wěn)定。真核生物中的染色體DNA與堿性蛋白(組蛋白)結(jié)合而成核蛋白(DNP)形式而存在于核內(nèi)。DNP溶于水和濃鹽溶液(1-2mol/L氯化鈉)，但不溶于生理鹽溶液中(0.14mol/L氯化鈉)，而RNP此時的溶解度較大，因此可利用這一性質(zhì)，將DNP與RNP分離。

DNA在乙醇中形成絮狀沉淀，使DNA最終得以分離DNA的性質(zhì)11真核生物基因組DNA分離純化的基本步驟真核生物的一切有核細(xì)胞(包括培養(yǎng)細(xì)胞)都可以用來制備基因組DNA。提取方法包括兩步：

1、先溫和裂解細(xì)胞及溶解DNP，而后使DNP與RNP分離，再使核蛋白解離，釋放出DNA.

真核細(xì)胞的破碎有各種手段，包括超聲波破碎法、勻漿法、液氮破碎法、低滲法等物理方法及蛋白酶K和去污劑溫和處理法，為獲得大分子質(zhì)量的DNA，一般多采用后者溫和裂解細(xì)胞。真核生物基因組DNA分離純化的基本步驟真核生物的一切有核細(xì)胞12高分子質(zhì)量DNA在物理上仍是易碎的，在溶液中，長而彎曲的DNA分子隨機卷曲，并因堿基堆積力和磷酸基團間的靜電排斥力變得粘滯，容易受到吸液、振蕩、攪拌等引起的流體剪切力作用而斷裂，因此，基因組DNA容易成片斷獲取，但所需分子質(zhì)量越大，獲得的難度也相應(yīng)增加，大于150kb的DNA分子在常規(guī)分離方法中多被切斷。去除蛋白質(zhì)常用酚、氯仿抽提，反復(fù)抽提操作對DNA鏈機械剪切機會較多，因此有人使用80％甲酰胺解聚核蛋白聯(lián)合透析的方法，可得小于200kb的DNA片段。2.采用化學(xué)或酶學(xué)方法去除蛋白質(zhì)、RNA及其他大分子2.采用化學(xué)或酶學(xué)方法去除蛋白質(zhì)、RNA及其他大分子13豬脾臟DNA提取與鑒定【實驗?zāi)康摹空莆諠恹}法提取與鑒定動物組織DNA的原理和方法。豬脾臟DNA提取與鑒定【實驗?zāi)康摹?4【實驗原理】核酸類化合物都溶于水而不溶于有機溶劑。所以核酸可用水溶液提取，而用有機溶劑沉淀法沉淀分離。在細(xì)胞內(nèi)，RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖核蛋白（RNP），DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成脫氧核糖核蛋白（DNP）。在０.14mol／L的氯化鈉溶液中，RNP的溶解度相當(dāng)大，而DNP的溶解度僅為在水中溶解度的1％；當(dāng)氯化鈉的濃度達到1mol／L的時候，RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。所以常選用０.14mol／L的氯化鈉溶液提取RNP，而選用1－２mol／L的氯化鈉溶液提取DNP?！緦嶒炘怼亢怂犷惢衔锒既苡谒蝗苡谟袡C溶劑。所以核酸可15

核酸提取液中含有的蛋白質(zhì)、多糖等可以用沉淀分離法除去。在核酸提取液中加入氯仿-異戊醇或氯仿-辛醇，振蕩一段時間，使蛋白質(zhì)在氯仿一水界面上形成凝膠狀沉淀而離心除去，核酸仍留在水溶液中。核酸提取液中含有的蛋白質(zhì)、多糖等可以用沉淀分離法除去。16核酸都不溶于有機溶劑，可在核酸提取液中加入親水有機溶劑（乙醇），使DNA或RNA呈絮狀沉淀析出。核酸都不溶于有機溶劑，可在核酸提取液中加入親水有機溶劑（乙醇17【實驗材料】1．材料新鮮(冰凍)豬脾臟。2．器材高速組織搗碎機，恒溫水浴，臺式冷凍離心機，錐形瓶，具塞三角瓶，試管3．試劑(2人/組)(1)0.1mol/LNaCI-0.05mol/L檸檬酸鈉混合液：稱取0.58gNaCl和1.47g檸檬酸三鈉，用蒸餾水溶解后稀釋至100mL。(2)10％(1.71mol/L)NaCl溶液200ml(3)氯仿:異戊醇(24:l,V/V)，現(xiàn)用現(xiàn)配（通風(fēng)櫥中）。(4)95％乙醇

【實驗材料】1．材料18【實驗方法】1．取新鮮(冰凍)豬脾臟20g，剔去結(jié)締組織，用0.1mol/LNaCl-0.05mol/L檸檬酸溶液沖洗除去血水，在冰浴上剪成碎末。2．加入2倍組織重的0.1mol/LNaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉混合液(40mL)置高速組織搗碎機內(nèi)破碎細(xì)胞膜(慢檔，每次5s，間隔30s，共絞3次)，獲得組織漿液。靜置5min，期間輕輕攪拌以充分釋放RNA。3．組織漿液于4℃3500r/min離心20min，棄去上層液，收集沉淀(包括細(xì)胞核)。4．向細(xì)胞核沉淀中加入6倍組織重的10％(1.71mol/L)NaCl溶液120mL，充分?jǐn)噭?，置冰箱?nèi)過夜?！緦嶒灧椒ā?．取新鮮(冰凍)豬脾臟20g，剔去結(jié)締組織，用19【實驗方法】5．次日將所得到的半透明粘稠狀液體連續(xù)注入(線狀、緩慢倒入)預(yù)冷的11倍體積(1320mL)蒸餾水中，輕輕搖勻，DNP即呈絮狀沉淀析出，置冰箱內(nèi)放置數(shù)小時。6．上層清液利用虹吸方法吸出，剩余含有沉淀的少量溶液經(jīng)離心(3500r/min，15min)，收集DNP沉淀。7．將DNP沉淀再溶于原組織重約4倍體積(80mL)的10％NaCl溶液中，輕輕攪拌加速溶解，轉(zhuǎn)移至帶蓋的三角瓶中?！緦嶒灧椒ā?08．加入l/2體積的氯仿-異戊醇溶液(24:l,V/V)40mL，上下劇烈振蕩2-5min

，使組蛋白分離，于3500r/min，離心l5min，吸出上面含有DNA和DNP的水層，棄去兩層間的變性蛋白凝膠，回收下層有機相。9．上層水相再次加入20mL氯仿-異戊醇混合液，繼續(xù)抽提去除蛋白，多次重復(fù)此操作（至少共3次）直至兩相之間無明顯變性蛋白質(zhì)凝膠生成?！緦嶒灧椒ā?．加入l/2體積的氯仿-異戊醇溶液(24:l,V/V)2110．最后吸出上清液并將它連續(xù)注入兩倍體積預(yù)冷至4℃的95％乙醇中。11．用玻棒小心撈出纖維狀DNA鈉鹽沉淀，瀝干乙醇溶液后，依次用80％和95％乙醇洗滌，最后用少量無水乙醇洗滌，輕輕壓擠沉淀，盡量吸盡乙醇后，鋪開在表面皿上。置真空干燥器內(nèi)干燥，即得白色纖維DNA鈉鹽。【實驗方法】10．最后吸出上清液并將它連續(xù)注入兩倍體積預(yù)冷至4℃的95％22【注意事項】1．為了防止大分子核酸在提取過程中被降解，使其分子斷裂，因而不能獲得天然的大分子核酸。提取中需要加人檸檬酸鈉、EDTA、8-羥基喹啉等抑制核酸酶的活力，并在低溫下進行操作，此外提取過程中應(yīng)避免加熱，強酸，強堿和劇烈振蕩等。本實驗第一步進行組織勻漿時，不宜過于劇烈，時間不能太長，避免部分細(xì)胞核被破壞，導(dǎo)致DNA釋放而被斷裂，這將關(guān)系到最后是否能獲得纖維狀DNA?！咀⒁馐马棥?．為了防止大分子核酸在提取過程中被降解，使其分232．除去蛋白質(zhì)時，若振蕩劇烈可使部分DNA斷裂，乙醇沉淀后，除能纏繞粘附在玻棒上的纖維狀DNA外，溶液中還會有絮狀沉淀，即為斷裂的DNA。但若振蕩不夠，蛋白質(zhì)不能很好除去，則影響DNA制品的質(zhì)量。3．細(xì)胞核沉淀加入濃鹽溶液，冰箱放置過夜后，有時可能形成塊狀凝膠(如以脾臟為材料制備DNA)，應(yīng)置搗碎機內(nèi)絞5s，打碎凝膠塊，但此時DNA已從核內(nèi)溶解出來，因此不宜劇烈打碎。【注意事項】2．除去蛋白質(zhì)時，若振蕩劇烈可使部分DNA斷裂，乙醇沉淀后，24思考題1.為什么在低溫下進行？2.加檸檬酸鈉和EDTA的作用?3.加NaCl的作用，為什么要加到1mol/L?4.加入異戊醇有什么作用？5.分離純化過程中每一步試劑的作用？思考題1.為什么在低溫下進行？25實驗室：315室313室311室領(lǐng)用儀器：312室王劍峰純水機：311室制冰機室：204室離心機：313室一臺，204室一臺，103室一臺，101室一臺，分光光度計室：206室實驗室：315室313室311室26DNA的鑒定與分析二苯胺顯色法測定DNA含量紫外吸收法測定DNA純度瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA分子大小與完整性DNA的鑒定與分析二苯胺顯色法測定DNA含量27二苯胺顯色法測定DNA含量（一）強酸、加熱條件下，可以使DNA中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，而產(chǎn)生嘌呤堿基，脫氧核糖與嘧啶核苷酸。

其中2ˊ脫氧核糖在酸性環(huán)境中成為ω―羥基―γ―酮基戊醛，此物與二苯胺反應(yīng)生成藍色化合物，在595nm處有最大吸收。DNA在40-400μg/ml范圍內(nèi)光密度與DNA濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛可提高靈敏度，而且其他化合物的干擾也顯著降低。當(dāng)樣品含少量RNA時不影響測定，而蛋白質(zhì)、多種糖及其衍生物芳香，羥基醛都能與二苯胺形成各種有色物質(zhì)，干擾測定?！緦嶒炘怼慷桨凤@色法測定DNA含量（一）強酸、加熱條件下，281、DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液：（須經(jīng)定磷法確定其濃度）取標(biāo)準(zhǔn)DNA以0.01mol/LNaOH配成200微克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)液。每組需12.4ml，200ml/班2、待測樣品液：準(zhǔn)確稱取豬脾DNA5mg,用0.01mol/L的氫氧化鈉溶液定容至50ml配成100微克/毫升的溶液。每組需7ml3、二苯胺試劑：1g二苯胺（需在70%乙醇試劑中重結(jié)晶2次)+100mL冰乙酸+10mL過氯酸，混合備用，臨用前加入1.0mL1.6%乙醛。每組需64ml,1000ml/班4、1.6%乙醛：取47%乙醛3.4ml，加重蒸水定容至100ml（放于冰箱中，一周之內(nèi)可以使用）。注意：商品用有47%和40%兩種

DNA提取與鑒定課件29

1.DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：取14支試管，分成2組，依次加入0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。添加蒸餾水，使之都成為2ml。然后各加入4ml二苯胺試劑，混勻。于沸水浴中加熱10min，冷卻后于595nm處進行比色測定。取兩管平均值，以DNA濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【操作方法】【操作方法】30

1

2

3

4

5

6

7

DNA含量/μg

0

40

80

160

240

320400

DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液／mL

0

0.2

0.4

0.8

1.21.6

2.0蒸餾水／mL2.01.81.6

1.2

0.8

0.4

0二苯胺試劑／mL

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0混勻，立即放入沸水浴中加熱10min，取出后流水冷卻，冷卻后595nm處比色

A595

DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定以1號管為空白對照123456312.制品的測定：

取2支試管，各加2ml待測液（內(nèi)含DNA應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍之內(nèi)）和4ml二苯胺試劑，搖勻。其于操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。3.

根據(jù)測得的光吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線待測上查出相應(yīng)該光吸收值DNA的含量，計算出制品中的百分含量?！静僮鞣椒ā?.制品的測定：

取2支試管，各加2ml待測液（32

DNA純度：待測液中測得的核酸微克數(shù)

DNA%=×100待測液中制品的微克數(shù)DNA產(chǎn)率:測得的DNA的微克數(shù)

DNA%=×100原料的微克數(shù)數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理33二苯胺試劑僅能與嘌呤核苷酸中的脫氧核糖反應(yīng).因此測定的可靠性受到不同來源的DNA中嘌呤與嘧啶核苷酸比例變化的限制，為提高測定準(zhǔn)確度，應(yīng)使用經(jīng)純化的其含磷量已知的小牛胸腺DNA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品進行校正?！咀⒁馐马棥慷桨吩噭﹥H能與嘌呤核苷酸中的脫氧核糖反應(yīng).【注意事項】34

紫外吸收法測定DNA純度（二）

核酸在260nm波長處具有紫外吸收特性(最大吸收峰)。此法快速、簡便，且不破壞樣品，是定量測定濃度較高的純DNA和RNA溶液的首選方法。

高純度DNA制品的260nm與280nm的吸光值在1.8左右，當(dāng)比值偏高時表明制品中混雜有RNA,而比值偏低時則表明制品中可能有蛋白質(zhì)或酚的污染。因此，可利用A260/A280比值的測定來鑒定DNA制品的純度?！緦嶒炘怼?/p>

紫外吸收法測定DNA純度（二）

核酸在260nm波長處351．吸取2.5mlDNA樣品，轉(zhuǎn)入石英比色杯中(若樣品很少，可用0.5mL的比色杯，上述體積均減一半)。2．用2.5mL0.01mol/LNaOH校正紫外分光光度計的零點。3．在260nm，280nm處分別讀出吸光度值(A)。定量分析：DNA的濃度=A260×核酸稀釋倍數(shù)×50／1000=A260×1×50／1000=20×A260(μg/μl)RNA的濃度=A260×核酸稀釋倍數(shù)×40／1000(μg/μl)【實驗步驟】分光光度換算：

1A260雙鏈DNA=50μg/ml

1A260單鏈DNA=30μg/ml

1A260單鏈RNA=40μg/ml

1．吸取2.5mlDNA樣品，轉(zhuǎn)入石英比色杯中(若樣品很少，36注意將DNA樣品稀釋到A280在0.2-0.8（0.1-1.0）之間再測A260、A280及計算A260/A280比值，因為只有在此范圍內(nèi)才有線性關(guān)系，可先用原液測定，再估算稀釋比例。注意將DNA樣品稀釋到A280在0.2-0.8（0.1-1.374．純度分析：若為DNA純品，則A260／A280=1.8

若為RNA純品，則A260／A280=2.0

若DNA樣品A260／A280>1.8，說明仍有RNA，可用RNA酶處理樣品；若A260／A280<l.7，說明樣品中存在蛋白質(zhì)，應(yīng)再用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀純化DNA。若為RNA樣品A260／A280<2.0，也應(yīng)考慮再用酚/氯仿抽提。若核酸樣品A260／A230<2.0，考慮有鹽未除盡。用A260／A280比值估計核酸純度僅在制備物中沒有酚時才準(zhǔn)確，因水飽和酚在270nm波長處有特征性吸收峰，其A260／A280比值也為2.0。無酚的核酸制品A260／A270比值約為1.2。【實驗步驟】4．純度分析：若為DNA純品，則A260／A280=1.8【38

瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA（三）

DNA分子帶負(fù)電荷，在電場中受到電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)向正極移動過程中，因DNA分子的大小及構(gòu)象差別而呈現(xiàn)遷移位置上的差異，對于線形DNA分子，其電場中的遷移率與其分子量的對數(shù)值成反比。電泳時加溴化乙錠(EB)，其與DNA結(jié)合形成一種熒光絡(luò)合物，在254～365nm紫外線照射下可產(chǎn)生橘紅色的熒光，可用于檢測DNA。【實驗原理】

瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA（三）

DNA分子帶負(fù)電荷，在391．實驗器材電泳儀，水平電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)2．試劑(1)5×TBE緩沖液(pH8.3)：54gTris堿，27.5g硼酸，20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加水至1L。(2)0.5×TBE緩沖液(pH8.3)。(3)溴化乙錠(EB)(10mg/mL)。(4)0.8％瓊脂糖凝膠：瓊脂糖0.8g加至100mL0.5×TBE緩沖液，加熱熔解備用。(5)6×凝膠上樣緩沖液：0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯青FF，30％甘油溶于水中，于4℃保存。(6)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker?！緦嶒灢牧稀?．實驗器材【實驗材料】40常用的電泳緩沖液

緩沖液使用液濃貯存液（每升）Tris-乙酸（TAE）1×：0.04mol/LTris-乙酸50×：242gTris堿

0.001mol/LEDTA57.1ml冰乙酸

100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)Tris-磷酸（TPE）1×:0.09mol/LTris-磷酸10×:10gTris堿

0.002mol/LEDTA15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）

40ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)Tris-硼酸（TBE）a0.5×0.045mol/LTris-硼酸5×：54gTris堿

0.001mol/LEDTA27.5g硼酸

20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)堿性緩沖液b1×:50mmol/LNaOH1×:5ml10mol/LNaOH

1mmol/LEDTA2ml0.5mmol/LEDTA(pH8.0)Tris-甘氨酸c1×:25mmol/LTris5×:15.1gTris

250mmol/L甘氨酸94g苷氨酸（電泳級）（pH8.3）

0.1%SDS50ml10%SDS(電泳級)常用的電泳緩沖液

緩沖液使用液濃貯存液（每升）Tris-乙41

凝膠加樣緩沖液緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度I0.25%(ol/V)溴酚藍4℃0.25%(m/v)二甲苯青FF40%(m/v)蔗糖水溶液Ⅱ0.25%(m/v)澳酚藍室溫0.25%(m/v)二甲苯青FF15%(m/v)聚糖體(Ficoll)(400型，Pharmacia)水溶液Ⅲ0.25%(m/v)溴酚藍4℃0.25%(m/v)二甲苯青FF30%甘油水溶液Ⅳ0.25%(m/v)溴酚藍4℃40%(m/v)蔗糖水溶液

凝膠加樣緩沖液緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度I0.42使用凝膠上樣緩沖液的目的增大樣品密度；以確保DNA均勻進入樣品孔內(nèi)；使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操作更為便利，含有在電塊中能以可預(yù)知速率向陽極泳動的染料。使用凝膠上樣緩沖液的目的增大樣品密度；431．瓊脂糖凝膠板的制備：將0.8％瓊脂糖凝膠加熱熔化均勻，冷卻到60～70℃加EB至終濃度0.5μg/mL，倒入封好的凝膠槽，厚度約3～5mm，在距底板0.5～1mm的位置放置樣品梳，檢查梳子齒間有無氣泡，待冷卻成形后取出梳子及隔板，放人水平電泳槽中，緩沖液淹沒過膠1～2mm為止。【實驗步驟】1．瓊脂糖凝膠板的制備：將0.8％瓊脂糖凝膠加熱熔化均勻，冷44【實驗步驟】2．加樣：樣品中加1/5體積的6×凝膠上樣緩沖液，混勻，取10～15μl加入凝膠點樣孔中。同時要設(shè)立合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物?！緦嶒灢襟E】2．加樣：樣品中加1/5體積的6×凝膠上樣緩沖液45

Marker樣品DNA1樣品DNA2加樣量ul610106×LoadingBuffer022

463．電泳：電壓2～10V/cm膠，待溴酚藍移至凝膠的2/3距離時，關(guān)閉電源。4．觀測：取出凝膠塊，置凝膠成像分析儀上觀察，即可見橘紅色的DNA區(qū)帶?！緦嶒灢襟E】3．電泳：電壓2～10V/cm膠，待溴酚藍移至凝膠的2/347溴酚藍在瓊脂糖中移動的速率約為二甲苯青FF的2.2倍，而與瓊脂糖濃度無關(guān);以0.5×TBE作電泳液時，溴酚藍在瓊脂糖中的泳動速率約與長