功能基因組學(xué)課件

第二講基因組序列詮釋第二講基因組序列詮釋1問(wèn)題基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？基因組作為一個(gè)整體如何行使其功能？用什么方法尋找基因，研究基因地功能呢？問(wèn)題基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？21.尋找基因1.1根據(jù)開(kāi)放讀碼框預(yù)測(cè)基因A起始密碼子ATG第一個(gè)ATG的確定(依據(jù)Kozak規(guī)則);Kozak規(guī)則是基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果.所謂Kozak規(guī)則，即第一個(gè)ATG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計(jì)規(guī)律.1.尋找基因1.1根據(jù)開(kāi)放讀碼框預(yù)測(cè)基因3Kozak規(guī)則:若將第一個(gè)ATG中的堿基A，T，G分別標(biāo)為1,2，3位，則Kozak規(guī)則可描述如下：(1)第4位的偏好堿基為G；(2)ATG的5’端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；(4)除-3，-6和-9位，在整個(gè)側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。Kozak規(guī)則:4B信號(hào)肽分析信號(hào)肽分析軟件(SignalPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/signalP)

把預(yù)測(cè)過(guò)程中證實(shí)含完整mRNA5’端的序列翻譯為蛋白序列;然后用SignalP軟件對(duì)前50個(gè)氨基酸序列(從第一個(gè)ATG對(duì)應(yīng)的甲硫氨酸Met開(kāi)始)進(jìn)行評(píng)估，如果SignalP分析給出正面結(jié)果，則測(cè)試序列有可能為信號(hào)肽;

B信號(hào)肽分析5C終止密碼子終止密碼子:TAA,TAG,TGAGC%=50%終止密碼子每64bp出現(xiàn)一次；GC%>50%終止密碼子每100－200bp出現(xiàn)一次；由于多數(shù)基因ORF均多于50個(gè)密碼子，因此最可能的選擇應(yīng)該是ORF不少于100個(gè)密碼子。C終止密碼子6D3’端的確認(rèn)

3’端的確認(rèn)主要根據(jù)Poly(A)尾序列,若測(cè)試DNA片段不含Poly(A)序列，則根據(jù)加尾信號(hào)序列“AATAAA”和BLAST同源性比較結(jié)果共同判斷。D3’端的確認(rèn)7E非編碼序列、內(nèi)含子高等真核生物多數(shù)外顯子長(zhǎng)度少于100個(gè)密碼子，有的不到50個(gè)密碼子甚至更少；E非編碼序列、內(nèi)含子8F密碼子偏愛(ài)性編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼，其差別僅在密碼子的第3位堿基不同。不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異，如人類基因中，丙氨酸（Ale）密碼子多為GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。F密碼子偏愛(ài)性9G外顯子－內(nèi)含子邊界外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征，如:內(nèi)含子的5‘端或稱供體位（donorsite）常見(jiàn)的順序?yàn)?’－AG↓GTTAAGT-3’；3’端又稱受體位（acceptorsite),多為5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；G外顯子－內(nèi)含子邊界10H上游控制順序幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調(diào)控序列，它們可與DNA結(jié)合蛋白作用，控制基因表達(dá)。

通過(guò)同源性比較來(lái)預(yù)測(cè)mRNA的5’端，最常用的與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)是真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)(TheTRADATProject,EukaryoticPromoterDatabase,EPD.http://www.epd.unil.ch/)。另外個(gè)別生物基因組的特有組成也可作為判別依據(jù)，如脊椎動(dòng)物基因組許多基因的上游都有CpG島。

H上游控制順序11I軟件預(yù)測(cè)采用NCBI的ORF預(yù)測(cè)軟件(ORFfinder:/gorf/orfig.cgi)判斷ORF的可能范圍。I軟件預(yù)測(cè)121.2同源查詢途徑通過(guò)已存入數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因順序與待查的基因組序列進(jìn)行比較，從中查找可與之匹配的堿基順序及其比例，用于界定基因的方法稱為同源查詢。

1.2同源查詢途徑13同源有如下幾種情況：

ADNA序列某些片段完全相同；B開(kāi)放讀碼框（ORF）排列類似，如有長(zhǎng)外顯子；C開(kāi)放讀碼框翻譯成氨基酸序列的相似性；D模擬多肽高級(jí)結(jié)構(gòu)相似同源有如下幾種情況：141.3試驗(yàn)分析Northern雜交確定DNA片段是表達(dá)序列.注意事項(xiàng)：a當(dāng)某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行可變剪接時(shí)，由于連接的外顯子不同，會(huì)產(chǎn)生好幾條長(zhǎng)度不一的雜交帶;如果該基因是某一基因家族的成員也會(huì)出現(xiàn)多個(gè)信息；b考慮組織專一性和發(fā)育階段的問(wèn)題；

1.3試驗(yàn)分析15功能基因組學(xué)ppt課件16功能基因組學(xué)ppt課件17C基因表達(dá)產(chǎn)物豐度的問(wèn)題如果風(fēng)度較低，用擬Northern雜交和動(dòng)物雜交（Zoo-blotting）分析。擬Northern雜交——根據(jù)已知的DNA順序設(shè)計(jì)引物，從mRNA群體中擴(kuò)增基因產(chǎn)物，再以DNA為探針與之雜交。C基因表達(dá)產(chǎn)物豐度的問(wèn)題18動(dòng)物園雜交——根據(jù)親緣關(guān)系相似的物種，其基因的編碼區(qū)相似性較高，而非編碼區(qū)的同源性很低的原理。如果某一物種的DNA順序與來(lái)自另一親緣物種的DNA片段雜交產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，該區(qū)段可能含有1個(gè)或多個(gè)基因，這種方法又稱為動(dòng)物園雜交。動(dòng)物園雜交——根據(jù)親緣關(guān)系相似的物種，其基因的編碼區(qū)相似性19功能基因組學(xué)ppt課件202獲取基因全長(zhǎng)cDNA序列A構(gòu)建cDNA文庫(kù)，用目的基因DNA片段篩選文庫(kù)。2獲取基因全長(zhǎng)cDNA序列A構(gòu)建cDNA文庫(kù)，用目的基因21cDNA文庫(kù)構(gòu)建(CLONTECH)cDNA文庫(kù)構(gòu)建(CLONTECH)22cDNA文庫(kù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)構(gòu)建23B根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)引物，RACE技術(shù)得到基因的全長(zhǎng)cDNA序列。B根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)引物，RACE技術(shù)得到基因的全長(zhǎng)cDN245’RACE(CLONTECH)5’RACE253’RACE(CLONTECH)3’RACE26功能基因組學(xué)ppt課件27功能基因組學(xué)ppt課件283.確定DNA順序中基因的位置A通過(guò)對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列的測(cè)序、對(duì)比，以及與基因組DNA的比較，確定基因所在的區(qū)域；B通過(guò)物種已建立遺傳圖和物理圖來(lái)確定基因的位置；3.確定DNA順序中基因的位置A通過(guò)對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列的測(cè)294.實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因功能4.1基因剔除(knock-out)最簡(jiǎn)便的基因失活的方法.主要原理:在一段無(wú)關(guān)DNA片段的兩測(cè)連接與代換基因兩測(cè)相同的順序,將這一構(gòu)建導(dǎo)入目的細(xì)胞,由于同源片段之間的重組,可使無(wú)關(guān)片段取代靶基因,整合到染色體中.為了便于篩選,用于取代的外源DNA中含有報(bào)告基因.4.實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因功能4.1基因剔除(knock-out)30tk胸苷激酶標(biāo)記基因←gangcyclovirneor新霉素抗性基因→G418tk胸苷激酶標(biāo)記基因←gangcyclovir31功能基因組學(xué)ppt課件324.2基因超時(shí)表達(dá)

通過(guò)增加基因的拷貝數(shù)和采用強(qiáng)啟動(dòng)子促使基因超表達(dá),致使受體表現(xiàn)出生長(zhǎng)與發(fā)育的異常,來(lái)研究基因的功能.4.2基因超時(shí)表達(dá)334.3反義RNA

反義RNA是由基因的負(fù)鏈編碼,可與正義RNA(senseRNA)或DNA編碼順序結(jié)合,干擾mRNA的轉(zhuǎn)錄,加工和轉(zhuǎn)運(yùn),調(diào)控基因的表達(dá).4.3反義RNA反義RNA是由基因的負(fù)鏈34構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體:將全目的基因或部分目的基因反向插入表達(dá)載體→轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物→獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體或品系→分析轉(zhuǎn)基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異→判別目的基因的功能構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體:35正義表達(dá)載體反義表達(dá)載體正義表達(dá)載體反義表達(dá)載體36反義RNA作用機(jī)理：

A干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈RNA，隨之被細(xì)胞降解。B與mRNA的引導(dǎo)順序結(jié)合，阻止核糖體的附著，使翻譯無(wú)法啟動(dòng)。C反義RNA與mRNA形成雙鏈分子后，使RNA多聚酶脫離模板,轉(zhuǎn)錄終止。反義RNA作用機(jī)理：374.4RNAi干涉

RNAi干涉是通過(guò)雙鏈RNA的介導(dǎo),特異性地降解相應(yīng)序列的mRNA,從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制.4.4RNAi干涉RNAi干涉是通過(guò)雙鏈38RNAi作用機(jī)理AdsRNA核酸內(nèi)切酶Dicer被激活,它把dsRNA加工成21~25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的RNA鏈;B這些小片段RNA(siRNA)作為另一個(gè)核糖核酸復(fù)合體RISC(RNA-inducesilencingcomplex,RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的指引物,結(jié)合到RISC上,使之識(shí)別并降解mRNA,從而導(dǎo)致與雙鏈RNA同源的基因沉默;RNAi作用機(jī)理AdsRNA核酸內(nèi)切酶Dicer被激活,39功能基因組學(xué)ppt課件40RNAi設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用AFraser合成與開(kāi)放讀碼框相對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA或利用細(xì)菌克隆表達(dá)這些雙鏈RNA→微量注射和喂食→干擾同源基因的表達(dá)BChuang等設(shè)計(jì)出嵌合體結(jié)構(gòu)→連接強(qiáng)啟動(dòng)子大量表達(dá)雙鏈mRNA→干擾同源基因的表達(dá)RNAi設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用41HbF基因的RNAi載體構(gòu)建HbF基因的RNAi載體構(gòu)建42RNAi技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)RNAi最根本的特點(diǎn)是特異性RNAi具有特殊的穿越能力,如將雙鏈RNA注射在線蟲(chóng)性腺里,它也會(huì)干擾到體細(xì)胞里的基因表達(dá),而且干擾作用會(huì)傳給后代;RNAi對(duì)一些低水平表達(dá)的基因的RNAi現(xiàn)象并不明顯,而且?guī)讉€(gè)有相同或相似序列的基因,RNAi也會(huì)同時(shí)作用與它們.RNAi技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)RNAi最根本的特點(diǎn)是特異性434.5酵母雙雜交（yeasttwo-hybridization）原理：其原理涉及轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子之間的互作。

正常條件下：轉(zhuǎn)錄因子（包括兩個(gè)功能區(qū)域）→

結(jié)合功能域同基因上游的區(qū)段結(jié)合

→激活功能域激活RNA多聚酶→將基因轉(zhuǎn)錄為mRNA4.5酵母雙雜交（yeasttwo-hybridizat44酵母雜交系統(tǒng)中：

融合表達(dá)載體1

融合表達(dá)載體2DNA結(jié)合功能域+目的片段激活功能域+多種未知cDNA

融合表達(dá)載體1同一細(xì)胞融合表達(dá)載體2