下游加工過程概論課件

一、下游加工過程在生物技術中的地位下游加工過程是生物工程的一個組成部分。生物化工產品系通過微生物發(fā)酵過程、酶反應過程或動植物細胞大量培養(yǎng)獲得，從上述發(fā)酵液、反應液中分離、精制有關產品的過程稱為下游加工過程。一、下游加工過程在生物技術中的地位下游加工過程是生物工程的一1生物工程的最新進展大多集中在基因工程方面，在生物反應器和發(fā)酵技術方面也有不少進展，而對下游加工過程，則沒有給予應有的重視。下游加工過程的落后會阻礙生物技術的發(fā)展，特別是有其他生產方法與其相競爭時。在發(fā)酵產品的生產中，分離和精制過程占成本的很大部分。例如：傳統(tǒng)發(fā)酵，分離和精制占整個投資費用的60％，而對重DNA發(fā)酵、精制蛋白質的費用可占整個生產費用的80－90％。而且還有繼續(xù)加劇的趨向。生物工程的最新進展大多集中在基因工程方面，在生物反應器和發(fā)酵2二、傳統(tǒng)生化產品和基因工程產品回收方法的比較1、傳統(tǒng)生化產品都為小分子(酶除外），理化性能已知，放大比較有根據，基因工程產品都是大分子，數據缺乏，放大多憑經驗。2、基因工程產品多處于胞內，提取前需細胞破碎。而且發(fā)酵液產物濃度也較稀，雜質又多，加上大分子較不穩(wěn)定，故提取較困難，常需利用高分辨力的精制方法，如色層分離等。其他方面，兩者相似。二、傳統(tǒng)生化產品和基因工程產品回收方法的比較1、傳統(tǒng)生化產品3三、生物技術下游加工過程的特點

培養(yǎng)液是復雜的多相系統(tǒng)，含有細胞、代謝產物和末用完的培養(yǎng)基等。分散在其中的固體和膠狀物質，具可壓縮性，其密度又和液體相近，加上粘度很大，屬非牛頓性液體，使從培養(yǎng)液中分離固體很困難。1、發(fā)酵液成分復雜三、生物技術下游加工過程的特點培養(yǎng)液是復42、培養(yǎng)液產物濃度低，但雜質含量卻很高。

特別是利用基因工程方法產生的蛋白質常常伴有大量性質相近的雜質。2、培養(yǎng)液產物濃度低，但雜質含量卻很高。5例如在恒溫、恒壓下，將理想溶液分離為純物質的最小能量為：從低濃度混合物中分離純組分，需較大的能量?？梢娝枘芰看致缘睾蜐舛鹊呢搶党杀壤?。例如在恒溫、恒壓下，將理想溶液分離為純物質的6

據統(tǒng)計，產品的售價大致和濃度的負對數成比例，這與從熱力學理論推結果一致。據統(tǒng)計，產品的售價大致和濃度的負對數成比例，7由于起始濃度低，雜質多，成品要求純度高，因此常需多步操作。目前，基因工程產品收率達到30—40％就已是較好。減少提取步驟是相當重要的。由于起始濃度低，雜質多，成品要求純度高，因此8一些產物遇熱、極端PH、有機溶劑會引起失活或分解，特別是蛋白質的生物活性與一些輔因子、金屬離子的存在和分子的空間構型有關，一般認為剪切力會影響空間構型和使分子降解，對蛋白質的活性影響很大，而最近的研究則表明和膜結合的蛋白質對剪切力較敏感，而溶解的蛋白質則受影響較小。3、欲提取的生物物質通常很不穩(wěn)定。一些產物遇熱、極端PH、有機溶劑會引起失活9發(fā)酵或培養(yǎng)都是分批操作、生物變異性大，各批發(fā)酵液不盡相同，這就要求下游加工有一定的彈性，特別是對染菌的批號，也要能處理。發(fā)酵液的放罐時間、發(fā)酵過程中消沫劑的加入都對提取有影響。4、彈性要求大發(fā)酵或培養(yǎng)都是分批操作、生物變異性大，各批發(fā)酵10下游加工程應遵循得四條原則：（1）、時間短（2）、溫度低（3）、PH適中（4）、勤清洗消毒下游加工程應遵循得四條原則：（1）、時間短11

對基因工程產品，還應注意生物安全問題，即要停止菌體擴散，特別對前面幾步操作，一般要求在密封的環(huán)境下操作。對基因工程產品，還應注意生物安全問題，即要停12四、生物技術下游加工過程的一般流程和單元操作（一）、一般工藝流程下游加工過程可分為4個階段：1)、發(fā)酵液的預處理和固液分離2)、初步純化(提取)3)、高度純化(精制)4)、成品加工。四、生物技術下游加工過程的一般流程和單元操作（一）、一般工13下游加工過程概論課件14（二）、發(fā)酵液的預處理和固液分離預處理目的：改變發(fā)酵液的性質，以利于固液分離。

常用方法：

1、在活性物質穩(wěn)定性的范圍內，通過酸化、加熱、以降低發(fā)酵液的粘度。2、加入絮凝劑，使細胞或溶解的大分子聚結成較大的顆粒。（二）、發(fā)酵液的預處理和固液分離預處理目的：15傳統(tǒng)的板框壓濾機和鼓式真空過濾機在某些場合仍在使用，如對較粗大的真菌菌絲，但在很多場合會遇到困難。一解決方法：在鼓式真空過濾機轉鼓的表面預鋪一層2—10cm厚的助濾劑層，過濾時形成的濾餅不斷地用緩慢前進的刮刀，連同極薄的一層助濾劑(百分之幾毫米)一起刮去。濾餅用作飼料時，此法不能采用。

傳統(tǒng)的板框壓濾機和鼓式真空過濾機在某些場合仍16

此外，離心分離也是常用的方法，較新的裝置是傾析式離心機，適用于含固量較多的發(fā)酵液。此外，離心分離也是常用的方法，較新的裝置是傾17（三）、細胞破碎和其碎片的分離

細胞破碎方法有機械、生物和化學等方法。大規(guī)模生產常用高壓勻漿器和球磨機。前者主要利用液相剪切力和與固定表面撞擊所產生的應力；后者主要依靠研磨，兩者機理不同，可相互補充。細胞碎片的分離通常用離心分離的方法，但非常困難。一種新的辦法是利用兩水相萃取法，選擇適當的條件使細胞碎片集中分配在下相。（三）、細胞破碎和其碎片的分離細胞破碎方法有18（四）、初步純化(提取)目的：主要是濃縮，也有一些純化作用。方法：吸附法、離子交換法、沉淀法溶劑萃取法、兩水相萃取法、超臨界流體萃取、逆膠束萃取、超過濾（四）、初步純化(提取)目的：主要是濃縮，也有一些純化作用。19A、吸附法

應用范圍：主要用于抗生素等小分子物質。

原理：利用吸附劑與抗生素之間的分子引力而將抗生素吸附在吸附劑上。

吸附劑種類：活性炭、白土、氧化鋁、各種離子交換樹脂?；钚蕴繎米顝V。

活性炭的缺點：吸附性能不穩(wěn)定，選擇性不高，可逆性差，不能連續(xù)操作，勞動強度大，影響環(huán)境衛(wèi)生。A、吸附法應用范圍：主要用于抗生素等小20B、離子交換法主要用于小分子的提取，系利用離子交換樹脂和生物物質之間的化學親和力，有選擇性地將生物物質吸上去，然后以較少量的洗脫劑將它洗下來。生物物質必須是極性化合物，即能形成離子。吸附和洗脫具有選擇作用，能達到濃縮和精制的目的。一般的離子交換樹脂的骨架具有憎水性，與蛋白質的憎水部份有吸附作用，而使蛋白質變性失活。以天然糖類為骨架的離子交換劑，由于其骨架具有親水性，可用求提取蛋白質，例如以纖維素為骨架的離子交換劑。B、離子交換法主要用于小分子的提取，系利21C、沉淀法鹽析：最常用的鹽類是硫酸銨。加入有機溶劑：

調pH至等電點：此法沉淀能力不強，常同時加入有機溶劑，使沉淀完全。加入非離子型聚合物：如PEG，機理和有機溶劑相似。加入聚電解質：如聚丙烯酸，機理和鹽析作用相似。廣泛用于蛋白質提取。主要起濃縮作用。C、沉淀法鹽析：最常用的鹽類是硫酸銨。廣泛用于蛋白質22

通常是加入一些無機、有機離子或分子，能和生物物質形成不溶解的鹽或復合物，而沉淀在適宜的條件下，又很易分解。例如：四環(huán)類抗生素在堿性下能和鈣、鎂、鋇等重金屬離子或溴化十五烷吡啶形成沉淀，發(fā)酵單位越高，沉淀法越有利，因殘留在溶液中的濃度是一定的，故發(fā)酵單位越高、收率就越高。沉淀法也用于小分子物質的提取中，但具有不同的機理。通常是加入一些無機、有機離子或分子，能和生物物質形成23D、溶劑萃取法應用范圍：一般用于抗生素等小分子生物物質的提取?；驹恚嚎股匾圆煌幕瘜W狀態(tài)(游離態(tài)或成鹽)存在時，在水及與水不互溶的溶劑中有不同的溶解度。當進行轉移時，雜質不能或較少地隨著轉移，因而能達到濃縮和提純的目的。有時，一次轉移并不能將雜質充分除去，可采用二次萃取。舉例：青霉素在酸性下成游離酸狀態(tài)，在醋酸丁酯中溶解度大，能從水轉移到醋酸丁酯中：在中性下，成鹽狀態(tài)，在水中溶解度大，能從醋酸丁酯轉移到水中。D、溶劑萃取法應用范圍：一般用于抗生素等小分子生物物質的提24溶劑萃取法常遇到困難是分配系數較低，一種解決的方法是利用反應萃取法，即利用一種溶劑(通常是有機磷化合物或脂肪胺)，能按一定化學計量關系與生物物質形成特異性的溶劑化健或離子對復合物。溶劑萃取法常遇到困難是分配系數較低，一種解決25E兩水相萃取法適用范圍：僅適用于蛋白質的提取，小分子物質不適用。基本原理：由于聚合物分子的不相容性，兩種聚合物的水溶液（含鹽或不合鹽)可以分成兩相，蛋白質分子可在兩相間進行分配。舉例：聚乙二醇PEG與葡聚糖的水溶液。一種聚合物（如PEG）和一種鹽（如磷酸鹽）也能形成兩相。影響分配系數的因素：聚合物的種類和濃度、聚合物的分子量，離子的種類，離子強度，PH和溫度等，而且這些因素相互有影響。E兩水相萃取法適用范圍：僅適用于蛋白質的提取，小分子物質26F超臨界流體萃取臨界點：一般物質，在常壓下平衡時，汽液兩相的物理性質（如粘度、密度等）相差很顯著。在較高壓力下，這種差別逐漸縮小，當達到其一溫度與壓力時，兩相差別消失，合并成一相，這時稱為臨界點，其溫度和壓力分別稱為臨界溫度和臨界壓力。超臨界流體：當溫度和壓力略超過或靠近臨界點時，其性質介于液體和氣體之間，稱為超臨界流體。F超臨界流體萃取臨界點：一般物質，在常壓下平衡時，汽液27超臨界流體萃取原理：超臨界流體的密度和液體相近，粘度和氣體接近，溶質在其中的擴散速度可為液體的100倍，這是超臨界流體的萃取能力和速度，優(yōu)于一般溶劑的原因。而且流體的密度越大，萃取能力也越大，變化溫度和壓力可改變萃取能力，使對某物質具有選擇性。

二氧化碳：常用作為萃取劑，因其臨界壓力較低，（31.1C，7.3Mpa）操作安全，無毒，適用于非極性物質，對極性物質萃取能力差，但可加入極性的輔助溶劑（夾帶劑entrainer)來補救。本法還具有節(jié)約能量等優(yōu)點，已開始應用在食品工業(yè)和生物工程中。已用于咖啡脫咖啡因，啤酒花脫氣味等。超臨界流體萃取原理：超臨界流體的密度和液體相近28逆膠束萃取目前還處于實驗室研究階段，但有希望用于大規(guī)模蛋白質提取中。

原理：逆膠束可以看作是50一100nm的水溶液微滴依靠表面活性劑分散在非極性溶劑中。在逆膠束中，蛋白質處于水溶液的環(huán)境中，因而不會失活，如水溶液中含有幾種蛋白質時，則可調節(jié)系統(tǒng)的條件，使一些蛋白質溶于逆膠束中，而其他蛋白質則不能。G逆膠束萃取

reversedmicelleextraction逆膠束萃取目前還處于實驗室研究階段，但有希望29下游加工過程概論課件30原理：超濾法是利用一定截斷分子量的超濾膜進行溶質的分離或濃縮。小于截斷值的分子能通過膜，而大于截斷值的分子不能通過膜，因而達到分離。應用范圍：適用于超濾的物質，分子量在500一1000000之間，或分子大小近似地在(1一l0nm)之間。在小分子物質的提取中，超濾主要用于去除大分子雜質。在大分子物質的提取中，超濾主要用于脫鹽、濃縮。主要缺點：濃差極化和膜的污染，膜的壽命較短和通量低，很難用于處理量大的工業(yè)中。但這些缺點正在克服，有很好的發(fā)展前景。H、超濾法原理：超濾法是利用一定截斷分子量的超濾膜進行溶質的分離31（五）、高度純化(精制)經初步純化后，體積大大縮小，但純度提高不多，需要進一步精制。精制的方法很多，初步純化中的某些操作，如沉淀、超濾等也可應用于精制中。大分子(蛋白質)和小分子物質的精制方法有類似之處，但側重點有所不同，大分子物質的精制依賴于色層分離，而小分子物質的精制常常利用結晶操作。（五）、高度純化(精制)經初步純化后，體積大32

色層分離是一種高效的分離技術，過去僅用于實驗室中，最近10年來規(guī)模逐漸擴大而應用于工業(yè)上。

原理：操作是在柱中進行，包含兩個相——固定相和移動相，物質在兩相間分配情況不同，在柱中的運動速度也不同而獲得分離。A色層分離色層分離是一種高效的分離技術，過去僅用于實驗室33色層分離的類型色層分離的類型34結晶的先決條件是溶液達到過飽和。方法：加入某些物質，使溶解平衡發(fā)生改變，例如調pH；

將溶液冷卻或將溶劑蒸發(fā)：正確控制溫度、溶劑的加入量和加料速度可以控制晶體的生長，以有利于結晶的選擇性和利用分離。

適用范圍：主要用于低分子量物質的純化。

舉例：例如抗生素。青霉素G系用醋酸丁酯從發(fā)酵液中萃取出來，然后加入醋酸鉀的酒精溶液以產生沉淀。檸檬酸在工業(yè)上用冷卻的方法進行結晶。B結晶結晶的先決條件是溶液達到過飽和。方法：B結35（六）、成品加工

根據產品應用時的要求，一般經提取和精制后，最后還需要一些加工步驟。例如濃縮、無菌過濾和去熱原、干燥、加入穩(wěn)定刑等。如果最后要求的是結晶性產品，則濃縮、無菌過濾和去熱原等步驟系放在結晶之前，但干燥常常是最后一道工序。（六）、成品加工根據產品應用時的要求，一般經36A、濃縮濃縮可以采用升膜或降膜式的薄膜蒸發(fā)(停留時間為lmin左右)。對熱敏性物質可采用離心薄膜蒸發(fā)器(停留時間為1一l0s)，而且可處理粘度較大的物料。最近發(fā)展起來的膜技術，也可應用于濃縮，對大分子溶液的濃縮可以用超濾膜，對小分子溶液的濃縮可用反滲透膜。應用膜技術的優(yōu)點是能耗低，成本較低。A、濃縮濃縮可以采用升膜或降膜式的薄膜蒸37

熱原：是脂多糖類物質，從細菌的細胞壁產生，注入體內會使體溫升高。

傳統(tǒng)去熱原方法：蒸餾或石棉板過濾，但前者只能用于產品能蒸發(fā)或冷凝的場合，后者對勞動保護和產品質量都有一定問題。當產品分子量在1000以下，用截斷分子量為10000的超濾膜除去熱原是很有效的，同時也達到了無菌要求。B、無菌過濾和去熱原熱原：是脂多糖類物質，從細菌的細胞壁產生，注38C、干燥真空干燥：效率不高，需要時間較長。紅外線干燥：雖然裝置簡單，但溫度較高。氣流干燥和沸騰干燥：效率較高，但物料所處溫度也較高。噴霧干燥：雖然溫度也較高，但干燥速度快，干燥時間一般只需幾秒鐘，在干燥器中停留時間小于1分鐘。冷冰干燥：溫度低，不會使物料失活，最安全，但處理量小，操作時間較長(一般不會低于8h)，且裝置復雜、費用昂貴。C、干燥真空干燥：效率不高，需要時間較長。39五、生物技術下游加工過程的發(fā)展趨向(1)、基礎理論研究①、研究非理想溶液中溶質與添加物料之間的選擇性反應機理．以及系統(tǒng)外各物理因子對選擇性的影響效應，從而研制高選擇性的分離劑，改善對溶質的選擇性。五、生物技術下游加工過程的發(fā)展趨向(1)、基礎理論研究40②、研究界面區(qū)的結構、控制界面現象和探求界面現象對傳質機理的影響，從而指導改善具體單元操作及過程速度，如改善萃取或膜分離操作和結晶速度等。作為生化分離工程設計基礎的熱力學和動力學等基礎理論幾乎還是空白，常常依靠中試加以解決，所以必須加大力度展開這方面的研究。②、研究界面區(qū)的結構、控制界面現象和探求界面41③、下游加工過程數學模型的建立。在化學工業(yè)中，數學模擬技術的使用已有多年的歷史，但是在生化分離工程上，還剛剛開始，需要發(fā)展和完善，獲得合適的過程模擬軟件，以對下游加工過程進行分析、設計和技術經濟評估等。③、下游加工過程數學模型的建立。42(2)、完善、研究、開發(fā)新型和經濟高效的下游加工技術①、正確對待“新”、“老”分離技術，努力推進多種分離、純化技術的結合。生物技術產品的下游加工過程，既包括了歷時已100多年的若干傳統(tǒng)的化工單元操作，如精餾、干燥、吸收等，也包括了諸如膜分離、親和反應等新的單元操作，其中已得到工業(yè)應用的單元操作，大體上可用圖1．3來說明。(2)、完善、研究、開發(fā)新型和經濟高效的下游加工技術43由圖1．3可以看出各種單元操作目前的“技術成熟度”(橫坐標)與“工業(yè)應用度“(縱坐標)之間的近似關系。由圖1．3可以看出各種單元操作目前的“技術成44要積極推廣應用新技術：1、膜技術的推廣使用2、親和技術的推廣使用3、優(yōu)質層析介質的研究要積極推廣應用新技術：1、膜技術的推廣使用45當前下游加工過程發(fā)展的一個主要傾向是:多種分離、純化技術相結合.也包括新、老技術的相互交叉、滲透與融合．形成所謂融合技術(子代技術).當前下游加工過程發(fā)展的一個主要傾向是:多種分46例如：

萃取與離子交換相結合，形成了溶劑浸漬樹脂和萃淋樹脂分離技術；

例如：47又如:膜分離與親和配基相結合，形成了親和膜分離過程離心分離與膜分離過程相結合，形成了膜離心分離過程.又如:48這類技術具有選擇性好、分離效率高、下游加工過程步驟簡化、能耗低、加工過程水平高等優(yōu)點，是今后的主要發(fā)展方向，近年來研究較多、并且有較大實用價值的過程。這類技術具有選擇性好、分離效率高、下游加工49②、生物技術下游工程與上游工程相結合。生物工程作為一個整體，上、中、下游要互相配合。上游方面要注意為下游提取方便創(chuàng)造條件。②、生物技術下游工程與上游工程相結合。50例如：將胞內產物變?yōu)榘猱a物；在細胞中高水平的表達形成細胞內的包涵體，在細胞破碎后，在低離心力下即能沉降；利用基因工程方法，使尿抑胃素上接上幾個精氨酸殘基，使其堿性增強，易為陽離子交換劑所吸附等。例如：51發(fā)酵與分離耦合過程的研究是研究熱點之一。早在20世紀70年代，就開始用于乙醇的發(fā)酵過程中，取得了滿意效果，近年來逐步用于好氧發(fā)酵。

優(yōu)點：

可以解除終產物的反饋抑制效應，提高轉化率，同時可簡化產物提取過程，縮短生產周期，增加產率，收到一舉數得的