苯磺酸氨氯地平血漿生物樣品檢測方法的改進

苯磺酸氨氯地平血漿生物樣品檢測方法的改進

苯磺酸氨基丙烯酸酯是一種新型抗劑二羥吡啶鈣離子抗劑。對血管的選擇性很高。主要用于周長手術(shù)，也可擴張冠狀動脈和腎臟動脈。該藥物適用于各型高血壓的治療,也可用于穩(wěn)定型心絞痛患者。目前,已有多篇文獻報道苯磺酸氨氯地平血漿生物樣品檢測方法,主要包括高效液相色譜紫外檢測(HPLC-UV)材料和方法藥物和試劑結(jié)果1內(nèi)源性基質(zhì)的提取回收率結(jié)果表明,不同的堿化劑對提取回收率存在影響,但對基質(zhì)效應(yīng)影響甚微。圖2A表明飽和碳酸氫鈉和碳酸鈉對基質(zhì)效應(yīng)無明顯影響,但在飽和碳酸鈉條件下,分析物提取回收率更高。由圖2B可知,飽和碳酸鈉不同用量對提取回收率有一定的影響,當堿化劑的用量從40μL增加至80μL后,高濃度質(zhì)控樣品氨氯地平提取回收率從58%升高至72%,但飽和碳酸鈉不同用量對基質(zhì)效應(yīng)影響沒有顯著差異(圖2C)。不同萃取溶劑的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)也存在明顯差別,結(jié)果見圖2D。正己烷萃取處理的血漿樣品基質(zhì)效應(yīng)最低,但其提取回收率僅為25%。與乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚相比,甲基叔丁基醚可明顯改善基質(zhì)效應(yīng),且具有較高的提取回收率。此外,萃取時間不會明顯影響基質(zhì)效應(yīng)(圖2E)與提取回收率(圖2F)。改變色譜分離條件可顯著降低基質(zhì)效應(yīng)(圖2G)。采用等度洗脫方式,低、中、高濃度質(zhì)控樣品基質(zhì)因子分別為96%、79%和72%,采用梯度洗脫方式低、中、高濃度基質(zhì)因子分別為94%、96%和94%提示血漿基質(zhì)效應(yīng)可通過改變色譜分離條件實現(xiàn)。如圖3所示,在等度洗脫條件下,分析物的保留時間為1.4min。柱后灌注的結(jié)果表明在分析物保留時間前后質(zhì)譜響應(yīng)信號均被抑制,且在2.5min處仍存在明顯的信號抑制,表明血漿中內(nèi)源性基質(zhì)對質(zhì)譜信號存在顯著的影響。改用梯度洗脫分析物的保留時間延長至1.7min,但峰形明顯改善。比較等度洗脫與梯度洗脫模式下定量下限信噪比,檢測靈敏度提高2.5倍。此外,影響基質(zhì)效應(yīng)的內(nèi)源性可與分析物實現(xiàn)分離,在此條件下的分析物保留時間處無質(zhì)譜信號抑制現(xiàn)象。2方法學的檢驗2.1專業(yè)分析物和內(nèi)標的保留時間均約為1.7min,空白血漿樣品的色譜圖中沒有出現(xiàn)干擾峰,在本條件下待測物的分離與測定不受影響。2.2標準曲線和定量限結(jié)果表明,苯磺酸氨氯地平在0.1~20.0μg?L2.3剩余效果在最高濃度校正標樣進樣分析完成后,進樣分析一個空白樣品,空白樣品色譜圖中未發(fā)現(xiàn)分析物與內(nèi)標殘留,本方法不存在殘留效應(yīng)。2.4準確度和精密度苯磺酸氨氯地平定量下限、低、中、高濃度質(zhì)控樣品的批內(nèi)與批間精密度和準確度相對標準差(RSD)均小于15%,定量下限相對偏差(|RE|)在20%內(nèi),低、中、高濃度質(zhì)控樣品|RE|<11%。2.5加收率驗證苯磺酸氨氯地平回收率在83.5%~88.2%之間,內(nèi)標回收率為88.3%。低、中、高濃度苯磺酸氨氯地平和內(nèi)標的基質(zhì)因子分別為(93.9±1.8)%,(95.8±4.9)%,(93.9±1.5)%和(97.9±5.3)%。2.6穩(wěn)定性2.7交叉干擾3人體藥代動力學研究與生物等效評估藥代動力學參數(shù)結(jié)果見表1。AUC綜上所述,受試制劑與參比制劑具有生物等效性,受試制劑與參比制劑為生物等效制劑。內(nèi)源性基質(zhì)的選擇在人體生物等效性或臨床藥代動力學試驗中,LC-MS/MS技術(shù)被廣泛應(yīng)用,而基質(zhì)效應(yīng)也是檢測過程中不可忽視的問題目前常用的樣品前處理方法包括蛋白沉淀,液液萃取和固相萃取等。蛋白沉淀法由于氨氯地平分子式中有兩個酯基團,遇強堿(如氫氧化鈉)不穩(wěn)定。參考相關(guān)文獻,本研究考察了飽和碳酸鈉和碳酸氫鈉兩種弱堿對提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)的影響。在飽和碳酸鈉作用下,血漿中氨氯地平更多以分子形式存在,有利于氨氯地平從血漿樣品向有機相的轉(zhuǎn)移,提高提取回收率。飽和碳酸鈉和碳酸氫鈉對基質(zhì)效應(yīng)影響沒有顯著差異。本實驗改變樣品前處理方法與選用同位素內(nèi)標可改善相對基質(zhì)效應(yīng)、提高實驗檢測的精密度,但絕對基質(zhì)效應(yīng)與準確度都不能得到改善目前,評價基質(zhì)效應(yīng)的方法主要有柱后灌注法和提取后加入法。柱后灌注法能直觀地顯示內(nèi)源性基質(zhì)對待測物在色譜保留時間處質(zhì)譜檢測信號響應(yīng)的影響,為提取后加入法評價基質(zhì)效應(yīng)起到很好的補充作用。本實驗采用柱后灌注法證明血漿中內(nèi)源性基質(zhì)在等度洗脫的條件下對氨氯地平分析物色譜保留前后均存在明顯抑制情況,提示可通過改變色譜分離條件改善血漿中內(nèi)源性基質(zhì)對質(zhì)譜檢測信號的影響。本研究采用改變色譜條件由原來的等度洗脫轉(zhuǎn)為梯度洗脫,利用色譜柱分離內(nèi)源性干擾物和分析物,解決了本方法中存在的基質(zhì)效應(yīng)問題。在分析開始,利用高水相將極性較大、保留較弱的內(nèi)源性物質(zhì)先洗脫;再緩慢升至高有機相,讓分析物在此過程中被洗脫;分析物洗脫后再將高有機相維持0.7min,使得極性較小的內(nèi)源性物質(zhì)洗脫,可避免其對后續(xù)樣品分析的干擾。相比于等度洗脫,梯度洗脫方法同時考慮到基質(zhì)中弱極性和強極性內(nèi)源性干擾物,在避開內(nèi)源性干擾物對本分析樣品干擾的同時也消除了弱極性物質(zhì)如磷脂等對后續(xù)樣品檢測的干擾。柱后灌注結(jié)果也直觀證明,在梯度洗脫條件下內(nèi)源性基質(zhì)對氨氯地平分析物檢測不存在干擾現(xiàn)象。由于氨氯地平分子式中的1,4-二氫吡啶環(huán)在光照下易發(fā)生二氫吡啶環(huán)芳構(gòu)化反應(yīng),所以本研究考察了苯磺酸氨氯地平工作溶液光照6h穩(wěn)定性。結(jié)果表明,在日光燈下照射6h,苯磺酸氨氯地平的穩(wěn)定性控制在(98.24±3.36)%到(99.96±3.66)%之間,其穩(wěn)定性不受光照的干擾,所以實驗過程不需要馮仕銀等本文在已報道方法的基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化,比較系統(tǒng)地研究了不同影響因素對本實驗中基質(zhì)效應(yīng)的影響,考察了苯磺酸氨氯地平的光穩(wěn)定性,通過優(yōu)化色譜分離條件消除基質(zhì)效應(yīng)對本實驗準確定量的影響建立了經(jīng)濟、方便、特異、準確、可信的定量分析方法,可用于苯磺酸氨氯地平人體生物等效性研究。苯磺酸氨氯地平對照品(結(jié)構(gòu)式見圖1A,含量≥99.9%),由中國食品藥品檢定研究院提供;內(nèi)標d電噴霧離子源和高效液相色譜儀API4000Qtrap,AB四級桿線性離子阱混合質(zhì)譜儀:美國AppliedBiosystemsSCIEX公司,配備電噴霧離子源(electrosprayionization,ESI)以及Analyst1.6.1數(shù)據(jù)處理軟件;日本Shimadzu公司ProminenceUFLC型高效液相色譜儀:包括LC-30AD系統(tǒng)泵;本實驗中用到的其他設(shè)備包括分析天平(十萬分之一),藥動學分析軟件為DAS2.1.1。色譜柱及預(yù)柱選用WelchUltimateXB-C18色譜柱(100mm×2.1mm,3μm);預(yù)柱為菲羅門C18保護柱(4mm×2.0mm,3μm);柱溫為40℃;用2mmol·L溶液制備對照品溶液:用甲醇配制10.0g·L甲基叔丁基醚法精密吸取空白血漿200μL,置2mL離心管中,加入飽和碳酸鈉溶液80μL,渦旋30s,再加入甲基叔丁基醚1mL,渦旋混合10min,于4℃10000r·minlc-ms/ms分析精密吸取待測血漿200μL,置2mL離心管中,精密加入內(nèi)標工作液20μL,渦旋30s后,加入飽和碳酸鈉溶液80μL,渦旋30s,然后按照“空白血漿樣品處理”方法處理,進行LC-MS/MS分析。對基本影響的研究堿性劑的選擇和劑量的優(yōu)化按照上述血漿樣品處理方法,考察飽和碳酸氫鈉和碳酸鈉以及不同用量飽和碳酸鈉作用下的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)。萃取劑的篩選選用乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、正己烷以及甲基叔丁基醚作為萃取劑,考察不同萃取劑對基質(zhì)效應(yīng)和回收率的影響。萃取時間的影響分別在等度洗脫與梯度洗脫條件下,考察渦旋萃取3min與10min對基質(zhì)效應(yīng)和回收率的影響。柱后注射法評價基質(zhì)效應(yīng)采用柱后灌注法專業(yè)考察6份來自不同個體的空白血漿樣品、空白血漿加苯磺酸氨氯地平和內(nèi)標樣品的色譜圖觀察圖譜在氨氯地平和內(nèi)標保留時間處是否出現(xiàn)干擾峰。標準曲線取空白血漿200μL,加入內(nèi)標工作溶液20μL,配制苯磺酸氨氯地平分析物系列濃度的血漿校正標樣,以分析物峰面積A限制平行配制6份0.1μg?L剩余效果按照0.1μg?L準確度和精度取苯磺酸氨氯地平低、中、高濃度的血漿質(zhì)控樣品,每一濃度配制6份樣品,連續(xù)測定3批,計算批內(nèi)、批間準確度與精密度。提取回收率與基本效果之間的關(guān)系分別配制苯磺酸氨氯地平低、中、高3個濃度(0.3、3.0和16.0μg?L對照品穩(wěn)定性考察考察苯磺酸氨氯地平低、中、高3個血漿樣品室溫放置6h、-80℃凍融循環(huán)3次、-80℃冷凍放置80天、4℃放置24h穩(wěn)定性以及苯磺酸氨氯地平對照品溶液室溫放置24h、光照6h、儲備液于-80℃放置3個月穩(wěn)定性。將各樣品按上述考察條件放置后,進行處理分析。計算血漿樣品在上述條件下的準確度,考察其穩(wěn)定性。交叉干擾分別配制含20.0μg?L血樣、血漿的準備健康男性受試者21名入選并隨機分為兩組,一組11人,另一組10人。由本人簽署知情同意書,經(jīng)華中科技大學同濟醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會批準。采用單劑量雙交叉試驗,清洗期為3周。受試者于試驗前一日晚餐后開始禁食,試驗當日晨間空腹服用宜昌人福藥業(yè)有限責任公司研制的苯磺酸氨氯地平片(受試制劑,5mg/片)2片或輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)的苯磺酸氨氯地平片(商品名:絡(luò)活喜,參比制劑