細(xì)胞生物學(xué)課件

LncRNAwiresupHippoandHedgehogsignalingtoreprogrammeglucosemetabolism

LncRNA連接Hippo和Hedgehog信號重新編程葡萄糖代謝匯報人：蘭夢嬌學(xué)號：18213035LncRNAwiresupHippoandHedg1背景介紹三陰乳腺癌LncRNAHipposignalingHedgehogsignaling背景介紹三陰乳腺癌2三陰乳腺癌三陰乳腺癌的癌組織免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果為雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和原癌基因Her-2均為陰性的乳腺癌，預(yù)后與其他類型相比較差，且復(fù)發(fā)迅速。肺轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高。三陰乳腺癌三陰乳腺癌的癌組織免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果為雌激素受體3LncRNA

長鏈非編碼RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn),長鏈非編碼RNA的表達(dá)或功能異常具體表現(xiàn)在序列和空間結(jié)構(gòu)上的異常、表達(dá)水平的異常、與結(jié)合蛋白相互作用的異常等它們在癌癥中調(diào)控染色質(zhì)結(jié)合蛋白，在細(xì)胞核中形成核信號復(fù)合物，控制蛋白細(xì)胞定位，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。因此，他們被認(rèn)為是癌癥潛在的治療靶點

LncRNA

長鏈非編碼RNA(Longnon-codin4細(xì)胞生物學(xué)ppt課件5Hipposignaling

Hippo通路是一條由一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成的激酶鏈。主要包括三部分:上游調(diào)控元件(NF2、Mer等)、核心組件(主要是Mst1/2、Lats1/2)及下游效應(yīng)分子(YAP)。

在正常機(jī)體內(nèi),活化的Mst1/2可以磷酸化并激活其底物L(fēng)ats1/2,活化的Lats1/2可以直接磷酸化下游效應(yīng)分子YAP,磷酸化的YAP與細(xì)胞質(zhì)中14-3-3蛋白結(jié)合滯留于胞漿中而無法進(jìn)入細(xì)胞核,從而喪失作為轉(zhuǎn)錄輔助因子的功能Hipposignaling

Hippo通路是一條由一系6Hedgehogsignaling

在胚胎發(fā)育和胚胎形成后細(xì)胞的生長和分化過程中都起著重要的作用，控制著細(xì)胞的生長與增殖，通路由分泌糖型配體Hedgehog，跨膜蛋白受體PTC和Smo，核轉(zhuǎn)錄因子GLI蛋白及下游靶基因組成。

Ptc抑制Smo蛋白活性，從而抑制下游通路，這時下游的Gli蛋白在蛋白酶體內(nèi)被截斷，并以羧基端被截斷的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Ptc和Hh結(jié)合以后，解除對Smo的抑制作用，促使Gli蛋白與PKA及一些未知因子與微管形成大分子復(fù)合物，使得全長Gli蛋白進(jìn)入核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。

Hedgehogsignaling

在胚胎發(fā)育和胚胎形成后7

研究發(fā)現(xiàn)BCAR4是TNBC中上調(diào)的lncrna之一，TNBC轉(zhuǎn)移需要BCAR4通過促進(jìn)Hedgehog信號通路。我們發(fā)現(xiàn)BCAR4是YAP的直接靶點，需要YAP通過GLI2依賴性Hedgehog信號通路促進(jìn)糖酵解。從機(jī)理上講，BCAR4/GLI2通過上調(diào)HK2和PFKFB3兩種糖酵解酶來重新編程糖代謝。研究表明，特異性降低葡萄糖氧化會增加腫瘤轉(zhuǎn)移。因為YAP和BCAR4都有利于糖酵解和腫瘤轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是否需要YAP-BCAR4糖酵解，有待進(jìn)一步闡明。研究發(fā)現(xiàn)BCAR4是TNBC中上調(diào)的lncrna之一，T8細(xì)胞生物學(xué)ppt課件9BCAR4作為YAP下游基因的確定為了闡明可能參與乳腺癌代謝的YAP下游靶基因，我們分析了發(fā)表的一篇YAP微陣列數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來自于MCF10A穩(wěn)定過表達(dá)載體、野生型YAP、YAP活性突變體(5SA)和YAP非活性突變體(S94A)。首先，在基因轉(zhuǎn)錄水平上，YAP-5SA穩(wěn)定細(xì)胞＞野生型YAP穩(wěn)定細(xì)胞＞YAP-S94A和載體控制穩(wěn)定細(xì)胞，建立一組YAP正調(diào)控的基因其次，我們通過參考TCGA數(shù)據(jù)庫和相關(guān)的出版物，優(yōu)先選擇在癌癥中高度表達(dá)的基因BCAR4是一種lncRNA，它參與了與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的Hedgehog級聯(lián)反應(yīng)，被確定為潛在的YAP下游目標(biāo)。細(xì)胞生物學(xué)ppt課件10一、LncRNABCAR4是YAP的轉(zhuǎn)錄靶點YAP的過表達(dá)顯著誘導(dǎo)了BCAR4及其他YAP下游靶基因的轉(zhuǎn)錄在此過程中需要YAP的轉(zhuǎn)錄活性，因為YAP或YAP活性突變體(YAP-5SA)過表達(dá)顯著誘導(dǎo)BCAR4的轉(zhuǎn)錄，而非活性突變體(YAP-s94a)則沒有一、LncRNABCAR4是YAP的轉(zhuǎn)錄靶點YAP的過表達(dá)11在MDA-MB-231細(xì)胞中，YAP的下調(diào)抑制了BCAR4和YAP下游基因的轉(zhuǎn)錄，通過對BCAR4啟動子分析，發(fā)現(xiàn)有兩個YAP/TEADbinding位點在MDA-MB-231細(xì)胞中，YAP的下調(diào)抑制了BCAR4和12在葡萄糖刺激下，對照組的BCAR4顯著增加。通過熒光酶素檢測，發(fā)現(xiàn)突變BCAR4啟動子中YAP/TEAD的結(jié)合位點，顯著降低了YAP/TEAD誘導(dǎo)的BCAR4的表達(dá)在葡萄糖刺激下，對照組的BCAR4顯著增加。13用乳腺癌組織陣列對乳腺腫瘤中YAP與BCAR4水平的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BCAR4的表達(dá)與YAP的表達(dá)呈正相關(guān)這些數(shù)據(jù)表明YAP-BCAR4軸可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮致癌作用。用乳腺癌組織陣列對乳腺腫瘤中YAP與BCAR4水平的相關(guān)性進(jìn)14二、YAP誘導(dǎo)糖酵解需要BCAR4葡萄糖攝取，乳酸生產(chǎn)以及細(xì)胞培養(yǎng)基酸化是測量糖酵解的指標(biāo)在TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中，對BCAR4或GLI2的過表達(dá)促進(jìn)了糖酵解過程。二、YAP誘導(dǎo)糖酵解需要BCAR4葡萄糖攝取，乳酸生產(chǎn)以及細(xì)15

在YAP活性突變細(xì)胞中，敲除BCAR4和GLI2，糖酵解被抑制

在YAP活性突變細(xì)胞中，敲除BCAR4和GLI2，糖酵解被16在YAP敲除細(xì)胞中，分別加入外源BCAR4、GLI2,糖酵解顯著提高因為YAP在促進(jìn)糖酵解和BCAR4轉(zhuǎn)錄方面起作用，BCAR4/GLI2信號可能參與YAP誘導(dǎo)的糖酵解在YAP敲除細(xì)胞中，分別加入外源BCAR4、GLI2,糖酵解17三、BCAR4/GLI2通過上調(diào)糖酵解酶HK2和PFKFB3促進(jìn)糖酵解為了識別這些參與糖代謝的BCAR4/GLI2調(diào)控基因，在MDA-MB-231細(xì)胞中檢測了一組糖代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BCAR4/GLI2主要增強(qiáng)了HK2和PFKFB3的表達(dá)。三、BCAR4/GLI2通過上調(diào)糖酵解酶HK2和PFKFB318為了驗證HK2和PFKFB3在YAP-5SA或BCAR4/GLI2誘導(dǎo)糖酵解中的作用，用HK2抑制劑與PFKFB3抑制劑對YAP-5SA或BCAR4/GLI2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)抑制HK2和PFKFB3可顯著抑制癌細(xì)胞對葡萄糖的攝取以及細(xì)胞增殖

由于HK2和PFKFB3都是糖酵解激活劑，表明HK2和PFKFB3是YAP-BCAR4/GLI2的潛在下游基因，是促進(jìn)糖酵解作用所必需的為了驗證HK2和PFKFB3在YAP-5SA或BCAR4/19四、HK2和PFKFB3是BCAR4/GLI2的直接下游基因

之前的研究表明BCAR4作為一種LNA，可以激活p300,導(dǎo)致組蛋白標(biāo)志物H3K27ac等乙?；瑥亩せ罨?。通過RNA純化(ChIRP)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)檢測，發(fā)現(xiàn)BCAR4/GLI2及p300和H3K27ac在葡萄糖刺激下均與HK2和PFKFB3的啟動子相關(guān)。表明，BCAR4/GLI2/p300復(fù)合物通過標(biāo)記為乙酰化的組蛋白直接激活了HK2和PFKFB3的轉(zhuǎn)錄。四、HK2和PFKFB3是BCAR4/GLI2的直接下游基因20五、BCAR4促進(jìn)YAP參與的腫瘤的發(fā)生

在乳腺腫瘤發(fā)生10天后，裸鼠每隔一天注射一次雜化LNA或BCAR4LNABCAR4和GLI2的下調(diào)明顯抑制了YAP-5SA誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，而YAP-5SA的過表達(dá)增加了MDA-MB-231移植瘤的生長。與使用LNA治療相比，在vivo優(yōu)化的使用LNAs中BCAR4的消耗明顯降低了YAP-5SA誘導(dǎo)的腫瘤的生長。五、BCAR4促進(jìn)YAP參與的腫瘤的發(fā)生

在乳腺腫瘤發(fā)生1021在移植瘤中證實了LNA介導(dǎo)的BCAR4下調(diào)

BCAR4的缺失降低了YAP-5SA誘導(dǎo)HK2和PFKFB3的上調(diào)

在移植瘤中證實了LNA介導(dǎo)的BCAR4下調(diào)

BCAR4的缺失22在異種移植腫瘤中，BCAR4的缺失降低了YAP-5SA誘導(dǎo)HK2和PFKFB3的表達(dá)

Ki67和cleavedcaspase-3分別提示增殖減少，凋亡增加

在異種移植腫瘤中，BCAR4的缺失降低了YAP-5SA誘導(dǎo)H23六、高YAP/BCAR4表達(dá)與乳腺癌患者臨床預(yù)后不良相關(guān)

通過檢測乳腺癌組織中BCAR4和YAP的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)高水平的BCAR4或YAP不利于乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存率，而BCAR4和YAP的低水平均有利于無復(fù)發(fā)生存率六、高YAP/BCAR4表達(dá)與乳腺癌患者臨床預(yù)后不良相關(guān)

通24

CYR61是一種細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白，處于外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，黏附，遷移，分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成等作用，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在乳腺癌患者樣本中，BCAR4的表達(dá)與YAP或下游基因CYR61的表達(dá)呈正相關(guān)這些數(shù)據(jù)提示YAP-BCAR4軸通過重新編程葡萄糖代謝參與乳腺癌的發(fā)生

CYR61是