藤本豆秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝研究

精品文檔-下載后可編輯藤本豆秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝研究【摘要】目的：研究藤本豆秸稈被稀硫酸預(yù)處理后，經(jīng)纖維素酶轉(zhuǎn)化，并利用混合菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝條件。方法：以吉林省九臺(tái)市郊當(dāng)年產(chǎn)藤本豆秸稈為研究對(duì)象，用1.0%的稀硫酸預(yù)處理，用里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶，在纖維素酶、熱帶假絲酵母、釀酒酵母共同作用下采用同步糖化共發(fā)酵法生產(chǎn)乙醇。結(jié)果纖維素酶生產(chǎn)的最適條件為：藤本豆秸稈由稀硫酸處理后，濾渣中添加適量營(yíng)養(yǎng)，接入1.5×107～2.0×107個(gè)/g底物TrichodermareeseiTJK108孢子懸浮液，于30℃固態(tài)培養(yǎng)7d。最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵周期72h，轉(zhuǎn)速120r/min，纖維素酶用量40IU/g（對(duì)底物），熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1，酵母菌接種量為10%。在最適發(fā)酵條件下，乙醇產(chǎn)率為0.30g/g（乙醇/藤本豆秸稈），比其他試驗(yàn)組產(chǎn)率都高。結(jié)論：藤本豆秸稈是價(jià)廉易得和來源豐富的可再生資源和能源，被纖維素酶轉(zhuǎn)化后可以生產(chǎn)乙醇部分替代石油。

【關(guān)鍵詞】藤本豆秸稈；纖維素酶；熱帶假絲酵母；釀酒酵母；乙醇

一、材料與方法

1.材料。藤本豆秸稈，取自吉林省九臺(tái)市郊，當(dāng)年產(chǎn)。菌種：纖維素酶產(chǎn)生菌（TrichodermareeseiTJK108）、釀酒酵母（SaccharomycescerevisiaeSQY-002），由吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。熱帶假絲酵母（Candidatropi

calis），購(gòu)于中國(guó)菌種保藏中心。液體種子培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基：取一定量預(yù)處理后的藤本豆秸稈，冷卻后用30%的NH4HCO3調(diào)節(jié)pH=4.8，并于121℃下濕熱滅菌20min。

2.藤本豆秸稈生產(chǎn)乙醇的總工藝流程（圖1）。（1）藤本豆秸稈的預(yù)處理。采用稀硫酸預(yù)處理玉米秸稈，將玉米秸稈風(fēng)干后磨碎，于75℃烘箱中烘一晝夜至水分含量恒定，與1.0%的稀硫酸按一定比例混合（固液比為1：10），121℃下蒸煮120min。（2）纖維素酶的生產(chǎn)―TrichodermareeseiTJK108的固態(tài)培養(yǎng)。采用固態(tài)發(fā)酵工藝。取預(yù)處理后的藤本豆秸稈，過濾，濾渣用水和丙酮洗至pH值呈中性，其主要成分為纖維素。添加0.2%KH2PO4，0.2%MgSO4?7H2O，3%（NH4）2SO4，0.2%吐溫-80，10%酒糟，調(diào)節(jié)pH值至4.8，含水量至70%，121℃滅菌60min，接入1.5×107～2.0×107個(gè)/g底物TrichodermareeseiTJK108孢子懸浮液，于30℃培養(yǎng)，發(fā)酵7d。

（3）菌種活化與稀釋。從試管斜面上分別取熱帶假絲酵母和釀酒酵母，在YEPD液體培養(yǎng)基中活化（150r/min，30℃，18h）血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并稀釋至108個(gè)細(xì)胞/ml。（4）酵。向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的纖維素酶，按10%（體積比，下同）的接種量接入一定比例的熱帶假絲酵母和釀酒酵母，根據(jù)影響發(fā)酵的條件進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，并選取乙醇產(chǎn)率（乙醇/藤本豆秸稈，g/g）作為測(cè)試指標(biāo)。一是最佳溫度的確定。藤本豆秸稈在不同溫度下進(jìn)行發(fā)酵（發(fā)酵周期為72h，轉(zhuǎn)速為120r/min，纖維素酶用量為40IU/g對(duì)底物，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1，酵母菌接種量為10%），分別測(cè)定乙醇產(chǎn)率，確定發(fā)酵的最佳溫度。二是最佳時(shí)間的確定。藤本豆秸稈在不同時(shí)間下進(jìn)行發(fā)酵（發(fā)酵溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為120r/min，纖維素酶用量為40IU/g對(duì)底物，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1，酵母菌接種量為10%），分別測(cè)定乙醇產(chǎn)率，確定發(fā)酵的最佳時(shí)間。三是最佳轉(zhuǎn)速的確定。藤本豆秸稈在不同轉(zhuǎn)速下進(jìn)行發(fā)酵（發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵周期為72h，纖維素酶用量為40IU/g對(duì)底物，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1，酵母菌接種量為10%），分別測(cè)定乙醇產(chǎn)率，確定發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速。四是最佳纖維素酶用量的確定。藤本豆秸稈在不同纖維素酶用量下進(jìn)行發(fā)酵（發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵周期為72h，轉(zhuǎn)速為120r/min，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1，酵母菌接種量為10%），分別測(cè)定乙醇產(chǎn)率，確定發(fā)酵的最佳纖維素酶用量。五是最佳酵母菌接種量的確定。藤本豆秸稈在不同酵母菌接種量下進(jìn)行發(fā)酵（發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵周期為72h，轉(zhuǎn)速為120r/min，纖維素酶用量為40I

U/g對(duì)底物，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1），分別測(cè)定乙醇產(chǎn)率，確定發(fā)酵的最佳酵母菌接種量。六是最佳酵母菌接種比例的確定。藤本豆秸稈在不同酵母菌接種比例下進(jìn)行發(fā)酵（發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵周期為72h，轉(zhuǎn)速為120r/min，纖維素酶用量為40IU/g對(duì)底物，酵母菌接種量為10%），分別測(cè)定乙醇產(chǎn)率，確定發(fā)酵的最佳酵母菌接種比例。（5）蒸餾。取100g發(fā)酵樣，加入200ml蒸餾水，緩慢蒸餾出100ml餾出液。

3.乙醇含量測(cè)定。采用氣相色譜法。

二、結(jié)果與分析

（一）稀硫酸預(yù)處理藤本豆秸稈的結(jié)果

采用稀硫酸預(yù)處理藤本豆秸稈，在主要成分中，半纖維素是第一個(gè)參與反應(yīng)的，木聚糖部分解聚和溶解，然后水解成木糖（反應(yīng)1），外源硫酸的存在對(duì)于木糖單體的形成尤為重要，若缺乏外源酸，就會(huì)形成木糖低聚物。該過程中，只有少量的纖維素發(fā)生水解反應(yīng)生成葡萄糖，而木質(zhì)素經(jīng)歷了解聚作用，但在水或酸中維持不溶解狀態(tài)。稀硫酸處理后，溶液中主要是半纖維素分解得到的木糖等五碳糖，粉狀固體中主要含有已分離開的纖維素和木質(zhì)素。正常條件下，纖維素的水解需要十分苛刻的條件，但是經(jīng)稀硫酸處理，半纖維素水解、纖維素和木質(zhì)素分離開后，可以大大增加纖維素的水解性，這時(shí)加入纖維素酶，纖維素酶先吸附到纖維素表面，然后其中的內(nèi)切酶在葡聚糖鏈的隨機(jī)位點(diǎn)水解底物產(chǎn)生寡聚糖，外切酶從葡聚糖鏈的還原或非還原端進(jìn)行水解產(chǎn)生纖維二糖，β-葡萄糖苷酶水解纖維素二糖為葡萄糖。這3類酶“協(xié)同作用”最終將纖維素降解為葡萄糖（反應(yīng)2）。反應(yīng)1（木聚糖的解聚反應(yīng)）：（C5H8O4）n+H2O（C5H8O4）（n-1）+C5H10O5，反應(yīng)2（在纖維素酶的作用下纖維素降解生成葡萄糖的反應(yīng)）：（C6H12O6）nnC6H12O6。

（二）纖維素酶的生產(chǎn)情況

在TrichodermareeseiTJK108的固態(tài)培養(yǎng)期間，每天測(cè)定1次酶活力。酶活力隨時(shí)間的變化見表1。固態(tài)培養(yǎng)過程中各主要影響因素的變化見表2。由表1可知，發(fā)酵前期（0～2d），由于孢子要萌發(fā)成菌絲，故纖維素酶生成較慢，酶活較低；發(fā)酵中期（2～7d），孢子已完全萌發(fā)成菌絲，菌絲代謝旺盛，纖維素酶大量生成，酶活增長(zhǎng)較快，酶活力在第7天時(shí)達(dá)到最高，為

333.4U/g底物；第8天以后再延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，菌體老化，纖維素酶活力增長(zhǎng)緩慢，呈下降趨勢(shì)?？梢?，纖維素酶產(chǎn)生菌（Tricho

dermareeseiTJK108）的固態(tài)培養(yǎng)時(shí)間以7d為最佳。

表1酶活力隨時(shí)間的變化

由表2可知，發(fā)酵第1天，纖維素、還原糖和培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)被消耗，菌體開始生長(zhǎng)；2～4d，當(dāng)菌體消耗30%左右還原糖后，其生長(zhǎng)開始進(jìn)入旺盛期，該階段為纖維素的主要消耗期，纖維素消耗了36%左右；4d后，纖維素的消耗開始減緩。產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值為4.8；0～2d，由于銨根離子被消耗，pH值迅速下降；2～4d，由于培養(yǎng)基中無機(jī)鹽金屬離子的緩沖作用，pH值基本維持在4.0左右；隨著纖維素酶的大量合成，到產(chǎn)酶末期，pH值迅速上升。纖維素酶主要是胞外酶。這表明隨著纖維素酶的合成，胞外蛋白質(zhì)隨即開始形成。

（三）發(fā)酵溫度對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響

由于藤本豆秸稈中含有47.2%的纖維素及20.6%的半纖維素，稀硫酸預(yù)處理藤本豆秸稈過程中半纖維素被水解成戊糖，主要為木糖，預(yù)處理纖維素再經(jīng)纖維素酶酶解成纖維二糖繼而在葡萄糖苷酶的作用下生成葡萄糖。若溫度較低，纖維素酶解速率較低，且乙醇發(fā)酵過程中所需要的各種酶酶活較低，影響乙醇產(chǎn)率；溫度過高，發(fā)酵過程中所需要的一些酶會(huì)因此失活，也影響乙醇產(chǎn)率。該試驗(yàn)采用混合菌種發(fā)酵使藤本豆秸稈水解成的葡萄糖及木糖均能發(fā)酵成乙醇。試驗(yàn)中所采用的熱帶假絲酵母與釀酒酵母最適發(fā)酵溫度分別為30℃與31℃。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度為32℃時(shí)乙醇產(chǎn)率較高。

（四）發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響

乙醇發(fā)酵需要一個(gè)合理的發(fā)酵周期，發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響著乙醇產(chǎn)率的高低。在發(fā)酵前12h內(nèi)，乙醇產(chǎn)率變化很?。粡?2h開始，乙醇產(chǎn)率迅速增加；當(dāng)達(dá)到72h左右時(shí)，乙醇產(chǎn)率達(dá)到最大值；發(fā)酵72h以后，乙醇產(chǎn)率開始降低。分析造成這種現(xiàn)象的原因：在發(fā)酵初期，酵母以發(fā)酵醪中的糖分為碳源，酵母不斷代謝糖分發(fā)酵成乙醇；發(fā)酵一段時(shí)間后，發(fā)酵醪中的糖分含量減少，酵母可能開始利用自身的代謝產(chǎn)物乙醇為碳源來維持自身的生長(zhǎng)和繁殖。所以，在利用該菌株生產(chǎn)乙醇過程中，應(yīng)該盡量控制好發(fā)酵時(shí)間，當(dāng)發(fā)酵達(dá)到72h時(shí)，就可終止發(fā)酵。

（五）轉(zhuǎn)速對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響

纖維素酶解需要與底物充分接觸；一定的轉(zhuǎn)速能保證纖維素底物與纖維素酶充分接觸；此外，由于菌株熱帶假絲酵母一般在“限氧”條件下發(fā)酵，這是由酵母本身的代謝方式所決定的。酵母對(duì)木糖的代謝分別依賴于：木糖還原酶將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇；木糖醇脫氫酶將木糖醇轉(zhuǎn)化為木酮糖；木糖激酶將木酮糖轉(zhuǎn)化為5-磷酸木酮糖，后者再經(jīng)3-磷酸甘油醛進(jìn)入糖酵解途徑，在木糖醇轉(zhuǎn)化成木糖酮的過程中，需要有氧的參與。一定的轉(zhuǎn)速可提供該酵母發(fā)酵所需要的溶解氧，轉(zhuǎn)速過高，可能會(huì)使發(fā)酵生成的一部分乙醇揮發(fā)掉，而且轉(zhuǎn)速過高，發(fā)酵液中的溶解氧增加，還可能導(dǎo)致生成的乙醇氧化成醋酸等其他產(chǎn)物。該試驗(yàn)的適宜轉(zhuǎn)速約為120r/min。

（六）纖維素酶用量對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響

預(yù)處理的藤本豆秸稈經(jīng)纖維素酶酶解成葡萄糖及纖維二糖，纖維素酶的用量直接決定著預(yù)處理玉米秸稈纖維素的最終水解情況及乙醇產(chǎn)率。纖維素酶最適作用條件為溫度50℃，pH=4.8，纖維素酶最適用量25IU/g。乙醇產(chǎn)率隨著纖維素酶量的增加而增加，當(dāng)酶活力達(dá)到45IU/g時(shí)，乙醇產(chǎn)率最高。分析原因可能是50℃時(shí)，溫度太高，不適于酵母的生長(zhǎng)代謝所致。因此，該試驗(yàn)中發(fā)酵溫度較低為30℃。這個(gè)溫度對(duì)于纖維素酶解所需最適溫度要低，會(huì)使纖維素酶解速率降低，所以纖維素酶的用量要高一些，以提高纖維素酶解速率，最優(yōu)量為45IU/g。盡管45IU/g是最優(yōu)的酶量，但是使用如此高活力的纖維素酶，在經(jīng)濟(jì)上是不合算的。當(dāng)纖維素酶活力從40IU/g增加到45IU/g時(shí)，乙醇產(chǎn)率增加甚微。因此，選用40IU/g纖維素酶濃度較為合適。

（七）酵母菌接種量對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響

酵母菌接種量對(duì)乙醇產(chǎn)率有一定的影響，接種量過低，菌體產(chǎn)生的生物量較少，發(fā)酵過程不充分，乙醇產(chǎn)率較低；接種量過高，增加了細(xì)胞的維持能需要，乙醇產(chǎn)率也無法積累到較高水平。接種量在10%時(shí)，乙醇產(chǎn)率最高。

（八）酵母菌接種比例對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響

采用混合菌種發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，2種菌的比例對(duì)乙醇產(chǎn)率有著一定的影響，熱帶假絲酵母既能發(fā)酵葡萄糖又能發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇，但其發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙醇能力較差，發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇能力較強(qiáng)，而釀酒酵母一般不能發(fā)酵木糖，但它能快速有效地發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乙醇。采用混合菌種發(fā)酵就很好地解決了預(yù)處理藤本豆秸稈酶解生產(chǎn)乙醇的技術(shù)問題，同時(shí)由于纖維素酶解藤本豆秸稈是一個(gè)復(fù)雜的酶解過程，而預(yù)處理藤本豆秸稈水解液中木糖的含量很高，所以采用混合菌種發(fā)酵時(shí)具有較強(qiáng)發(fā)酵木糖能力的熱帶假絲酵母比例要高一些。熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比為2：1時(shí)，乙醇產(chǎn)率最高。

三、結(jié)論

植物纖維資源是地球上分布最廣、含量最大、品種最多、價(jià)格低廉且可再生時(shí)間短的有機(jī)資源之一，利用可再生的植物纖維資源生產(chǎn)燃料乙醇對(duì)于緩解能源危機(jī)具有重大意義。該試驗(yàn)得到的纖維素酶生產(chǎn)的最適條件是：藤本豆秸稈由稀硫酸處理后，濾渣中添加適量營(yíng)養(yǎng)，接入15×107～2.0×107個(gè)/g底物TrichodermareeseiTJK108孢子懸浮液，于30℃固態(tài)培養(yǎng)7d。發(fā)酵的最適條件為：發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵周期72h，轉(zhuǎn)速120r/min，纖維素酶用量40IU/g對(duì)底物，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1，酵母菌接種量10%，在該條件下乙醇產(chǎn)率最高為0.30g/g。藤本豆秸稈生產(chǎn)乙醇是利用再生資源解決液體燃料的一個(gè)國(guó)際性大問題，不少國(guó)家已在多年以前就開展該項(xiàng)工作。但目前還沒有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，主要是經(jīng)濟(jì)方面的問題。因此，今后應(yīng)開發(fā)預(yù)處理新技術(shù)，培育價(jià)廉高活力的新型纖維素酶及五碳糖和六碳糖同步發(fā)酵的新菌種，研發(fā)出流程短、效率高和能耗低的玉米秸稈生產(chǎn)乙醇新工藝，從而降低乙醇生產(chǎn)成本，這將是今后科研的主攻方向。

參考文獻(xiàn)

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