凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵枸杞汁工藝優(yōu)化及主要成分變化分析

凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵枸杞汁工藝優(yōu)化及主要成分變化分析

枸杞是茄子科的一種多年生落葉灌木。又稱(chēng)貢品果實(shí)、血枸杞和枸杞。它不含毒素，可以長(zhǎng)期食用。它是衛(wèi)生部出版的具有藥物起源的中藥之一。但是,利用凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)對(duì)枸杞汁發(fā)酵的研究還未見(jiàn)報(bào)道。凝結(jié)芽孢桿菌是兼性厭氧菌,在有氧及無(wú)氧的環(huán)境下都可生長(zhǎng),能適應(yīng)低氧的腸道環(huán)境,對(duì)酸和膽汁有較高的耐受性,能夠進(jìn)行乳酸發(fā)酵,產(chǎn)生的L-乳酸能降低腸道pH值本試驗(yàn)以寧夏枸杞干果為主要材料,進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵枸杞汁工藝條件優(yōu)化并分析發(fā)酵期間枸杞汁中總糖、總黃酮、蛋白質(zhì)、乳酸等主要成分的變化,旨在研制出一種能夠調(diào)節(jié)腸道功能的凝結(jié)芽孢桿菌枸杞汁,進(jìn)而提高發(fā)酵枸杞汁的營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味,為凝結(jié)芽孢桿菌在發(fā)酵枸杞汁方面的應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。1材料和方法1.1菌株和培養(yǎng)基枸杞:中寧枸杞;凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans):中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(chinacenterofindustrialculturecollection,CICC),菌株編號(hào)CICC21735。營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutrientbroth,NB)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrientagar,NA)培養(yǎng)基:青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;白砂糖、小蘇打:市售;D-異抗壞血酸鈉(食品級(jí)):江西省德興市百勤異VC鈉有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、牛血清白蛋白(純度≥98%)、考馬斯亮藍(lán)G-250:北京索萊寶科技有限公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2儀器和檢測(cè)方法BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;HSU-10手持糖量計(jì):上海精密儀器儀表有限公司;V-5100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海精科實(shí)業(yè)有限公司;PB-IO型精密PH計(jì):賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1護(hù)色、滅菌挑選完整無(wú)霉變的干枸杞,稱(chēng)質(zhì)量,清洗后瀝水,將浸泡的枸杞放入攪拌機(jī)中打漿,反復(fù)攪打3次使其細(xì)膩,加入混合液體積0.4%D-異抗壞血酸鈉護(hù)色,用小蘇打調(diào)節(jié)pH至6.5~7.0,巴氏滅菌。將凝結(jié)芽孢桿菌接種到滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,在恒溫箱中培養(yǎng)(發(fā)酵溫度30℃),連續(xù)傳代2~3次,使活力最終達(dá)到最佳,在三角瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)制備生產(chǎn)發(fā)酵劑。1.3.2發(fā)酵溫度對(duì)枸杞汁乳酸含量與感官評(píng)分的影響將枸杞汁加入5%的白砂糖,放入65℃的水浴鍋中殺菌30min,按照接種量6%,發(fā)酵溫度30℃,進(jìn)行發(fā)酵,考察靜置發(fā)酵(0r/min)和微氧發(fā)酵(50r/min)時(shí)枸杞汁的乳酸含量與感官評(píng)分。1.3.3發(fā)酵溫度對(duì)枸杞汁乳酸含量與感官評(píng)分的影響將枸杞汁加入5%的白砂糖,放入65℃的水浴鍋中殺菌30min,按照接種量6%,轉(zhuǎn)速50r/min,發(fā)酵溫度30℃進(jìn)行發(fā)酵,每2h測(cè)定其乳酸含量與感官評(píng)分。固定發(fā)酵時(shí)間10h,發(fā)酵溫度30℃,考察不同接種量(4%、6%、8%、10%、12%)時(shí)枸杞汁的乳酸含量與感官評(píng)分。固定接種量6%,發(fā)酵時(shí)間10h,發(fā)酵溫度30℃,考察不同白砂糖的添加量(3%、4%、5%、6%、7%)時(shí)枸杞汁的乳酸含量與感官評(píng)分。固定接種量6%,發(fā)酵時(shí)間10h,白砂糖添加量5%,轉(zhuǎn)速為0,考察不同發(fā)酵溫度(30℃、33℃、36℃、39℃、42℃)時(shí)枸杞汁的乳酸含量與感官評(píng)分。固定接種量6%,發(fā)酵時(shí)間10h,發(fā)酵發(fā)酵溫度30℃,考察不同轉(zhuǎn)速(25r/min、50r/min、75r/min、100r/min)時(shí)枸杞汁的乳酸含量與感官評(píng)分。1.3.4乳酸發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行響應(yīng)面Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),選擇接種量、白砂糖添加量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速這4個(gè)因素,建立4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn),以乳酸含量與感官評(píng)分為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化。兩個(gè)響應(yīng)值所占權(quán)重各為50%,響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平如表1。1.3.5發(fā)酵方式對(duì)發(fā)酵枸杞汁品質(zhì)的影響乳酸含量的測(cè)定:使用SBA-40E生物傳感分析儀測(cè)定。感官評(píng)定:為評(píng)價(jià)不同發(fā)酵方式對(duì)制備的凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵枸杞汁感官評(píng)分的影響,由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的10人組成評(píng)分小組,從色澤、體態(tài)、香氣、口感4個(gè)方面對(duì)各枸杞汁樣品進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分細(xì)則如表2所示?？偺堑臏y(cè)定:采用苯酚-濃硫酸比色法2結(jié)果與分析2.1微氧發(fā)酵溫度對(duì)乳酸含量和感官評(píng)分的影響由圖1可知,當(dāng)靜置發(fā)酵(轉(zhuǎn)速為0)時(shí),乳酸菌生長(zhǎng)和繁殖速度較慢;當(dāng)微氧發(fā)酵(轉(zhuǎn)速為50r/min)時(shí),產(chǎn)生乳酸含量較高。而感官評(píng)分在微氧條件下明顯更高,凝結(jié)芽孢桿菌是兼性厭氧菌,在有氧及無(wú)氧的環(huán)境下都可生長(zhǎng),說(shuō)明微氧的環(huán)境下能夠促進(jìn)凝結(jié)芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖,進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸。綜合考慮選擇微氧條件進(jìn)行發(fā)酵。2.2枸杞果汁單因素試驗(yàn)結(jié)果2.2.1發(fā)酵期和發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸發(fā)酵的影響由圖2可知,前2h內(nèi)乳酸含量和感官評(píng)分變化比較緩慢,為凝結(jié)芽孢桿菌的繁殖和適應(yīng)期,在2~8h期間內(nèi),凝結(jié)芽孢桿菌利用發(fā)酵液中豐富的糖進(jìn)行乳酸發(fā)酵,產(chǎn)生大量乳酸,感官評(píng)分上升。8~10h內(nèi)指標(biāo)變化平緩,為發(fā)酵后期,凝結(jié)芽孢桿菌已將大部分糖轉(zhuǎn)化成乳酸。因此確定發(fā)酵結(jié)束周期為10h。2.2.2接種量對(duì)乳酸評(píng)分的影響如圖3所示,當(dāng)接種量為4%~8%時(shí),乳酸含量隨接種量的增加呈明顯上升的趨勢(shì)(P<0.05);當(dāng)接種量>8%之后,乳酸含量增長(zhǎng)變小。感官評(píng)分隨著接種量的增大呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為8%時(shí),乳酸含量為151mg/100mL,感官評(píng)分為78分?？紤]節(jié)約成本、簡(jiǎn)便操作等因素,選擇接種量為8%為最適接種量。2.2.3白砂糖添加量對(duì)發(fā)酵飲料的影響如圖4所示,隨著白砂糖添加量的升高,乳酸含量及感官評(píng)分均隨之升高;當(dāng)白砂糖添加量≥5%之后,發(fā)酵液的乳酸含量增長(zhǎng)變小,且感官評(píng)分開(kāi)始降低。白砂糖添加量為5%時(shí),乳酸含量為155mg/100mL,感官評(píng)分為91.2分。因此選取5%為最適白砂糖添加量。2.2.4發(fā)酵溫度對(duì)乳酸含量的影響如圖5所示,當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí),乳酸菌生長(zhǎng)和繁殖速度較慢,活菌數(shù)隨著溫度的升高而顯著增加(P<0.05);當(dāng)發(fā)酵溫度高于36℃之后,乳酸含量呈逐漸下降的趨勢(shì);發(fā)酵溫度在33~39℃時(shí),感官評(píng)分差異不顯著(P>0.05),而當(dāng)溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí),枸杞發(fā)酵液的感官評(píng)分均較低。當(dāng)發(fā)酵溫度為36℃時(shí),枸杞汁乳酸含量為160mg/100mL,感官評(píng)分為88分。綜合考慮選擇36℃為最佳發(fā)酵溫度。2.2.5轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵及風(fēng)味的影響如圖6所示,當(dāng)轉(zhuǎn)速為25~50r/min時(shí),乳酸菌生長(zhǎng)和繁殖速度較慢,乳酸含量隨著轉(zhuǎn)速的升高而增加(P<0.05)。當(dāng)轉(zhuǎn)速>50r/min之后,乳酸含量降低。凝結(jié)芽孢桿菌是兼性厭氧菌,在有氧及無(wú)氧的環(huán)境下都可生長(zhǎng),說(shuō)明微氧的環(huán)境下能夠促進(jìn)凝結(jié)芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖,進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸。在轉(zhuǎn)速為50~100r/min時(shí),感官評(píng)分明顯降低(P<0.05)。當(dāng)轉(zhuǎn)速為50r/min時(shí),枸杞發(fā)酵液的乳酸含量為158mg/100mL,感官評(píng)分為89分。綜合考慮選擇50r/min為最佳轉(zhuǎn)速。2.3反應(yīng)法優(yōu)化了結(jié)果枝管蘑菇的發(fā)酵過(guò)程2.3.1次多維模型根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,由Design-Expert10.0.7統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)出的試驗(yàn)方案如表3所示,兩個(gè)響應(yīng)值所占權(quán)重各為50%,得到綜合評(píng)價(jià)(Y)對(duì)自變量接種量(A)、白砂糖添加量(B)、發(fā)酵溫度(C)、轉(zhuǎn)速(D)為的回歸方程分別為:由表4可知,模型中P值<0.01,說(shuō)明本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型差異極顯著。失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)。模型決定系數(shù)R=0.9931,說(shuō)明乳酸含量和感官評(píng)分的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度,所以該模型擬合效果較好,可以用此模型分析和預(yù)測(cè)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵枸杞汁的發(fā)酵工藝。模型中接種量(A)、發(fā)酵溫度(C)、轉(zhuǎn)速(D)、接種量和白砂糖添加量交互項(xiàng)(AB)、接種量和發(fā)酵溫度交互項(xiàng)(AC)、接種量和轉(zhuǎn)速交互項(xiàng)(AD)、白砂糖添加量和發(fā)酵溫度交互項(xiàng)(BC)、白砂糖和轉(zhuǎn)速交互項(xiàng)(BD)、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速交互項(xiàng)(CD)、接種量二次項(xiàng)(A2.3.2乳酸發(fā)酵條件響應(yīng)面曲面分析響應(yīng)面法是優(yōu)化存在多因素影響試驗(yàn)條件的尋優(yōu)方法,通過(guò)固定數(shù)量的試驗(yàn)次數(shù)連續(xù)的對(duì)試驗(yàn)因素進(jìn)行分析,并得到直觀的3D曲面圖進(jìn)而評(píng)價(jià)各因素之間的交互作用。根據(jù)軟件Design-Expert10.0.7獲得響應(yīng)值的3D曲面,分析各因素對(duì)乳酸含量的影響及各因素間的交互作用。根據(jù)等高線的形狀可以明顯地反映出試驗(yàn)因素之間交互作用顯著性的強(qiáng)弱,例如接種量、白砂糖添加量、發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。當(dāng)?shù)雀呔€的形狀為橢圓形或馬鞍形時(shí),說(shuō)明其交互作用顯著;當(dāng)?shù)雀呔€的形狀為圓形時(shí),說(shuō)明其交互作用不顯著由圖7可知,在交互作用對(duì)枸杞汁綜合評(píng)分影響中,接種量和白砂糖添加量、接種量和發(fā)酵溫度、接種量和轉(zhuǎn)速、白砂糖和發(fā)酵溫度、白砂糖添加量和轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速交互項(xiàng)均產(chǎn)生了顯著影響。2.3.3單因素驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)回歸方程求解,即乳酸含量達(dá)到最大值時(shí)的發(fā)酵條件為接種量8.34%,白砂糖添加量4.98%,發(fā)酵溫度36.32℃,轉(zhuǎn)速56.16r/min,最大乳酸含量達(dá)到161.66mg/100mL,感官評(píng)分為90.51分。為方便實(shí)際操作將試驗(yàn)條件定為接種量8%,白砂糖添加量5%,發(fā)酵溫度36℃,轉(zhuǎn)速50r/min,取三等分枸杞汁進(jìn)行平行驗(yàn)證試驗(yàn),驗(yàn)證試驗(yàn)所得平均乳酸含量為162mg/100mL,感官評(píng)分為91分。結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)響應(yīng)回歸方程擬合出的理論值與實(shí)際值比較吻合,證明用響應(yīng)面法可以有效的優(yōu)化凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵枸杞汁的工藝。2.4在最佳發(fā)酵條件下，枸杞汁的主要成分發(fā)生了變化對(duì)上述發(fā)酵枸杞汁進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定,結(jié)果表明,發(fā)酵10h后的枸杞活菌數(shù)為2.1×103枸杞發(fā)酵飲品的制備采用響應(yīng)面法對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵枸杞汁的條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了乳酸