產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究

-2--2-產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究摘要的：通過(guò)對(duì)金銀花不同組織器官內(nèi)生真菌的分離，篩選能產(chǎn)生綠原酸的菌株，通過(guò)菌株的篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得高產(chǎn)綠原酸的發(fā)酵菌株及培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。方法：從金銀花不同組織器官中分離內(nèi)生真菌，通過(guò)分離純化、發(fā)酵，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行TLC和HPLC分析，同時(shí)利用顯微觀察法對(duì)其進(jìn)行顯微鑒定，對(duì)篩選的高產(chǎn)綠原酸菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，并對(duì)菌株發(fā)酵液進(jìn)行抑菌學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：從金銀花中分離篩選到三株純化的的內(nèi)生真菌，其濃縮發(fā)酵液與對(duì)照品有相同的遷移率，保留時(shí)間與對(duì)照品保留時(shí)間一致，結(jié)果表明，三株純化獲得的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生綠原酸，分別屬于青霉屬、毛霉屬、曲霉屬。經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化■確定最圭發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為28°C,120r/min，震蕩培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)論：金銀花不同器官中具有豐富的內(nèi)生真菌，并有可能產(chǎn)生與宿主相同的活性成分綠原酸，純化的產(chǎn)綠原酸菌株的發(fā)酵液具有明顯的與金銀花相同的抑菌效果。［關(guān)鍵詞］：金銀花；內(nèi)生真菌；綠原酸；發(fā)酵縮寫詞表TLCthinlayerchromatography薄層色譜HPLChighperformanceliquidchromatography高效液相色譜PDApotato-dextrose-agarmedium馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDBpotato-dextrosebroth馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基目錄1前言TOC\o"1-5"\h\z1.1內(nèi)生菌與植物的關(guān)系41.2內(nèi)生菌天然藥物新資源及其展望.52問(wèn)題的提出63材料與方法73.1試劑73.2實(shí)驗(yàn)方法83?2?1菌株的篩選83?2?1?1實(shí)驗(yàn)材料的采集83.2.1.2樣品的消毒處理93.2.1.3表面消毒效果的檢測(cè)93.2.1.4分離與純化題目：產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究10題目：產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究10-2--2-3.2.1.5菌種的保藏3.2.2菌株次生代謝產(chǎn)物檢測(cè)103.2.2.1菌株的小樣培養(yǎng)103.2.2.2內(nèi)生菌發(fā)酵液的提取處理103.2.2.3薄層色譜法(TLC)檢測(cè)綠原酸113?2?2.4高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)綠原酸.113.2.3內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定113.2.4二次發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化123.2.4.1固體基本培養(yǎng)基的選擇123.2.4.2液體基本培養(yǎng)基的選擇123.2.4.3發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化133.2.4.4發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)133.2.5金銀花內(nèi)生真菌的抑菌實(shí)驗(yàn)144結(jié)果與分析154.1菌株篩選的結(jié)果15-2--2-題目：產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究TOC\o"1-5"\h\z4.2菌株次生代謝產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果154?2?1薄層色譜法(TLC)檢測(cè)154.2.2高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)164.3內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果194.3.1傳統(tǒng)鑒定方法194.3.1.1菌株形態(tài)學(xué)描述194.3.1.2顯微形態(tài)鑒定214.4二次發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果254.4.1254.4.2液體基本培養(yǎng)基的選擇254.4.1254.4.2液體基本培養(yǎng)基的選擇254.4.3純化分離出的菌株發(fā)酵液形態(tài)274.4.4發(fā)酵條件的單因素比較4.4.4發(fā)酵條件的單因素比較29TOC\o"1-5"\h\z4.4.4.1碳源的選擇304.4.4.2氮源的選擇304.4.4.3溫度的選擇31題目：產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究TOC\o"1-5"\h\z4.4.5發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)324.5抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果345結(jié)論與討論356展望36參考文獻(xiàn)37題目：產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究題目：產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究-2--2-1前言1.1內(nèi)生菌與植物的關(guān)系內(nèi)生菌（endophyte）是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物。內(nèi)生菌也可理解為植物組織內(nèi)的正常菌群，它們與植物的關(guān)系相當(dāng)密切，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的天然組成成分。關(guān)于內(nèi)生菌的起源仍然有不同的觀點(diǎn)，存在兩種假說(shuō)，即“內(nèi)生說(shuō)”和“外生說(shuō)”:內(nèi)生說(shuō)認(rèn)為內(nèi)生菌與宿主植物應(yīng)該具有相同或相似的遺傳背景；外生說(shuō)認(rèn)為內(nèi)生菌源于植物體外，通過(guò)植物體表、根際的自然孔口、傷口或誘導(dǎo)植物形成的通道進(jìn)入體內(nèi)。內(nèi)生菌長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中，植物以其內(nèi)生菌的組織、細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物為內(nèi)環(huán)境，而內(nèi)生菌以宿主植物的組織和細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物為外環(huán)境，兩者之間互相進(jìn)行物質(zhì)、能量及基因交流，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中與宿主協(xié)同進(jìn)化，在演化過(guò)程中兩者形成了互利共生的關(guān)系。一方面內(nèi)生菌可從宿主中吸取營(yíng)養(yǎng)供自己生長(zhǎng)所需；另一方面，內(nèi)生菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，能刺激植物的生長(zhǎng)發(fā)育，提高宿主植物對(duì)非生物脅迫（如抗干旱）和生物脅迫（如抵抗病蟲害等）的抵抗能力，內(nèi)生菌與宿主植物在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中彼此構(gòu)成了和諧穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系。另有觀點(diǎn)認(rèn)為內(nèi)生菌與宿主植物間存在基因交流，對(duì)紅豆杉，長(zhǎng)春花等藥用植物內(nèi)生菌的研究中，通過(guò)對(duì)其內(nèi)生菌的發(fā)酵液進(jìn)行化學(xué)分析，分離得到了和宿主植物相同或相似的生理活性成分，可見宿主物與其內(nèi)生真菌由于長(zhǎng)期的共同生活因而關(guān)系非常密切。1.2內(nèi)生菌天然藥物新資源及其展望研究發(fā)現(xiàn)某些內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或類似的生理活性成分，這一發(fā)現(xiàn)可能在一定程度上解決了某些藥物資源短缺的問(wèn)題。近年來(lái)先后從紅豆杉(Taxus)，長(zhǎng)春花等藥用植物中分離得到了內(nèi)生真菌，并從這些藥用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵液中分離得到了和宿主的新來(lái)源，可工業(yè)化生產(chǎn)而不受土壤氣候以及資源的限制，從而緩解了藥物資源的短缺。目前已經(jīng)從紅豆杉、長(zhǎng)春花、銀杏等植物中分離出能產(chǎn)生活性成分的內(nèi)生真菌［1,2,3］。1993年Stiede首次從短葉紅豆杉(Taxusbreviflia)中分離得到一株能合成抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌(Taxomycesandreanae)，此后對(duì)東3北紅豆杉也進(jìn)行了研究⑶。云南大學(xué)張玲琪等從桃兒七(Sinopodophyllumhexandrum)的莖中分離到能夠產(chǎn)生鬼臼毒素的內(nèi)生真菌［4,5,6］。從桃兒七植株中共分離得到28株真菌，其中有兩株能夠產(chǎn)生鬼臼毒素類似物，它們分別屬于青霉屬和交鏈孢屬。1999年，中山大學(xué)王偉等人從南方紅豆杉(Tchinensisvar.mairei)中分離得到87株內(nèi)生真菌，其中有6個(gè)菌株能分泌紫杉烷類化合物，它們分別屬于頭孢霉屬、輪柄梳霉屬和無(wú)孢菌群等。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，以上產(chǎn)生與宿主相同或相似生理活性成分的內(nèi)生真菌菌株之間并不存在種屬聯(lián)系，表明內(nèi)生菌具備這一能力并不是偶然現(xiàn)象。這些發(fā)現(xiàn)掀起了一場(chǎng)從藥用植物體內(nèi)分離內(nèi)生菌的熱潮，為人類解決某些藥用植物生長(zhǎng)緩慢、資源短缺等問(wèn)題提供了新思路。另一方面，多樣性的內(nèi)生菌也能產(chǎn)生許多具有生物活性的次生產(chǎn)物，從而增強(qiáng)植物的抗逆性，表現(xiàn)在非生物脅迫（如抗干旱）和生物脅迫（如抵抗病蟲害等）方面，這些次生代謝產(chǎn)物多數(shù)具有抗菌、抗腫瘤等生物活性。本研究通過(guò)分離金銀花內(nèi)生真菌得到產(chǎn)綠原酸的菌株，尋找出此類菌株是如何通過(guò)其自身次生代謝產(chǎn)物來(lái)影響宿主次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，探討兩者之間的相關(guān)性。并以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌為指示菌，通過(guò)紙片法對(duì)分離得到的能夠產(chǎn)生綠原酸的金銀花內(nèi)生真菌進(jìn)行抑菌學(xué)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其發(fā)酵液中的次生代謝產(chǎn)物具有抑菌活性。本研究為后期利用金銀花內(nèi)生真菌工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)綠原酸提供科學(xué)理論依據(jù)，具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和研究意義。2問(wèn)題的提出在河南的道地藥材中，近幾年有一種藥材，價(jià)格連年上漲，而且用途廣泛，這就是我們關(guān)注的-金銀花，金銀花具有清熱解毒、通經(jīng)活絡(luò)、廣譜抗菌及抗病毒等功效，70%以上的感冒、消炎中成藥原料藥材中幾乎都有金銀花的蹤跡，具有“中藥抗生素”、“綠色抗菌素”之稱。金銀花的作用除藥用外，其飲料、美容、減肥和保健養(yǎng)生的作用更為神奇，對(duì)身體所起到的巨大保護(hù)和修復(fù)作用是十分顯著的。金銀花既然有如此之多的用途，它起作用的活性成分什么？通過(guò)請(qǐng)教老師和查閱資料，得知金銀花所含綠原酸是其主要的活性成分之一，綠原酸能促進(jìn)人體新陳代謝、調(diào)節(jié)人體功能、提高免疫力。既然清楚綠原酸是金銀花的活性成分，綠原酸具有抗菌、消炎、解毒、利膽、降壓、升高白細(xì)胞及顯著增加胃腸蠕動(dòng)和促進(jìn)胃液分泌等藥理作用。那么綠原酸在植物體內(nèi)是如何產(chǎn)生的，它和土壤中的大量微生物存在有關(guān)系嗎？而且在植物體內(nèi)有一類微生物存活于健康植物組織內(nèi)部，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中與宿主協(xié)同進(jìn)化，在演化過(guò)程中兩者形成了互惠共生關(guān)系，此類微生物稱為內(nèi)生菌。那么在金銀花中有沒(méi)有能產(chǎn)生綠原酸的內(nèi)生菌。那如果能把該菌分離出來(lái)，就可以利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)金銀花中活性成分綠原酸了。那樣就可以節(jié)約大量的土地和勞動(dòng)力，又能實(shí)行工廠化生產(chǎn)。那么，采用什么樣的技術(shù)才能分離出產(chǎn)綠原酸的金銀花內(nèi)生菌并進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵呢？于是我們開始了從金銀花中分離產(chǎn)綠原酸內(nèi)生菌的研究歷程。3材料與方法3.1試劑可溶性淀粉天津市化學(xué)試劑三廠蛋白胨上海東海制藥廠牛肉膏北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司瓊脂北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司牛肉膏北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司瓊脂北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司硅膠H青島海洋化工廠甲醇天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司乙酸丁酯天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限責(zé)任公司羧甲基纖維素鈉天津市福辰化學(xué)試劑廠氯仿淄博廣然化工有限公司甲苯天津市富宇精細(xì)化工有限公司甲酸上海三浦化工有限公司乙腈天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司葡萄糖上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站試劑廠以上試劑除乙腈，甲醇外均為分析純。KNO3,K2HPO4,MgSO4?7H2O,NaCl,FeSO4?7H2O等均為天津市化學(xué)試劑三廠培養(yǎng)基配方PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g葡萄糖20g瓊|脂18g蒸餾水1000mlPDB培養(yǎng)S：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml，自然pH以上各種培養(yǎng)基配制好分裝完成后于121°C,20min的環(huán)境中滅菌。

3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1菌株的篩選3.2.1.1實(shí)驗(yàn)材料的采集選取健康金銀花植株的不同組織部位（新鮮根、莖、葉、花）作為內(nèi)生真菌分離的實(shí)驗(yàn)材料，采摘時(shí)，盡量選擇植物老的組織部位，因?yàn)閷?duì)老的組織采樣能最大程度的發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌的多樣性，此外盡量選擇對(duì)離地面較遠(yuǎn)的組織采樣，減少因泥土濺到組織上造成的表面雜菌污染。采集后立即保存于保鮮袋內(nèi)，4X冰箱保存,24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生菌的分離。3.2.1.2樣品的消毒處理金銀花組織表面消毒方法的考察。將樣品用自來(lái)水洗凈，無(wú)菌剪刀剪成0?5x0?5cm2的小塊，采用75%乙醇與5%次氯酸鈉相結(jié)合的方法進(jìn)行表面消毒。方法表1金銀花內(nèi)生真菌分離的消毒方法方法處理時(shí)間⑸Solution無(wú)菌水(sterilizedwater)Solution無(wú)菌水(sterilizedwater)75%乙(ethanol)Timetreated30(2times)30(1times)無(wú)菌水（sterilizedwater）無(wú)菌水（sterilizedwater）5%次氯酸鈉（NaCI0）30(3times)60(5times)無(wú)菌水(無(wú)菌水(sterilizedwater)60(5times)3.2.1.3表面消毒效果的檢測(cè)取最后一次消毒的無(wú)菌水200此置入已消毒培養(yǎng)基中，緊貼培養(yǎng)基本表面，作為對(duì)照組，以確定金銀花組織表面消毒徹底。3.2.1.4分離與純化將植物組織用無(wú)菌剪刀剪成O?5xO.5cm2的小城，接種于PDA培養(yǎng)基上，并取最后一次消毒無(wú)菌水用無(wú)菌棉簽涂抹于PDA培養(yǎng)基上，作為對(duì)照。將培養(yǎng)基■于28丈暗室恒溫培養(yǎng)5天，定時(shí)觀察，當(dāng)有新的菌絲或菌落出現(xiàn)時(shí)轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基上，直至純化為單一菌落為止，采用PDA試管斜面培養(yǎng)基保存已純化的菌種，各兩只。3?2?1?5菌種的保藏將純化完全的菌株接種至PDA試管斜面培養(yǎng)基中，28丈暗室恒溫培養(yǎng)，待斜面菌體生長(zhǎng)豐滿后，放入冰箱，4弋保存，每3個(gè)月活化轉(zhuǎn)接一次。3.2.2菌株次生代謝產(chǎn)物檢測(cè)3.2.2.1菌株的小樣培養(yǎng)液體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）,100ml三角瓶裝液量30ml，高壓滅菌后，冷卻備用。將要培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)移至PDA平板上，28弋暗室恒溫培養(yǎng)至一定菌落。用7mm無(wú)菌打孔器將培養(yǎng)純化完全的菌落打取相同大小的菌餅接種于培養(yǎng)液中，每一菌株接種3瓶，以驗(yàn)證其重復(fù)性。28X,120r/min培養(yǎng)96小時(shí)后，作為發(fā)酵液種子小樣。移液管吸取相同體積的發(fā)酵液種子小樣轉(zhuǎn)接至裝液量為50ml的150ml三角瓶中，28°C,120r/min培養(yǎng)96小時(shí)。3.2.2.2內(nèi)生菌發(fā)酵液的提取處理將發(fā)酵好的內(nèi)生菌發(fā)酵液離心（10000r/min）10min（上清液呢），過(guò)濾，濃縮，加甲醇溶解，定容至5ml,0.45Pm微孔濾膜過(guò)濾，置進(jìn)樣小瓶中備用。3.2.2.3薄層色譜法（TLC）檢測(cè)綠原酸將處理后的發(fā)酵提取液適當(dāng)濃縮作為供試品溶液。另取綠原酸對(duì)照品■加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（2010年中國(guó)藥典附錄WB）實(shí)驗(yàn)，吸取供試品試液10-20虬對(duì)照品溶液10山，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上；以乙酸丁酯：甲酸：水=7：2.5：2.5的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，F(xiàn)eCl3

色劑顯色。色劑顯色。3?2?2?4高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)綠原酸參照《2010版藥典》進(jìn)行測(cè)定，色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈：0.4%磷酸溶液(13：87)為流動(dòng)相；流速1ml/min;柱溫25°C;檢測(cè)波長(zhǎng)327nm;進(jìn)樣量10此，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1000。3.2.3內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定3.2.3.1傳統(tǒng)鑒定方法本實(shí)驗(yàn)對(duì)于內(nèi)生真菌進(jìn)行了初步的的形態(tài)鑒定，主要通過(guò)觀察其孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、產(chǎn)孢方式等來(lái)進(jìn)行，目前主要對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，方法如下：挑取純化的真菌菌絲，分別接種于PDA和察氏培養(yǎng)基上，采用3點(diǎn)接種法培養(yǎng)，肉眼觀察菌落正反面特征;采用插片培養(yǎng)法對(duì)孢子進(jìn)行顯微觀察。參照《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定，可將內(nèi)生菌初步鑒定到屬水平。如果更加準(zhǔn)確的鑒定需要做分子生物方面的研究，由于時(shí)間的限制，未對(duì)菌株做分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)。3.2.3.2分子生物學(xué)鑒定方法傳統(tǒng)的內(nèi)生菌鑒定方法過(guò)于繁瑣和復(fù)雜，而微生物的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征是有其內(nèi)部的核酸分子所決定的，因此對(duì)篩選得到的菌株，通過(guò)對(duì)內(nèi)生菌ITSrDNA序列的分析進(jìn)行鑒定■并利用DNAman軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定內(nèi)生菌已經(jīng)成為菌種鑒定的主要方法。3.2.4二次發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化3.2.4.1固體基本培養(yǎng)基的選擇將菌株B-4-15接種于PDA平板上，28°C,倒置培養(yǎng)，待菌落生長(zhǎng)為培養(yǎng)皿1/3時(shí)，用無(wú)菌打孔器沿著菌落邊緣打取相同大小的菌餅，直徑為5mm，分別轉(zhuǎn)接至各種供試固體培養(yǎng)基上。置恒溫培養(yǎng)箱中，28C，倒置培養(yǎng)。以菌落的生長(zhǎng)速度及長(zhǎng)勢(shì)為指標(biāo)，選擇最適合于菌株生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基。3.2.4.2液體基本培養(yǎng)基的選擇制備菌株種子液，并以10%接種量接入到下列液體培養(yǎng)基中：玉米粉葡萄糖培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基，28C,120r/min搖床培養(yǎng)至菌球分散均勻。培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)定菌株B-4-15的菌絲干重；將發(fā)酵液進(jìn)行提取，利用高效液相測(cè)定綠原酸含量，從而確定最佳液體培養(yǎng)基。3.2.4.3發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化碳源的選擇以選擇出的最適液體培養(yǎng)基為測(cè)定碳源的基本培養(yǎng)基，分別以以下碳源代替培養(yǎng)基中的碳源：葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖。培養(yǎng)條件及測(cè)定方法同液體培養(yǎng)基的選擇一致。

氮源的選擇以選擇出的最適液體培養(yǎng)基為測(cè)定氮源的基本培養(yǎng)基，供試氮源分別為硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、尿素，培養(yǎng)條件及測(cè)定方法同液體基本培養(yǎng)基的選擇一致溫度的選擇已選擇出的最適液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基■分別在26C.28C、30°C、32弋的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件及測(cè)定同上。3.2.4.4發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化只能客觀評(píng)價(jià)培養(yǎng)基中各成分所起的作用，而對(duì)于培養(yǎng)基整體而言還需要做下一步的實(shí)驗(yàn)工作，接下來(lái)會(huì)以菌株中綠原酸含量為指標(biāo)，進(jìn)行發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選最佳的碳源、氮源濃度和最佳培養(yǎng)溫度。以上述試驗(yàn)選擇的碳源、氮源、溫度■pH值這4個(gè)因素分別選取3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，在最適溫度下進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵試驗(yàn)，正交試驗(yàn)各因素及水平見表1：表2正交試驗(yàn)因素水平水平因素A碳源濃度1.5%2%2.5%B氮源濃度0.2%0.25%A碳源濃度1.5%2%2.5%B氮源濃度0.2%0.25%0.3%7.5%30弋CpH7.5%30弋D溫度26弋28X3.2.5金銀花內(nèi)生真菌的抑菌實(shí)驗(yàn)將3株內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落生長(zhǎng)為培養(yǎng)皿1/3，7mm打孔器打取菌餅轉(zhuǎn)接至PDB培養(yǎng)液中發(fā)酵，搖床120r/min,28°C恒溫培養(yǎng)96小時(shí)，將發(fā)酵液10000r/min離心10min，取上清液至小瓶中備用。抑菌活性測(cè)試采用紙片擴(kuò)散法：將金銀花內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物分別配成1mg/mL的甲醇溶液然后去50L的各菌株次生代謝產(chǎn)物溶于小濾紙片，使其充分吸收，平方與分別含有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的瓊脂水培養(yǎng)基上，每株真菌對(duì)3中測(cè)試菌分別作3個(gè)重復(fù)，金銀花提取液作為陽(yáng)性對(duì)照。將制好的培養(yǎng)皿在37C恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后觀察，測(cè)定其抑菌圈大小。4結(jié)果與分析4.1菌株篩選的結(jié)果將金銀花不同組織部位（根、莖、葉、花）先在自來(lái)水下沖洗干凈，去除表面的泥土與灰塵，無(wú)菌濾紙吸干表面水分，然后按照以上程序進(jìn)行表面消毒。表3金銀花不同組織的內(nèi)生真菌種類及分布

菌株數(shù)涉及屬的數(shù)目涉及屬占總屬數(shù)部位（株）（株）占總菌株數(shù)的比例例根21426.58%44.44%莖25731.65%77.78%葉17421.52%44.44%花13516.46%55.56%總計(jì)799100%100%通過(guò)對(duì)金銀花內(nèi)生真菌的分離，共得到內(nèi)生真菌79株，其中從的比金銀花根部分離得到21株，約占26.58%；從莖部分離得到25株，約占31.65%；從葉片中分離得到17株，約占21.52%；花蕾中分離得到13株，約占16.46%。由此可知金銀花莖中內(nèi)生真菌種類豐富，其次為根和莖，花中內(nèi)生真菌數(shù)量最少。本實(shí)驗(yàn)表明了在健康的金銀花組織中存在著豐富的內(nèi)生真菌，而其種類與數(shù)量則與其分離部位有關(guān)。4.2菌株次生代謝產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果4?2?1薄層色譜法（TLC）檢測(cè)采用薄層色譜法進(jìn)行初選，篩選出的三個(gè)菌株的次生代謝產(chǎn)物疑似綠原酸，三株菌株與綠原酸對(duì)照品具有相同的Rf且Rf在0.5原酸，三株菌株與綠原酸對(duì)照品具有相同的Rf且Rf在0.5左右。薄層層析譜如下：圖1三株菌株發(fā)酵液薄層色譜圖1三株菌株發(fā)酵液薄層色譜A:A-3-24,B:B-4-15,C:B-4-31,D:綠原酸對(duì)照品，E:金銀花提取液Rf值A(chǔ):0.451,B:0.452,C:0.449,D:0.449,E:0.452Rf值4.2.2高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)采用高效液相色譜法進(jìn)一步確認(rèn)：三株內(nèi)生真菌A-3-24，B-4-15，B-4-31與綠原酸對(duì)照品保留時(shí)間相近，均在7.915min左右。三株菌株發(fā)酵液與綠原酸品液相色圖譜如下：—^7?915minOJTE0q114代一02綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)酵液液相色譜6號(hào)峰，保留時(shí)間為7?915min。峰面積為2148992?7Q'u[]-0ID.0Ih.()I」V[TlOhOOO)昇?93/圖4菌株B-4-15發(fā)酵液液相色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：通過(guò)改變進(jìn)樣體積，得到不同進(jìn)樣量X下的峰面積Y，進(jìn)而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=222428x-88456,Rz=0.9992。表4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表5三株內(nèi)生真菌發(fā)酵液綠原酸含量計(jì)算液相編號(hào)保留時(shí)間/min峰面積含量（ug/ml）標(biāo)準(zhǔn)品7.9152148992.776?8A-3-247.915257018.011.928B-4-157.933160309.28.588B-2-317.928165023.68.752其中，24，15，31號(hào)樣品與對(duì)照品保留時(shí)間基本一致，說(shuō)明24，15，31號(hào)內(nèi)生真菌菌株的發(fā)酵液可能含有綠原酸類物質(zhì)。根據(jù)三株內(nèi)生真菌發(fā)酵液液相分析，保留時(shí)間與對(duì)照品保留時(shí)間一致，可以看出三株內(nèi)生真菌發(fā)酵液中含有綠原酸。4.3內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果4.3.1傳統(tǒng)鑒定方法4.3.1.1菌株形態(tài)學(xué)描述圖7B-4-15菌落形態(tài)表6三株內(nèi)生真菌生理形態(tài)描述菌株顏色菌絲培養(yǎng)基邊緣分泌物A-3-24黃色輻射狀生長(zhǎng)結(jié)合牢固不整齊無(wú)B-4-15黃色干燥結(jié)合牢固整齊紅色液滴

B-4-31淡綠色干燥，皺縮結(jié)合不牢不整齊無(wú)色液滴4.3.1.2顯微形態(tài)鑒定B-4-31淡綠色干燥，皺縮結(jié)合不牢不整齊無(wú)色液滴4.3.1.2顯微形態(tài)鑒定通過(guò)對(duì)三株內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)觀察，觀察其孢子形態(tài)，產(chǎn)孢方式，孢子囊及孢子柄等顯微形態(tài)來(lái)初步推測(cè)菌株的分類地位。三株內(nèi)生真菌的顯微形態(tài)如下：9菌株A-3-24鏡下特征(10x40)(孢子及孢子柄顯微形態(tài))10菌株A-3-24鏡下特征(10x40)(孢子■及孢子柄顯微形態(tài))圖11菌株B-4-15鏡下特征(10x40)(孢子囊及孢子柄顯微特征)12菌株B-4-31鏡下特征(10x40)(孢子囊及孢子形態(tài))根據(jù)對(duì)三株內(nèi)生真菌鏡下顯微形態(tài)的觀察，初步鑒定結(jié)果如下：表7三株內(nèi)生真菌顯微形態(tài)描述顯微特征菌株A-3-24孢子分生孢子梗真菌菌絲分類歸屬孢子梗細(xì)長(zhǎng)，菌絲有分毛霉屬無(wú)分支支，有隔分離部位葉片A-3-24孢子分生孢子梗真菌菌絲分類歸屬孢子梗細(xì)長(zhǎng)，菌絲有分毛霉屬無(wú)分支支，有隔分離部位葉片分生孢子聚圓形或類圓形，集在分生孢菌絲有分B-4-15青霉屬孢子單生子梗頂端呈支，無(wú)隔頭狀。B-4-31孢子單生，顏色分生孢子梗菌絲體細(xì)曲霉屬B-4-31孢子單生，顏色分生孢子梗菌絲體細(xì)曲霉屬淡綠色細(xì)長(zhǎng)”有分支長(zhǎng)，有分支表8金銀花不同組織的內(nèi)生真菌種類及分布根莖葉花總計(jì)屬（Genus）（Root）（Stem）（Leaf）（Flos）（Total）毛霉屬(Mucor)0青霉屬9(Penicillium)鏈格孢屬1(Alternaria)犁頭霉?(Absidia)0頭孢霉屬(Cephalosporieae1)頭珠霉屬1(Piptoaephalis)串珠霉屬(Monilia)0叢梗孢屬1(Moniliaceae)113532251013113532251013100102033004130411253014(Asqergillus)未確定(Unknown)877325總計(jì)（Total）21251713794.4二次發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果4.4.14.4.113三種培養(yǎng)基生長(zhǎng)曲線（以菌落直徑為指標(biāo)）?豆芽汁培養(yǎng)基?豆芽汁培養(yǎng)基■玉米粉培養(yǎng)基iPDA培養(yǎng)基13可以看出，前幾天菌株B-4-15在PDA培養(yǎng)基上菌落的長(zhǎng)勢(shì)略好于豆芽汁與玉米粉培養(yǎng)基，第四天后PDA培養(yǎng)基生長(zhǎng)的長(zhǎng)勢(shì)漸緩，菌落邊緣整齊。而在豆芽汁與玉米粉培養(yǎng)基上卻生長(zhǎng)迅速，第6天時(shí)已經(jīng)長(zhǎng)滿全皿，測(cè)量結(jié)果不能準(zhǔn)確反映菌株的生長(zhǎng)差異，故本實(shí)驗(yàn)并未對(duì)菌株后期的生長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。

4.4.2液體基本培養(yǎng)基的選擇通過(guò)改變進(jìn)樣量體積■得到不同進(jìn)樣量X下的峰面積Y■進(jìn)而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：14B-4-15在玉米粉葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線及綠原酸含量15B-4-15在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線及綠原酸含量

16B-4-15在豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線及綠原酸含量比較菌株B-4-15在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物含量，可知，在不同發(fā)酵液中B-4-15的綠原酸產(chǎn)量和生長(zhǎng)■都不相同。菌株B-4-15在這些培養(yǎng)基中產(chǎn)生的菌絲體最大干重次序?yàn)椋?/p>

馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基＞豆芽汁培養(yǎng)基＞玉米粉培養(yǎng)基。綠原酸產(chǎn)量在馬鈴薯培養(yǎng)基中產(chǎn)量最大，且在第5天后綠原酸含量降低，而在玉米粉中綠原酸最低。故選擇馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基作為最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基，最佳提取時(shí)間為第5天。4.4.3純化分離出的菌株發(fā)酵液形態(tài)圖17菌株A-3-24發(fā)酵液形態(tài)

（菌球分散均勻，顏色黃色，大小適度）

圖圖18菌株B-4-15發(fā)酵液形態(tài)圖菌毛）呈現(xiàn)出良好的發(fā)酵形態(tài)，孢子形成菌球后大小均勻，菌球四周稍帶

菌毛）19菌株B-4-31發(fā)酵液形態(tài)

菌球白色，個(gè)體較大，分散較均勻）在菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)在錐形瓶發(fā)酵液中加入幾小片碎玻璃，這樣在搖床不斷轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中會(huì)使孢子分散均勻，從而使發(fā)酵液菌4.4.4發(fā)酵條件的單因素比較對(duì)不同碳源、氮源、pH值及溫度的發(fā)酵液進(jìn)行高效液相測(cè)定，得到不同進(jìn)樣量X下的峰面積Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=539427x+22782，R2=0.99964.4.4.1碳源的選擇通過(guò)改變馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中的碳源上比較B-4-15在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)量和綠原酸含量的變化。20不同碳源對(duì)B-4-1520不同碳源對(duì)B-4-15產(chǎn)生菌絲體重及綠原酸含量的影響通過(guò)圖20可以得知，不同碳源對(duì)菌株B-4-15產(chǎn)生菌絲體重及綠原酸含量的影響不同，菌株在以蔗糖為碳源的發(fā)酵液中產(chǎn)生的菌絲重及綠原酸含量的變化相近，因此選擇蔗糖為最佳碳源。4.4.4.2氮源的選擇由圖21可知，菌株B-4-15在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中菌絲最高，加入硝酸鈉和硝酸銨的最低，所以綜合考慮之下選擇蛋白胨為最佳氮源。4.4.4.3溫度的選擇

由圖22可以看出，溫度過(guò)高或者過(guò)低，都不利于菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)■所產(chǎn)生的菌絲體及綠原酸含■亦會(huì)降低.適當(dāng)?shù)臏囟葎t會(huì)增加細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，促進(jìn)菌株的次生代謝，綜上所述，本結(jié)果中顯示最適合菌絲體生長(zhǎng)和綠原酸含■積累的溫度為28°C,故選擇28C作為B-4-15的發(fā)酵溫度。表9發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化結(jié)果編號(hào)因素結(jié)果1碳源蔗糖2氮源蛋白胨3溫度28C4pH7.0通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的摸索，得到基本發(fā)酵培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，考慮到蔗糖價(jià)格便宜，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中與葡萄糖起到相同的實(shí)驗(yàn)作用敢選擇主要碳源為蔗糖主要氮源為蛋白胨溫度選擇在28C,pH為7.0。4.4.5發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)表10表10因素三水平正交試驗(yàn)列號(hào)蔗糖蛋白胨pH值溫度mg/mLmg/ml111110.840.74212220.430.32313330.460.35421231.481.22522310.580.30623120.910.87731320.290.16832130.240.23933210.680.57K11.732.611.992.10----K22.971.252.591.63----K31.212.051.332.18----K11.412.121.841.61----K22.390.852.111.35■■■■試驗(yàn)號(hào)ABCD菌絲干重綠原酸相對(duì)含量

K30.961.790.811.80組合，即蔗糖2.0%,組合，即蔗糖2.0%,蛋白胨0.2%，pH70,溫度30°C時(shí)，菌絲表11發(fā)酵條件對(duì)菌絲干重影響的方差分析表因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性葡萄糖0.60320.30211.601*蛋白胨0.30820.1545.926--pH值0.22220.1114.268--溫度0.05220.026----表12發(fā)酵條件對(duì)綠原酸產(chǎn)量影響的方差分析表因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性葡萄糖0.36520.17810.476*蛋白胨0.28920.1458.509--pH值0.31420.1579.222*溫度0.03420.017----由表10、11、12可知,9個(gè)正交試驗(yàn)中，以A2B￡D3為最佳重量與綠原酸含量相對(duì)含量均達(dá)到了最大值。通過(guò)比較單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的結(jié)果,采用最佳組合為馬鈴薯培養(yǎng)基，其中加入蔗糖2?0%，蛋白胨0?2%,pH值7.0，培養(yǎng)溫度為30C的條件。初始培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基啟然pH值嗣時(shí)在30C的條件下培養(yǎng)菌株B-4-15，測(cè)得最佳配比培養(yǎng)基中菌絲重■為1.48mg/mL，綠原酸含量為1.22mg/mL;初始培養(yǎng)基條件下菌絲干重為0.31mg/mL,綠原酸含量為0.17mg/mL■正交試驗(yàn)優(yōu)化培

養(yǎng)基下菌絲最大生長(zhǎng)量增大了4倍，綠原酸含量增加了7.18倍。經(jīng)過(guò)單因素和正交試驗(yàn)的優(yōu)化，使得菌絲重量和綠原酸含量都得到了一定的提高，初步選擇出了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。4.5抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表13內(nèi)生真菌抑菌圈直徑(cm)三組重復(fù)內(nèi)生菌指示菌金黃色葡萄球菌大腸桿菌(cm)綠膿桿菌(cm)(cm)A-3-24＋＋＋＋＋B-4-15＋＋－＋＋B-4-31＋＋＋＋++表示抑菌圈直徑210mm;+表示抑菌圈直徑＜10mm;表示無(wú)抑菌活性；實(shí)驗(yàn)設(shè)定三組重復(fù)，++表示抑菌圈直徑210mm;+表示抑菌圈直徑v10mm;-表示無(wú)抑菌活性；根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，菌株對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，而對(duì)大腸桿菌則表現(xiàn)出較弱的抑菌活性；菌株A-3-