蛋白質(zhì)的提取和分離

課題3血紅蛋白的提取和分離專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)一、基礎(chǔ)知識(shí)--蛋白質(zhì)提取和分離原理

蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)－－蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別。

（1）原理：（2）材料大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。

(一)凝膠色譜法㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：（3）分離過程

混合物上柱洗脫大分子流動(dòng)快小分子流動(dòng)慢收集大分子收集小分子

洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。

(一)凝膠色譜法返回由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3，Na2HPO4/NaH2PO4等緩沖溶液－－洗脫劑組成：配制：作用：調(diào)節(jié)緩沖劑的比例，可配制不同pH的緩沖液。在一定范圍內(nèi)，抵制外界酸堿對(duì)溶液pH的干擾而保持pH基本不變。（二）緩沖溶液返回（三）電泳2．凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。

(三)電泳1.電泳的概念指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程.在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。

（2）分離方法：（3）分離過程：

瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。(三)電泳電泳檢測(cè)結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳樣品處理粗分離純化純度鑒定

血液組成成分

1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白二、實(shí)驗(yàn)操作血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含量最高的有機(jī)化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O2和CO2結(jié)合的___________基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素課題3血紅蛋白的提取與分離紅細(xì)胞與血紅蛋白

血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。返回1.洗滌紅細(xì)胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色課題3血紅蛋白的提取與分離采集得到雞血初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果返回2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？①目的分析：②蒸餾水的作用是______________________________。③加入甲苯的作用是____________________________。④充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂課題3血紅蛋白的提取與分離(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。磁力攪拌器返回3.分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)燒杯課題3血紅蛋白的提取與分離(3)分離血紅蛋白溶液：①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。返回課題3血紅蛋白的提取與分離4.透析血紅蛋白20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL利用透析袋透析透析過程返回課題3血紅蛋白的提取與分離純化－－凝膠色譜法1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5－193.樣品的加入和洗脫（二）凝膠色譜操作

（1）凝膠色譜柱的制作：①取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。

返回材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:課題3血紅蛋白的提取與分離2.凝膠色譜柱的裝填：步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計(jì)算稱量凝膠固定色譜柱（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。②凝膠的前處理：配制凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。（閱讀教材P70操作提示2）③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。

2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。（教材P70操作提示3）裝配好的凝膠柱④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。（教材P70操作提示3）返回3.樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說明色譜柱制作成功）

3.樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。收集得到的純化后的血紅蛋白

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教學(xué)反饋1．凝膠色譜法是根據(jù)（）分離蛋白質(zhì)的有效方法。

A分子的大小B相對(duì)分子質(zhì)量的大小

C帶電荷的多少D溶解度2．緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來維持（）基本不變。

A溫度BpHC滲透壓D氧氣濃度3．電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動(dòng)。

A相同B相反C相對(duì)D相向4.哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。

A血紅蛋白B肌紅蛋白C肌動(dòng)蛋白D肌球蛋白BBBA5．血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（）的含量最多。

A白細(xì)胞B血小板C紅細(xì)胞D淋巴細(xì)胞6．為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)ǎ?/p>

A.NaClB.甲苯C.蒸餾水D.檸檬酸鈉7．將攪