克氏原螯蝦hsp70的遺傳毒性研究

克氏原螯蝦hsp70的遺傳毒性研究

熱休克蛋白（hsds）是一種廣泛存在于真核和原核細(xì)胞中的非常保守蛋白質(zhì)，分為許多家族。其中，hsp70家族是最重要、最復(fù)雜的蛋白質(zhì)。主要以“分子伴侶”的形式，幫助新生兒候鳥的折疊、運(yùn)輸、恢復(fù)和重復(fù)使用新多年生。此外，它在保護(hù)和抗癲癇藥物方面也發(fā)揮著重要作用。甲殼動(dòng)物是一類重要的水生無脊椎動(dòng)物,它們大多具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和商業(yè)前景,已成為很多國家和地區(qū)爭相養(yǎng)殖的對象,然而它們的生存在很大程度上受到了許多環(huán)境因素的影響,包括溫度、缺氧、重金屬離子、感染、饑餓等,這些因素與體內(nèi)熱休克蛋白的表達(dá)水平有緊密聯(lián)系?？耸显r(材料和方法質(zhì)量評分克氏原螯蝦購自廣州市黃沙水產(chǎn)市場,體長為8cm±1.5cm。實(shí)驗(yàn)前于水族箱中暫養(yǎng)2周,水溫保持在20℃左右,每日喂食2次,待其狀態(tài)穩(wěn)定,選取蛻皮間期的蝦用于實(shí)驗(yàn)。組織表達(dá)實(shí)驗(yàn)克氏原螯蝦35℃(預(yù)實(shí)驗(yàn)測定該溫度約為亞致死溫度)熱休克2h,室溫恢復(fù)1.5h,取其心臟、肌肉、血液、消化腺、觸角腺、精巢、腸共7種重要組織作為組織表達(dá)實(shí)驗(yàn)的材料,取未經(jīng)熱休克的蝦作為對照。克氏原螯蝦35℃熱休克1,2,4,6,8h,室溫恢復(fù)1.5h,取其心臟組織。未經(jīng)熱休克的蝦作為對照。經(jīng)過總工會(huì)提取和合成將各組織樣品經(jīng)液氮冷凍研磨后,按照Trizol(Invitrogen)的操作說明提取總RNA。從蝦體抽血方法參照文獻(xiàn)pcr產(chǎn)物的回收及分析參考Gilliland等P-F3:5′-GGTGTTGGTGGGAGGGTCTA-3′;P-CP:5′-GGCTCGCTCTCCCTCATACACTACTT-GCTGTTGCTTGGTT-3′。PCR擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃4min,變性94℃30s,退火59℃30s,延伸72℃30s,共35個(gè)循環(huán),最后72℃8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳后回收。該片段相當(dāng)于在P-F3和P-R1(nt1004～1346,共343bp)片段內(nèi)部產(chǎn)生一個(gè)42bp的缺失。通過連續(xù)2倍稀釋配制系列濃度的scHSP70cDNA標(biāo)準(zhǔn),將這些競爭標(biāo)準(zhǔn)HSP70cDNA梯度液1μL分別加入到0.2μg的cDNA組織樣品中,再用引物P-F3和P-R1(5′-GGCTCGCTCTCCCTCATACAC-3′)同時(shí)擴(kuò)增組織樣品中的scHSP70cDNA和作者制備的用于定量的競爭標(biāo)準(zhǔn)HSP70cDNAcompetitor。PCR反應(yīng)條件同前所述。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后用凝膠成像系統(tǒng)GelDocXRsystem(Bio-Rad)及相關(guān)軟件QuantityOne進(jìn)行分析。樣品scHSP70cDNA帶(343bp)與競爭標(biāo)準(zhǔn)cDNA帶(301bp)可根據(jù)片段大小不同而區(qū)分并定量,與樣品scHSP70cDNA帶亮度比為0.9～1.1的競爭標(biāo)準(zhǔn)HSP70cDNA帶被用于確定組織樣品中scHSP70cDNA的含量,再通過樣品HSP70cDNA的PCR產(chǎn)物分子數(shù)量將其含量換算成HSP70基因mRNA數(shù)量。數(shù)據(jù)分析用3個(gè)平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示克氏原螯蝦scHSP70mRNA表達(dá)量,數(shù)據(jù)分析用SPSS軟件包LSD法進(jìn)行多重比較,當(dāng)熱休克對schsp60基因表達(dá)的影響克氏原螯蝦組織樣品scHSP70cDNA競爭性PCR的代表性結(jié)果見圖2。scHSP70cDNA的產(chǎn)物(343bp)與用于定量的競爭標(biāo)準(zhǔn)cDNA的PCR產(chǎn)物(301bp)經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳可很好地分開,并顯示該心臟樣品scHSP70cDNA的含量與競爭標(biāo)準(zhǔn)3.2×10由表1可見,scHSP70mRNA熱休克前后在各組織中均有所表達(dá)。熱休克前,scHSP70mRNA在7種組織中表達(dá)量均相對較低。經(jīng)過2h熱休克處理,表達(dá)量均顯著上升(從圖3中可以看出,心臟組織在經(jīng)過1h的熱休克,scHSP70mRNA的表達(dá)量已經(jīng)有明顯的增加,說明scHSP70基因在應(yīng)激條件下,能夠快速啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而起到對細(xì)胞的保護(hù)作用。而且,表達(dá)量隨著熱休克時(shí)間的延長,呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢,提示scHSP70對細(xì)胞發(fā)揮一種連續(xù)性的保護(hù)作用。水生動(dòng)物hsps的表達(dá)熱休克蛋白(HSPs)是進(jìn)化上高度保守、功能上至關(guān)重要的一類蛋白,它廣泛存在于從低等原核生物到高等哺乳動(dòng)物的整個(gè)生物界。正常情況下,熱休克蛋白主要行使分子伴侶功能,并參與蛋白質(zhì)代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等重要的生命活動(dòng)迄今,水生動(dòng)物HSPs的研究主要集中在魚類,僅從少數(shù)幾個(gè)種的魚類中克隆得到,如:虹鱒(作者根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室克隆得到的克氏原螯蝦scHSP70基因序列,采用競爭性PCR方法定