茶多酚對大鼠脊髓損傷急性期抗氧化與抗炎作用的研究

茶多酚對大鼠脊髓損傷急性期抗氧化與抗炎作用的研究

脊柱損傷（pci）是目前最嚴(yán)重的災(zāi)難，給患者的家庭和社會(huì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)。SCI病理病機(jī)復(fù)雜,迄今為止尚無特別有效的治療方法。SCI包括不可逆難治療的原發(fā)性損傷和可逆性治療手段可介入的繼發(fā)性損傷1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物概況SD大鼠36只,SPF級(jí),健康雌性,二月齡,質(zhì)量180～220g,購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào):SCXK(湘)2011-0003。飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)、清潔、安靜,22～25℃,相對濕度40%～70%,飼養(yǎng)一周待動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境后造模給藥處理,每日按時(shí)供給水和飼料。1.2鹽水現(xiàn)用現(xiàn)配TP:質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%,江西綠康天然產(chǎn)物公司,批號(hào)F14079501,生理鹽水現(xiàn)用現(xiàn)配。甲基強(qiáng)的松龍(MPSS):比利時(shí),批號(hào)141267,生理鹽水現(xiàn)用現(xiàn)配。MDA、SOD、超氧自由基(·O兔抗iNOS多克隆抗體:ab15323,Abcam,USA,1∶200(V/V)。兔抗GAPDH多克隆抗體:sc137179,SantaCruz,USA,1∶10000(V/V)。山羊抗兔IgG:二抗,sc-2004,SantaCruz,USA,1∶10000(V/V)。1.3低溫離心檢測752型紫外分光光度計(jì)(上海光學(xué)儀器一廠),XDS-1B倒置相差顯微鏡(Olympus,日本);TGL-16A低溫離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表公司),DY89-II型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司),BP121S電子天平(德國Sartorious公司);G42電泳儀、FastblotB31蛋白質(zhì)快速半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)均購于德國Biometra公司。2方法2.1脊柱半切模型的建立選T2.2對小鼠骨髓tp的半切實(shí)驗(yàn)SD雌性大鼠分為6組,每組6只,第一組為假手術(shù)組,采用與模型組一致的手術(shù)過程,打開椎管暴露脊髓,但不進(jìn)行半切;其余各組脊髓進(jìn)行右側(cè)半切,分為模型組、陽性藥組(甲基強(qiáng)的松龍100mg/kg)、TP高劑量組(100mg/kg)、TP中劑量組(50mg/kg)、TP低劑量組(25mg/kg)。術(shù)后5min,假手術(shù)組和模型組灌胃生理鹽水(10mL/kg),其他組別灌胃生理鹽水配制的藥物。2.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)2.3.1麻醉后心臟灌流干預(yù)24h后取材。水合氯醛(0.3g/kg,i.p.)麻醉后心臟灌流,從左心室注入,右心耳流出。37℃生理鹽水快速推注150mL,后滴注200mL(60滴/min),灌注直至右心耳流出的生理鹽水變清亮,肺和肝變白。2.3.2組織病理學(xué)處理心臟灌流后,4%多聚甲醛10min內(nèi)緩慢推注60mL后,再滴注200mL(30滴/min),原切口處剪下4cm脊柱,以損傷處為中心取下2cm脊髓,預(yù)冷的生理鹽水洗凈組織,濾紙吸干水分,放入EP管中(內(nèi)有4%多聚甲醛溶液1mL)避光保存待做病理切片。2.3.3鹽水凈組織、濾紙吸干心臟灌流后原切口處剪下4cm脊柱,剝離取下4cm脊髓,冰冷的生理鹽水洗凈組織,濾紙吸干水分。精準(zhǔn)稱重組織,冰上操作加生理鹽水制備成10%的組織勻漿,3000r/min,離心10min,取上清加入生理鹽水按1∶9稀釋成1%的組織勻漿,根據(jù)試劑盒測定·O2.3.4小鼠sds-聚丙烯凝膠電泳脊髓組織100mg加入0.5mLRIPA裂解液4℃裂解1h。12000r/min、4℃離心20min,取上清。加入上樣緩沖液,煮5min讓蛋白變性。每孔上樣總蛋白8μL,15%SDS-聚丙烯凝膠濃縮膠電壓80V,分離膠120V電泳2h,80mA轉(zhuǎn)膜30min。室溫下封閉2h(用50g/L牛血清白蛋白的TBST緩沖液),然后分別加入一抗:兔抗iNOS多克隆抗體(1∶200)、兔抗GAPDH多克隆抗體(1∶10000),4℃過夜。再分別加入相應(yīng)二抗室溫孵育1h[山羊抗兔IgG(H+L)/HRP,1∶10000]。ECL發(fā)光試劑盒顯影,用Image-Pro軟件分析條帶吸光值。2.3.5測定了氧化酶系統(tǒng)活性根據(jù)試劑盒測定1%的組織勻漿中SOD、MDA水平,方法同“2.3.3”。2.3.6elisa測定血清炎癥因子給藥24h后摘右眼球取血5mL。血液22℃靜置2h,4℃冰箱放置18～22h,2000r/min離心20min,取上清,根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行血清炎癥因子含量測定。2.4統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“3結(jié)果3.1tp對髓組織形態(tài)的影響HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察,假手術(shù)組大鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞膜完整,神經(jīng)細(xì)胞分布均勻、形態(tài)正常,神經(jīng)纖維排列整齊,細(xì)胞間基質(zhì)均勻。模型組脊髓組織在損傷區(qū)中央見大片血細(xì)胞,出現(xiàn)囊腔樣變化,細(xì)胞腫脹、空泡變性,并有大量炎性細(xì)胞浸潤。TP高劑量組組織結(jié)構(gòu)排列較完整,神經(jīng)纖維排列整齊,細(xì)胞間基質(zhì)較均勻,偶見炎性水腫。TP中、低劑量組脊髓組織空泡減輕,可見炎性細(xì)胞浸潤,但低于模型組。見圖1。3.2tp對cp骨髓中活性氧簇的影響大鼠脊髓右側(cè)半切24h后,與假手術(shù)組相比,脊髓組織對·O3.3tp對髓中sod活性和mda含量的影響脊髓組織右側(cè)半切24h后,與假手術(shù)組相比,組織中SOD活性下降,MDA水平增加(P<0.01,表2)。TP高、中、低3個(gè)劑量給藥24h后,與模型組比較,脊髓組織中SOD活性增加,MDA含量減少(P<0.05或P<0.01,表2)。3個(gè)劑量TP組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3.4tp對血清il-1、il-6、il-8含量的影響大鼠脊髓半切24h后,與假手術(shù)組相比,血清炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8含量均增加(P<0.01,表3)。TP高、中、低3個(gè)劑量給藥24h后,與模型組相比,血清IL-1β、IL-6、IL-8含量均減少(P<0.05或P<0.01,表3)。與高劑量組相比,TP低劑量組對IL-6、IL-8含量的影響低于高劑量(P<0.05或P<0.01,表3);其余指標(biāo)3個(gè)劑量TP組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4tp治療慢性監(jiān)激活劑與特殊活性成分的作用SCI是一種后果嚴(yán)重、災(zāi)難性的神經(jīng)損傷,其中具有可逆性并可被調(diào)控的繼發(fā)性損傷急性期主要表現(xiàn)為氧自由基損傷、炎癥因子聚集等,因而具有抗氧化抗炎的藥物成為治療SCI的重要手段,如被美國FDA唯一批準(zhǔn)治療SCI的藥物MPSS,以及臨床常用的神經(jīng)節(jié)苷脂。但是這兩種藥物或者毒副作用明顯,或者療效不穩(wěn)定。高效抗氧化劑成為了SCI研究近幾年的熱門方向。本文探討了天然高效抗氧化劑TP對SCI的作用。TP源自綠茶,能清除自由基,具有抗炎、抗衰老、提高免疫力、防癌等一系列優(yōu)異功能,且易通過血腦屏障,清除自由基繼發(fā)性脊髓損傷急性期機(jī)體產(chǎn)生ROS,主要包括·O中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)會(huì)出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和白細(xì)胞的浸潤,進(jìn)而誘導(dǎo)釋放IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等前炎癥因子。脊髓損傷后,產(chǎn)生的前炎癥因子可加重繼發(fā)性損傷的程度。研究認(rèn)為,SCI后急性期產(chǎn)生的IL-lβ具有啟動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和加劇炎癥反應(yīng)的作用,IL-6是參與全身炎性反應(yīng)綜合癥的眾多介質(zhì)中最有影響的促炎因子,IL-8是一種有效的炎性介質(zhì),