TCVMA 124-2023 牦牛螨蟲病診斷技術(shù)

ICS11.220CCSB41團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/CVMA124—2023牦牛螨蟲病診斷技術(shù)Diagnostictechniquesforyakmanges2023-7-14發(fā)布 2023-7-14實施中國獸醫(yī)協(xié)會 發(fā)布T/CVMA124—2023前 言GB/T1請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院提出。本文件由中國獸醫(yī)協(xié)會歸口。本文件起草單位：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)。本文件主要起草人：謝躍、左之才、周璇、古小彬、徐璟、郭紅瑞、馬曉平。IT/CVMA124—2023牦牛螨蟲病診斷技術(shù)范圍本文件規(guī)定了牦牛螨蟲病臨床檢查、樣品采集與病原鑒定等診斷技術(shù)要求。本文件適用于牦牛螨蟲病的檢疫和診斷。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。NY/T1470羊螨病（癢螨/疥螨）診斷技術(shù)術(shù)語和定義NY/T1470確定的下列術(shù)語和定義適用于本文件。var注：牦牛疥螨的形態(tài)見附錄A中圖A.1~圖A.3。疥螨病sarcopticmange由疥螨寄生于牦牛皮膚表皮內(nèi)引起相應(yīng)臨床癥狀的外寄生蟲病。var注：牦牛癢螨的形態(tài)見圖A.4~圖A.6。癢螨病psoropticmange由癢螨寄生于牦牛皮膚表面引起相應(yīng)臨床癥狀的外寄生蟲病。1T/CVMA124—2023注：牛足螨的形態(tài)見圖A.7~圖A.9。足螨病choriopticmange由牛足螨寄生于牦牛皮膚表面引起相應(yīng)臨床癥狀的外寄生蟲病。流行病學(xué)牦牛螨蟲病分布廣泛，其流行具有一定的季節(jié)性和傳染性，一般在秋末開始，冬季出現(xiàn)流行高峰，次年春末進(jìn)入夏天，牦牛換毛、皮溫升高時開始逐漸好轉(zhuǎn)；犢牦牛、成年體弱母牛的發(fā)病率往往較高。根據(jù)我國牦牛主產(chǎn)區(qū)螨蟲病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，青海牦牛疥螨病的感染率為7.7%~10.0%，牦牛癢螨病的感染率為5.0%~11.7%，牦牛癢螨病的感染率為15.0%~30.0%，牦牛足螨病的感染率為4.1%~6.9%；新疆牦牛疥螨病的感染率為25.0%。臨床檢查臨床特征患病部位劇癢表現(xiàn)為皮膚瘙癢，病牛常以舔、咬或倚物摩擦患部。皮膚病變脫毛初期少量掉毛；中、后期被毛成片脫落，裸露出病變皮膚。初步判定2T/CVMA124—2023在臨床牦牛出現(xiàn)癥狀，如劇癢、皮膚損傷、發(fā)炎、潰爛、增厚、脫毛、結(jié)痂和消瘦等癥狀時可做出初步判定。當(dāng)發(fā)現(xiàn)疑似螨蟲感染牦牛時，應(yīng)隔離觀察或采取病料送實驗室進(jìn)一步病原學(xué)鑒定。病原學(xué)鑒定設(shè)備、器械與試劑設(shè)備與器械恒溫箱（4°C~60°C）、顯微鏡（10×）、酒精燈、凸刃小刀、棉拭子、自封袋、平皿等。試劑30%甘油或液體石蠟、生理鹽水。顯微鏡檢查病料采集保定臨床疑似感染牛只，剪掉患部與健康部交界處被毛，生理鹽水清洗，擦干，用凸刃小刀45°1滴甘油或液體石蠟，有助于螨蟲的采集。收集刮取的病料，迅速轉(zhuǎn)移到自封袋，密封后送往實驗室待檢。檢查方法直接檢查法取適量病料置于平皿中，37°C恒溫箱作用15min~30min，取出平皿直接進(jìn)行鏡檢。溫水檢查法40°C~45°C沉淀檢查法將病料放入10%氫氧化鈉溶液并浸泡過夜或加熱煮5min左右，待其溶液自然沉淀15min，取沉淀物鏡檢。漂浮檢查法將6.2.2.360%5min~10min后，取蓋玻片鏡檢。結(jié)果判定6.2.2B（卵DNA（參A（卵DNA3T/CVMA124—2023附 錄 A（資料性）螨蟲的形態(tài)示意圖牦牛螨蟲的形態(tài)示意圖見圖A.1~圖A.9。A.1疥螨（成螨）背面觀A.2疥螨（成年雌螨）腹面觀A.3疥螨（成年雄螨）腹面觀4T/CVMA124—2023A.4交配狀態(tài)的癢螨A.5癢螨（成年雌螨）背面觀A.6癢螨（成年雄螨）腹面觀5T/CVMA124—2023圖A.7牛足螨（成螨）背面觀A.8牛足螨（成年雌螨）腹面觀圖A.9牛足螨（成年雄螨）腹面觀6T/CVMA124—2023附錄B（規(guī)范性）牦牛疥螨分子生物學(xué)檢查方法cox1DNA片段進(jìn)行常PCR檢測。操作DNA的提取根據(jù)市售的微量基因組DNA提取試劑盒說明書，提取痂皮或牦牛螨蟲蟲體DNA，備用。PCR擴(kuò)增擴(kuò)增總體積為50μL，包含PCRMixture25μL，待檢樣品DNA模板1μL，上、下游引物各1μL（10pmol/μL；上游引物序列5'-GTGTGGAACTGGTAGAGG-3'，下游引物序列5'-CAGATCAAGCAAAAAGAGTTAAG-3'），滅菌蒸餾水加至50μL。同時設(shè)置牦牛疥螨DNA為陽性對照，設(shè)置滅菌蒸餾水為陰性對照。PCR擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性3min；94°C變性30s，54°C復(fù)性20s，72°C延伸20s，35個循環(huán)；72°C延伸8min；8℃儲存10min。產(chǎn)物預(yù)期大小為212bp。結(jié)果判定取5μLPCR（及5μLDNA標(biāo)準(zhǔn)Marker，加入1.8%瓊脂糖凝膠板的孔內(nèi)（含Goldview核酸染料），經(jīng)5V/cm電泳，電泳20min，于紫外凝膠成像儀或凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。實驗結(jié)果成立條件：當(dāng)陽性對照出現(xiàn)212bp擴(kuò)增條帶，空白對照未出現(xiàn)目的條帶。在實驗結(jié)果成立的情況下，待檢樣品出現(xiàn)預(yù)期大?。?12bp）條帶即為陽性（見圖B.1）。標(biāo)引序號說明：M——2000標(biāo)準(zhǔn)分子量（a；1——標(biāo)準(zhǔn)陽性擴(kuò)增結(jié)果；2——陰性對照。圖B.1PCR方法標(biāo)準(zhǔn)陽性擴(kuò)增結(jié)果7T/CVMA124—2023若需要進(jìn)一步確認(rèn)檢測結(jié)果，將電泳檢測呈陽性的PCR剩余產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行序列測定，疥螨cox1基因參考序列（212bp）如下：8T/CVMA124—2023附錄C（資料性）疥螨雌雄異體，蟲體近圓形或橢圓形，較小，背面隆起似半球形，乳白，大小為200μm~500μm，整個（見圖4對足幾乎全部被遮于腹下。軀體后半部有幾對桿狀剛毛和長鬃。腹面扁平，光滑，僅有少數(shù)剛毛和4對足。足短粗而圓，分5節(jié)，呈圓錐形。前兩對足與后兩對足之間的距離較大，足的基部有角質(zhì)內(nèi)突。雌螨第1、2對足上有吸盤，第3、4對足上各有一根長剛毛（見圖A.2）。雄螨第1、2、4對足上有吸盤，第3對足上（見圖癢螨（500μm~900μm）×（200μm~520μm），蟲體可分為假頭和軀體兩部分（見圖A.4）。假頭位于蟲體前端，其基部背面后方無粗短垂直剛毛。刺吸式口1243對足上各（見圖。1234（見圖A.6）。牛足螨雌雄異體，蟲體形態(tài)與癢螨相似，呈卵圓形，體長300μm~500μm，整個蟲體分為假頭和軀體兩個（見圖11對須肢和12、4對足上有吸盤，第3對足上有剛毛（見圖A.8）。雄螨4對足，第1、2、3、4對足上均有吸盤，第4對足極短，從背面不能被看見（見圖A.9）。生殖孔位于第3、4對足之間。體末端有2個結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)的前方腹面有1對環(huán)狀性吸盤，性吸盤上有剛毛；肛門位于蟲體末端。疥螨和牛足螨的區(qū)別要點疥螨和牛足螨的區(qū)別要點見表C.1。C.1疥螨和牛足螨類的區(qū)別要點類別足的特點雌雄疥螨第1、2對足有長柄不分節(jié)的吸盤第1、2、4對足有長柄不分節(jié)的吸盤癢螨第1、2、4對足有長柄不分節(jié)的吸盤第1、2、3對足有長柄不分節(jié)的吸盤牛足螨第1、2、4對足有短柄不分節(jié)的吸盤第1、2、3、4對足有短柄不分節(jié)的吸盤9T/CVMA124—2023參考文獻(xiàn)孔繁瑤.家畜寄生蟲學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2010.雷萌桐,蔡進(jìn)忠,李春花,等.我國牦牛體外寄生蟲感染概況[J].中國獸醫(yī)雜志,201652(08):68-70.賈小勇,楊光友,趙小平,等.水牛癢螨和兔癢螨的形態(tài)學(xué)觀察[J].寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報,2006,13(4):221-225.古小彬,楊光友,賴松家,等.基于線粒體細(xì)胞色素氧化酶I(COI)序列的豬和兔四個疥螨分離株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[J].昆蟲學(xué)報,2009,52(4):465-472.S,GuXB,Fuaetal.MoleculartaxonomicrelationshipsofPsoroptesandChorioptesmitesfromChinabasedonCOIand18SrDNAgenesequence[J].Parasitology,2012,184:392-397.GuXB,AstudyonthegeneticrelationshipofmitesinthegenusSarcoptes(Acari:Sarcoptidae)inChina[J].InternationalJournalofAcarology,2008,34(2):183-190.S,PoonR,ChauS,etal.Developmentofconventionalandreal-timequantitativePCRassaysfordiagnosisandmonitoringofscabies[J].JournalofClinicalMicrobiology,2015,53(7):2095-102.FraserMartinA,PolkinghorneA,etal.ComparativediagnosticsrevealsPCRassaysonskinscrapingsisthemostreliablemethodtodetectSarcoptesscabieiinfestations[J].Parasitology,2018,251:119.RehbeinS,WinterR,VisserM,etal.Choriopticmangeindairycattle:treatmentwitheprinomectinpour-on[J].ParasitologyResearch,