臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié) 細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查·細(xì)菌學(xué)診斷依據(jù)形態(tài)學(xué)檢查、菌落特征、生化反應(yīng)和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，形態(tài)學(xué)檢查盡管是初步的檢查，但對(duì)于進(jìn)一步檢驗(yàn)起到重要提示作用，對(duì)于臨床標(biāo)本的細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查主要包括標(biāo)本的染色和不染色。一、不染色標(biāo)本·細(xì)菌不經(jīng)染色直接鏡檢，主要用于檢查生活狀態(tài)下細(xì)菌的動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)狀況。常用的方法有壓滴法和懸滴法，以普通光學(xué)顯微鏡觀察。·在臨床上，有時(shí)通過不染色標(biāo)本的動(dòng)力檢查可對(duì)某些病原菌做出初步鑒定。如疑似霍亂患者，取其米泔樣便，制成懸滴標(biāo)本或壓滴標(biāo)本，高倍鏡或暗視野下觀察動(dòng)力，若見穿梭似流星狀運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，同法重新制備另一標(biāo)本并加入O1群霍亂弧菌診斷血清，如果原運(yùn)動(dòng)活潑的現(xiàn)象停止，可初步判斷為“疑似O1群霍亂弧菌”。除細(xì)菌標(biāo)本外，螺旋體由于不易著色并有形態(tài)特征，故多用不染色標(biāo)本作暗視野顯微鏡檢查。二、染色標(biāo)本細(xì)菌標(biāo)本經(jīng)染色后，除能清楚看到細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列方式外，還可根據(jù)染色反應(yīng)將細(xì)菌進(jìn)行分類，因此染色標(biāo)本的檢查在細(xì)菌的初步鑒定中應(yīng)用最廣，起著非常重要的作用。（一）常用染料：酸性染料、堿性染料、復(fù)合染料。（二）常用的染色方法：革蘭染色、抗酸染色、熒光染色。革蘭染色·本法是細(xì)菌學(xué)中最經(jīng)典、最常用的染色方法。絕大多數(shù)標(biāo)本在分離培養(yǎng)之前都要進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。通過革蘭染色將所有細(xì)菌分為G+菌與G-菌兩大類，可初步識(shí)別細(xì)菌，縮小范圍，有助于進(jìn)一步鑒定。甚至有時(shí)可以結(jié)合細(xì)菌特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列方式，對(duì)病原菌進(jìn)行初步鑒定?！じ锾m染色除用以鑒定細(xì)菌外，病原菌革蘭染色特性可為臨床選擇用藥提供參考，幫助臨床制定有針對(duì)性的治療方案。因?yàn)镚+菌和G-菌對(duì)一些抗生素表現(xiàn)出不同的敏感性，且其致病物質(zhì)以及作用機(jī)制不同。一、細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)（一）制片1.涂片

取潔凈載玻片一張，用標(biāo)記筆一分為二，用接種環(huán)取生理鹽水2環(huán)，分別置于玻片兩端，接種環(huán)滅菌后，取金黃色葡萄球菌斜面培養(yǎng)物少許與鹽水混勻，并涂成均勻薄膜涂片。接種環(huán)滅菌后以同樣方法再取大腸埃希菌少許，與另一端生理鹽水混勻后涂成均勻薄膜。如用液體材料，如痰、尿液、膿汁等可直接涂片，不必加生理鹽水。干燥涂片最好在室溫下自然干燥，必要時(shí)可將標(biāo)本面向上，小心間斷地在弱火高處烘干，但切勿緊靠火焰將涂膜烤枯。固定涂片干燥后，將標(biāo)本片在酒精燈上快速的來回通過三次，共約2s～3s，注意溫度不可太高，以涂片涂膜的反面觸及皮膚覺輕微燙覺即可。固定目的：①殺死細(xì)菌；②使菌體與玻片粘附較牢，在染色時(shí)不致被染液和水沖掉；③菌體蛋白變性易著色。涂片干燥固定染色鏡檢（二）革蘭染色法原理革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易滲入；革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較疏松，肽聚糖層少，脂質(zhì)含量多，乙醇易滲入。革蘭陽性菌的等電點(diǎn)低，革蘭陰性菌的等電點(diǎn)較高，在相同pH條件下，革蘭陽性菌所帶負(fù)電荷比革蘭陰性菌多，與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合較牢固不易脫色。革蘭陽性菌細(xì)胞內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與結(jié)晶紫和碘牢固的結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易被乙醇脫色；而革蘭陰性菌細(xì)胞內(nèi)含極少量的核糖核酸鎂鹽，吸附染料量少，形成的復(fù)合物分子也較小，故易被乙醇脫色。2.染色方法標(biāo)本涂片、干燥和固定。染色：在已固定細(xì)菌涂片上滴加結(jié)晶紫染液數(shù)滴，室溫作用1min，用細(xì)流水輕輕沖洗，甩去積水。再滴加碘液數(shù)滴，室溫作用1min，沖洗。滴加95%酒精數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)玻片幾秒鐘，使均勻脫色，然后斜持玻片，

使脫掉的染料隨酒精流去，再滴加酒精，直到流下的

酒精無色為止（約需30s），立即用細(xì)流水將酒精沖掉。再滴加稀釋石炭酸復(fù)紅液復(fù)染約30s后用細(xì)流水沖洗。標(biāo)本染色后，晾干或用吸水紙吸干，滴香柏油后用油鏡觀察。3.結(jié)果紫色為革蘭陽性菌，紅色為革蘭陰性菌。（二）抗酸染色1.原理分枝桿菌細(xì)胞壁含脂質(zhì)較多，其中主要成分為分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色時(shí)與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固，能抵抗酸性乙醇的脫色作用，因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色，達(dá)到染色目的?？顾崛旧た顾崛旧部蓪⒓?xì)菌分為兩大類：抗酸性細(xì)菌和非抗酸性細(xì)菌。疑似結(jié)核分支桿菌感染的標(biāo)本，經(jīng)抗酸染色后以油鏡檢查，即可作出初步鑒定。2.方法萋納石炭酸復(fù)紅染色，加溫促使菌體著 色5min；流水沖洗，3%鹽酸酒精脫色1至3min；呂氏美藍(lán)復(fù)染30s。3.結(jié)果未脫色細(xì)菌呈紅色為抗酸性細(xì)菌,脫色經(jīng)復(fù)染呈藍(lán)色的細(xì)菌為非抗酸性細(xì)菌。熒光染色·熒光染色法敏感性強(qiáng)，效率高而且容易觀察結(jié)果，在臨床細(xì)菌鑒定中有很大的實(shí)用價(jià)值。主要用于結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分支桿菌

、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀氏菌的檢測。（三）鞭毛染色1.原理細(xì)菌的鞭毛能被堿性復(fù)紅酒精飽和溶液著色，是因?yàn)樵谌旧^程中隨著酒精的蒸發(fā)其染料沉積

在鞭毛上，使鞭毛著色。堿性復(fù)紅作為主要染料，而丹寧酸為媒染劑。3.結(jié)果菌體染成紅色（或深紫色），鞭毛染成淡紅色（或淡紫色），染色時(shí)間越長，鞭毛越粗。（四）莢膜染色

1.原理莢膜為細(xì)菌細(xì)胞壁外圍的黏液層，對(duì)染料的親和力很低，用一般染色不易著色，必須通過莢膜染色方法或襯托染色，方能清晰辨認(rèn)出莢膜。2.方法用有莢膜的細(xì)菌培養(yǎng)物涂片，火焰固定，固定標(biāo)本后加1%結(jié)晶紫染液，室溫保持1min后，倒去染液，然后用20%硫酸銅水溶液沖洗染液，勿水洗。待干后鏡檢觀察。3.結(jié)果菌體為深紫色，莢膜為無色或淡紫色。第二節(jié)細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定·細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定主要用于臨床標(biāo)本有一種或多種細(xì)菌通過培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得單一菌落進(jìn)行生化反應(yīng)，將一種或多種細(xì)菌予以鑒定?！ひ?、培養(yǎng)基的種類和選擇·培養(yǎng)基是由人工方法配制而成，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。適宜的培養(yǎng)

基不僅可用于細(xì)菌的分離純化培養(yǎng)、傳代、菌

種保存，還可用于研究細(xì)菌的生理、生化特性、是對(duì)病原菌分離鑒定的重要環(huán)節(jié)和必不可少的

手段。（一）常用培養(yǎng)基分類·1.按成分分類：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基·2.按用途分類：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、特殊培養(yǎng)基·3.按培養(yǎng)基形態(tài)分類：液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)又分為斜面培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。（二）培養(yǎng)基的選擇·臨床標(biāo)本送往細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)立即接種到適當(dāng)?shù)姆蛛x培養(yǎng)基上。根據(jù)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心推薦，細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備以下分離培養(yǎng)基：·1.血平板：

適于各類細(xì)菌的生長，一般細(xì)菌檢驗(yàn)標(biāo)本的分離，都應(yīng)接種此平板?！?.巧克力平板：其中含有V和X因子，適于接種疑有嗜血桿菌和奈瑟氏菌的標(biāo)本?！?.中國藍(lán)或伊紅美蘭平板：可抑制革蘭陽性細(xì)菌，有利于革蘭陰性細(xì)菌的生長，時(shí)常用的弱選擇性培養(yǎng)基。發(fā)酵型革蘭陰性桿菌因分解乳糖能力的不同，在此平板上菌落顏色不同，便于鑒別菌種。·4.麥康凱平板：具有中等強(qiáng)度選擇性，抑制力略強(qiáng)，少數(shù)革蘭陰性菌不生長。·5.SS瓊脂平板：具有較強(qiáng)的抑菌力，用于志賀菌和沙門菌分離。因選擇性過強(qiáng)，可能會(huì)影響檢出率，使用時(shí)最好同時(shí)加種弱選擇平板以配對(duì)互補(bǔ)?！?.堿性瓊脂或TCBS瓊脂：用于從糞便中分離霍亂弧菌和其它弧菌?！?.血液增菌培養(yǎng)基：用于從血液、骨髓、無菌體液中分離常見病原菌?！?.營養(yǎng)肉湯：用于標(biāo)本及各類細(xì)菌的增菌?！じ鶕?jù)標(biāo)本來源和可能存在的病原菌，確定選用各種分離培養(yǎng)基。二、分離培養(yǎng)·從標(biāo)本中分離出病原菌并進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，除選擇好合適的培養(yǎng)基外，還要根據(jù)待檢標(biāo)本的來源、培養(yǎng)目的及所使用培養(yǎng)基的性狀，采用不同的分離和培養(yǎng)方法。·（一）細(xì)菌的分離·1.平板劃線法·2.斜面劃線法·3.液體接種法·4.穿刺接種法·5.涂布接種法（二）細(xì)菌培養(yǎng)方法·常用的有需氧培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法。為了提高檢驗(yàn)的正確率，同一標(biāo)本常常同時(shí)采用兩種或三種不同的培養(yǎng)方法?！?.需氧培養(yǎng)法：是臨床實(shí)驗(yàn)室最常用的方法，適于一般需氧和兼性厭氧菌的培養(yǎng)?！?.二氧化碳培養(yǎng)法：有些細(xì)菌初次分離培養(yǎng)時(shí)須置5%-10%CO2環(huán)境才能生長良好?！?.厭氧培養(yǎng)法;有專用厭氧手套箱和化學(xué)產(chǎn)氣法。二、培養(yǎng)接種（一）劃線接種

1.方法斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法。斜線法曲線法方格法放射法四格法（二）培養(yǎng)基血平板巧克力血平板伊紅美藍(lán)平板麥康凱平板SS平板M-H平板三、 生化反應(yīng)·不同細(xì)菌具有獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而對(duì)底物的分解能力各異。其代謝的產(chǎn)物也各不相同。這些代謝產(chǎn)物又各具有不同的生化反應(yīng)特性，可利用生物化學(xué)的方法測定這些代謝產(chǎn)物以鑒定細(xì)菌。在臨床細(xì)菌檢驗(yàn)工作中，除根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)、染色、培養(yǎng)特性進(jìn)行初步鑒定外，絕大多數(shù)分離的未知菌的屬、種鑒定無論是應(yīng)用手工鑒定還是自動(dòng)化儀器鑒定，都需要通過這些生化反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，掌握各種生化反應(yīng)的原理和應(yīng)用是細(xì)菌鑒定的基礎(chǔ)。三、生化反應(yīng)（一）碳水化合物的代謝試驗(yàn)1.糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)原理：不同種類細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖（醇、苷）類的酶，因而對(duì)各種糖（醇、苷）類的代謝能力也有所不同，即使能分解某種糖（醇、苷）類，其代謝產(chǎn)物可因菌種而異。檢查細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基中所含糖（醇、苷）降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，可用以鑒定細(xì)菌種類。方法：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（如酚紅肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）類。所使用的糖（醇、苷）類有很多種。將待鑒定的純培養(yǎng)細(xì)菌接種入試驗(yàn)培養(yǎng)基中，置35℃孵育箱內(nèi)孵育數(shù)小時(shí)后，觀察結(jié)果;若用微量發(fā)酵管，或要求培養(yǎng)時(shí)間較長時(shí)。結(jié)果：能分解糖（醇、苷）產(chǎn)酸的細(xì)菌，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)（如酚紅變?yōu)辄S色），產(chǎn)氣的細(xì)菌可在小倒管（Durham小管）中產(chǎn)生氣泡，固體培養(yǎng)基則產(chǎn)生裂隙。不分解糖則無變化。應(yīng)用：是鑒定細(xì)菌最主要和最基本的試驗(yàn)，特別對(duì)腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要。2．葡萄糖代謝類型鑒別試驗(yàn)

(O-F試驗(yàn)）原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；能進(jìn)行無氧降解的為發(fā)酵型；不分解

葡萄糖的細(xì)菌為產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細(xì)菌無論在有氧或無氧環(huán)

境中都能分解葡萄糖，而氧化型細(xì)菌在無氧環(huán)境中則不能

分解葡萄糖。本試驗(yàn)又稱氧化發(fā)酵（O/F或Hugh－Leifson，

HL）試驗(yàn)，可用于區(qū)別細(xì)菌的代謝類型。方法：挑取少許純培養(yǎng)物（不要從選擇性平板中挑?。┙臃N1支HL培養(yǎng)管中，從培養(yǎng)基表面穿刺到其底部。置35℃孵箱孵育48h以上。結(jié)果：培養(yǎng)基均不產(chǎn)酸（顏色不變）為陰性；培養(yǎng)基表面和底部都產(chǎn)酸（變黃）為發(fā)酵型；培養(yǎng)基表面變?yōu)樯钏{(lán)色為產(chǎn)堿型；培養(yǎng)基表面變黃、底部不色變?yōu)檠趸汀?為產(chǎn)堿型2為氧化型3為發(fā)酵型應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與其他非發(fā)酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細(xì)菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌（發(fā)酵型）與微球菌（氧化型）。3．甲基紅（MR）試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培養(yǎng)基pH下降至4.5以下時(shí)，加入甲基紅指示劑呈紅色。如細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)（如醇、醛、酮、氣體和水），培養(yǎng)基pH在5.4以上，加入甲基紅指示劑呈桔黃色。方法：將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育48~96h后，于5ml培養(yǎng)基中滴加5~6滴甲基紅指示劑，立即觀察結(jié)果。結(jié)果判定：呈現(xiàn)紅色者為陽性，桔黃色為陰性，桔紅色為弱陽性。應(yīng)用：常用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬的鑒別，如大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性，后者為陰性。腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性，而沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽性。4．β-半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG試驗(yàn)）原理：乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些細(xì)菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細(xì)菌均可快速水解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黃色的鄰硝基酚。用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。方法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，觀察結(jié)果。結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。應(yīng)用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細(xì)菌的快速鑒定，本法對(duì)于迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌均可短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)陽性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為試驗(yàn)陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。5．VP試驗(yàn)原理：測定細(xì)菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力。某些細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步脫羧形成乙酰甲基甲醇。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，進(jìn)而與培養(yǎng)基中的精氨酸等含胍基的物質(zhì)結(jié)合形成紅色化合物。即V-P試驗(yàn)陽性。方法：將待檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，輕輕振搖試管，然后加0.2ml

400g/L

KOH，輕輕振搖試管30s至1min，然后靜置觀察結(jié)果。結(jié)果：紅色者為陽性，黃色或類似銅色為陰性應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。本試驗(yàn)常與MR試驗(yàn)一起使用，一般情況下，前者為陽性的細(xì)菌，后者常為陰性，反之亦然。6．膽汁七葉苷水解試驗(yàn)原理：在10%~40％膽汁存在下，測定細(xì)菌水解七葉苷的能力。七葉苷被細(xì)菌分解生成的七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離子發(fā)生反應(yīng)形成黑色化合物。方法：將被檢菌接種于膽汁七葉苷培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h后，觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基完全變黑為陽性，不變黑為陰性。應(yīng)用：主要用于鑒別腸球菌與其他鏈球菌的區(qū)別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌（如脆弱擬桿菌等）的初步鑒別。腸球菌本試驗(yàn)為陽性。（二）細(xì)菌對(duì)于蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)1.明膠液化試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生一種胞外酶-明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動(dòng)的液體。方法：將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于22℃培養(yǎng)7d，逐日觀察結(jié)果。若用35℃孵育，因明膠在此溫度下自行液化，故在觀察結(jié)果前，先置4℃冰箱內(nèi)30min，再看結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性。陰性陽性應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌的鑒別，如沙雷菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、陰溝桿菌等可液化明膠，而其他細(xì)菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。另外多數(shù)假單胞菌也能液化明膠。2.吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì)），當(dāng)加入吲哚試劑（對(duì)二甲氨基苯甲醛）后則形成紅色的玫瑰吲哚。培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基。方法：將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)24～48h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑。結(jié)果：于兩者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。3.硫化氫試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛或亞鐵離子則形成黑褐色的硫化鉛或硫化鐵沉淀。此試驗(yàn)可間接檢測細(xì)菌是否產(chǎn)生硫化氫。培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。方法：將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)24～48h觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮浴?yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種的鑒別。如沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬細(xì)菌，絕大多數(shù)硫化氫陽性，其他菌屬陰性。沙門菌屬中也有硫化氫陰性菌種。4.尿素分解試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性。培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。方法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)18～24h觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮?。?yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定。奇異變形桿菌和普通變形桿菌脲酶陽性。另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽性，而斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。陽性陰性陰性5.苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，加入氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基。方法：將被檢菌濃厚接種于苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于35℃培養(yǎng)18～24h，滴加10％三氯化鐵試劑3～4滴，自斜面上方流下。結(jié)果：出現(xiàn)綠色為陽性。應(yīng)立即觀察結(jié)果，延長反應(yīng)時(shí)問會(huì)引起褪色。加氯化鐵試劑出現(xiàn)綠色為陽性應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和摩根菌屬細(xì)菌均為陽性，腸桿菌種中其他細(xì)菌均為陰性。6.氨基酸脫羧酶試驗(yàn)原理：具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺（賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿。使指示劑顯示出來。培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對(duì)照培養(yǎng)基。方法：將被檢菌分別接種于賴氨酸（或鳥氨酸或精氨酸）培養(yǎng)基和氨基酸對(duì)照培養(yǎng)基中，并加入無菌液體石蠟或礦物油，于35℃培養(yǎng)1～4d，每日觀察結(jié)果。結(jié)果：孵育后，對(duì)照管應(yīng)呈黃色，測定管呈紫色（指示劑為溴甲酚紫）為陽性；若測定管呈黃色為陰性。若對(duì)照管呈現(xiàn)紫色則試驗(yàn)無意義，重新做試驗(yàn)。氨基酸對(duì)照鳥氨酸賴氨酸鳥氨酸為陽性賴氨酸為陰性氨基酸對(duì)照應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。如沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其余沙門菌的賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶均為陽性。志賀菌屬除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。（三）碳源和氮源利用試驗(yàn)1.枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌能以銨鹽為唯一氮源，并且利用

枸櫞酸鹽作為唯一碳源，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鹽，使培養(yǎng)基變堿性。培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基。方法：將被檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)1～4d，每日觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性；不能利用枸櫞酸鹽作為碳源的細(xì)菌，在此培養(yǎng)基上不能生長，培養(yǎng)基則不變色，為陰性。應(yīng)用：用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。在腸桿菌科中埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常為陽性。2.丙二酸鹽試驗(yàn)原理：丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。能否利用丙二酸鹽，也是細(xì)菌鑒定中的一個(gè)鑒別性特征。許多微生物代謝有三羧酸循環(huán)，而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)的一個(gè)環(huán)節(jié)，丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶，與丙二酸不被分解，所以琥珀酸脫氫酶被占據(jù)，不能釋放出來催化琥珀酸脫氫反應(yīng)，抑制了三羧酸循環(huán)。培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基接種：用幼齡菌種接種測定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基，于適溫培養(yǎng)1～2d，觀察培養(yǎng)基變色情況。觀察結(jié)果：如測定培養(yǎng)基生長并變藍(lán)色，表示可利用丙二酸鹽，為陽性結(jié)果；如測定培養(yǎng)基未變色，則為陰性，即不利用丙二酸鹽。2.丙二酸鹽利用試驗(yàn)原理：有的細(xì)菌可利用丙二酸鹽作為唯一碳源，將丙二酸鹽分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基。方法：將被檢菌接種于上述培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性，顏色無變化為陰性。應(yīng)用：腸桿菌科中屬間及種的鑒別?？死撞鷮贋殛栃裕蹤此釛U菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬中有些菌種也呈陽性，其他菌屬均為陰性。（四）氧化酶試驗(yàn)原理：氧化酶（細(xì)胞色素氧化酶）是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對(duì)苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。試劑：1%鹽酸四甲基對(duì)苯二胺或1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺。方法：菌落法濾紙法直接滴加試劑于被檢菌菌落上。取潔凈濾紙一小塊，沾取菌少許，然后加試劑。3.試劑紙片法

將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙上。結(jié)果：細(xì)菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈（二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽為紫紅色，四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽為藍(lán)色）為陽性。分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對(duì)照。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的鑒別，前者為陰性，后者為陽性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細(xì)菌也呈陽性反應(yīng)。（五）觸酶試驗(yàn)原理：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。試劑：3%過氧化氫溶液。方法：取菌落置于潔凈的試管內(nèi)或玻片上，然后加3%過氧化氫數(shù)滴；或直接滴加3%過氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。結(jié)果：有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性。不產(chǎn)生氣泡者為陰性。應(yīng)用：革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，而鏈球菌屬為陰性，故此試驗(yàn)常用于革蘭陽性球菌的初步分群。（六）硝酸鹽還原試驗(yàn)原理：硝酸鹽還原反應(yīng)包括兩個(gè)過程：一是在合成過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其他含氮化合物；二是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。能使硝酸鹽還原的細(xì)菌從硝酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其他還原性產(chǎn)物。但硝酸鹽還原的過程因細(xì)菌不同而異，有的細(xì)菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌；有的細(xì)菌則可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細(xì)菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如假單胞菌等。硝酸鹽還原試驗(yàn)系測定還原過程中所產(chǎn)生的亞硝酸。培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基。試劑：甲液（對(duì)氨基苯磺酸0.8g+5mol／L醋酸100ml；乙液（α-奈胺

0.5g+5mol/L醋酸100ml）。方法：被檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)1～4d，將甲、乙液等量混合后（約0.1ml）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀察結(jié)果。結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性。若加入試劑后無顏色反應(yīng)，可能是：硝酸鹽沒有被還原，試驗(yàn)陰性；硝酸鹽被還原為氨和氮等其他產(chǎn)物而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，這時(shí)應(yīng)在試管內(nèi)加入少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色則表明試驗(yàn)確實(shí)為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表示試驗(yàn)為假陰性。若要檢查是否有氮?dú)猱a(chǎn)生，可在培養(yǎng)基管內(nèi)加一小倒管，如有氣泡產(chǎn)生，表示有氮?dú)馍蓱?yīng)用：本試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中廣泛應(yīng)用。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌可產(chǎn)生氮?dú)猓挥行﹨捬蹙珥f榮球菌等試驗(yàn)也為陽性。（七）

DNA酶試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌產(chǎn)生DNA酶，可使長鏈DNA水解成寡核苷酸鏈。因?yàn)殚L鏈DNA可被酸沉淀，寡核苷酸鏈則溶于酸，所以當(dāng)菌落平板上加入酸后，會(huì)在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)。培養(yǎng)基：0.2％DNA瓊脂平板。方法：將被檢菌點(diǎn)種于上述平板上，于35℃培養(yǎng)18～24h，用lmol/L鹽酸覆蓋平板，觀察結(jié)果。結(jié)果：在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)為陽性，無透明環(huán)為陰性。應(yīng)用：在革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生DNA酶，在腸桿菌科中沙雷菌和變形桿菌產(chǎn)生此酶，故本試驗(yàn)可用于細(xì)菌的鑒別。（八）凝固酶試驗(yàn)原理：葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶。一種是結(jié)合凝固酶，結(jié)合在細(xì)胞壁上，使血漿中的纖維