實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)時(shí)熒光定量per實(shí)驗(yàn)報(bào)告篇一：實(shí)時(shí)熒光定量PCR方式簡(jiǎn)介實(shí)時(shí)熒光定量PCR方式簡(jiǎn)介—?實(shí)時(shí)熒光定量PCR的大體原理理論上,PCR進(jìn)程是依照2n（n代表PCR循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)的方式進(jìn)行模板的擴(kuò)増。但在實(shí)際的PCR反映進(jìn)程中,隨著反映的進(jìn)行由于體系中各成份的消耗（主若是由于聚合酶活力的衰減）使得靶序列并非按指數(shù)方式擴(kuò)増,而是按線性的方式增加進(jìn)入平臺(tái)期。因此在起始模板量與終點(diǎn)的熒光信號(hào)強(qiáng)度間沒(méi)有靠得住的相關(guān)性。如采納常規(guī)的終點(diǎn)檢測(cè)法（利用EB染色來(lái)判定擴(kuò)增產(chǎn)物的多少,從而間接的判定起始拷貝量）,即便起始模板量相同經(jīng)PCR擴(kuò)増、EB染色后也完全有可能取得不同的終點(diǎn)熒光信號(hào)強(qiáng)度。為了能準(zhǔn)確判定樣品中某基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）的起始拷貝數(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR采納新的參數(shù)——Ct值,定量的全然原理是Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性反比關(guān)系。Ct值是如何取得的在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的進(jìn)程中,靶序列的擴(kuò)増與熒光信號(hào)的檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行,定量PCR儀全程搜集熒光信號(hào),實(shí)驗(yàn)終止后分析軟件自動(dòng)按數(shù)學(xué)算法扣除熒光本底信號(hào)并設(shè)定閾值從而取得每一個(gè)樣品的Ct值。Ct值的概念Ct值中的〃C〃代表Cycle（循環(huán)），〃t〃代表檢測(cè)threshhold（閾值），其含義是PCR擴(kuò)増進(jìn)程中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)；也能夠明白得為擴(kuò)増曲線與閾值線交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)。Ct值與樣品中模板的對(duì)應(yīng)關(guān)系Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性反比關(guān)系（y二ax+b汎代表起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)7代表Ct值\與終點(diǎn)法相較利用Ct值的優(yōu)勢(shì)由于Ct值是反映實(shí)際PCR反映進(jìn)程中擴(kuò)増即將進(jìn)入指數(shù)期的參數(shù)，該參數(shù)幾乎不受試劑消耗等因素的阻礙，因此利用Ct值判定的起始模板拷貝數(shù)加倍精準(zhǔn)重復(fù)性也更好。傳統(tǒng)的終點(diǎn)檢測(cè)法是在PCR擴(kuò)増經(jīng)歷了指數(shù)擴(kuò)増期進(jìn)入平臺(tái)期后利用EB等染料染色來(lái)判定擴(kuò)増產(chǎn)物的多少,從而間接的判定起始拷貝量,這種方式的精準(zhǔn)度不高、重復(fù)性也不行。以下圖中是96個(gè)復(fù)孔的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線（完全相同的反映體系、相同的反映protocol.相同的樣品起始濃度），能夠看到Ct值具有專門好的重復(fù)性，而終點(diǎn)的熒光信號(hào)強(qiáng)度不同達(dá)到300個(gè)單位。另外采納實(shí)時(shí)熒光定量PCR還能從方式學(xué)上有效的避免PCR實(shí)驗(yàn)中交叉污染的問(wèn)題。因?yàn)闊晒舛縋CR中模板的擴(kuò)増與檢測(cè)是同時(shí)進(jìn)行的,當(dāng)實(shí)驗(yàn)完成后即可取得定量結(jié)果，直接拋棄含有大量擴(kuò)増產(chǎn)物的反映管,完全幸免了傳統(tǒng)方式中掏出擴(kuò)増產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒按時(shí)擴(kuò)増產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)室造成二次污染的可能性。二?熒光定量PCR的2類方式（按熒光產(chǎn)生的原理分類）染料法（SYBRGreen法）染料法即利用SYBRGreen分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)來(lái)進(jìn)行樣品定量。該方式與常規(guī)的PCR類彳以，唯一的區(qū)別是在反映體系中加入了SYBRGreen染料分子。該染料分子的激發(fā)波長(zhǎng)為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nmo與EB的性能類彳以,SYBRGreen也是一種扁平狀的分子,處于游離狀態(tài)時(shí)具有很低的熒光本底,當(dāng)反映體系中存在dsDNA時(shí),SYBRGreen能特異性的與之結(jié)歸并在497nm激發(fā)下。染料法的優(yōu)勢(shì)：1,無(wú)需設(shè)計(jì)、合成探針,實(shí)驗(yàn)本錢低；2,利用方便,與常規(guī)PCR的操作幾乎相同。染料法的缺點(diǎn)：1,由于SYBRGreen與dsDNA的結(jié)合只具有結(jié)構(gòu)特異性而不具有序列特異性，除與特異性的靶序列擴(kuò)増產(chǎn)物結(jié)合外，還能與在PCR擴(kuò)増進(jìn)程中形成的引物二聚體、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合,從而造成擴(kuò)増效率的降低、結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此采納該方式關(guān)于引物的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化要求很高，確保反映進(jìn)程中沒(méi)有非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)増；2，由于SYBRGreen的上述特點(diǎn)，該方式不能應(yīng)用于MultiplexQPCR技術(shù)。（在一個(gè)反映管中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的基因的表達(dá)情形）探針?lè)ǎㄒ訲aqMan探針為例）探針?lè)晒舛縋CR與常規(guī)PCR的不同的地方在于:在上、下游引物外還加入了具有序列特異性的探針（探針本

身具有熒光標(biāo)記）,該探針依照需要擴(kuò)增的靶序列設(shè)計(jì)因此只能與待檢測(cè)序列結(jié)合，與染料法相較提高了實(shí)驗(yàn)的特異性。目前市場(chǎng)上的探針要緊種類有：TaqMan、Molecular

Beacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan

探針應(yīng)用最普遍。TaqMan探針的結(jié)構(gòu)：長(zhǎng)度與一般PCR弓I物類似，大約20bp左右。在寧與3’端各標(biāo)記有一個(gè)熒光基團(tuán)，5’的熒光基團(tuán)稱為報(bào)告基團(tuán)（Report）,3’的熒光基團(tuán)稱為淬滅基團(tuán)（Quencher\1=TaqMan探針的性能：在探針結(jié)構(gòu)完整的情形下用特定的波長(zhǎng)激發(fā)報(bào)告基團(tuán)，由于報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的空間位置很近，因此報(bào)告基團(tuán)能夠通過(guò)FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)將同意的能量轉(zhuǎn)移至!］淬滅基團(tuán)，使后者以發(fā)射熒光或熱量的方式釋放能量,而報(bào)告基團(tuán)并非發(fā)射特定波長(zhǎng)的熒光信TaqMan探針?lè)üぷ髟恚?變性(95°C):模板dsDNA充分解鏈;?復(fù)性、延伸、酶切降解（60°C）:1,探針與靶序列結(jié)合；上、下游引物與靶序列結(jié)合；3,上、下游引物在Taq酶的作用下合成互補(bǔ)鏈（5'-3’聚合功能）；4,當(dāng)上游引物延伸到TaqMan探針的5’端時(shí)，延伸不能繼續(xù),現(xiàn)在Taq酶發(fā)揮5’-3'夕卜切功能將探針?biāo)獠⒗^續(xù)向前延伸直至完成互補(bǔ)鏈的合成；將探針?biāo)獠⒗^續(xù)向前延伸直至完成互補(bǔ)鏈的合成；?熒光信號(hào)的檢測(cè)：由于TaqMan探針被水解,報(bào)告基團(tuán)在受到激發(fā)后不能再通過(guò)FRET作用將同意的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán)，因此能夠檢測(cè)到報(bào)告基團(tuán)特定波長(zhǎng)的熒光信號(hào),起始模板濃度越高熒光信號(hào)越強(qiáng)。與染料法相較TaqMan探針?lè)ǖ膬?yōu)勢(shì)：1,實(shí)驗(yàn)的特異性取得了提高；2,對(duì)探針的5’端采納不同的熒光標(biāo)記就能夠夠進(jìn)行MultiplexQPCR0與染料法相較TaqMan探針?lè)ǖ娜秉c(diǎn):1,探針的利用提高了實(shí)驗(yàn)本錢；2,探針的利用需要設(shè)計(jì)及優(yōu)化。三.確信樣品起始模板拷貝數(shù)的2類方式絕對(duì)定量采納絕對(duì)定量的方式需要利用標(biāo)準(zhǔn)品（已知起始拷貝數(shù)的樣品）成立標(biāo)準(zhǔn)曲線，成立Ct值與樣品起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)之間的線性關(guān)系,從而通過(guò)實(shí)驗(yàn)后樣品的Ct值得出起始模板量。標(biāo)準(zhǔn)品的種類：含目的基因的質(zhì)粒（經(jīng)酶切線性化處置,其中的插入片段必需采納與QPCR實(shí)驗(yàn)中相同的引物擴(kuò)増取得XPCR擴(kuò)増產(chǎn)物（經(jīng)純化,必需采納與QPCR實(shí)驗(yàn)中相同的引物擴(kuò)增取得）、化學(xué)合成的寡聚核昔酸、cDNA、gDNA等，前2種標(biāo)準(zhǔn)品利用較為普遍。標(biāo)準(zhǔn)品的定量：UVA260、熒光分光光度檢測(cè)等。為了使實(shí)驗(yàn)最終取得的Ct值之間具有可比性,必需進(jìn)行歸一化的處置：1,對(duì)各樣品進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使各樣品的起始細(xì)胞數(shù)一致（可操作性不強(qiáng),尤其是針對(duì)組織、腫瘤等樣品）；2,對(duì)純化后取得的總RNA進(jìn)行定量使各樣品進(jìn)行RT-PCR時(shí)加入的RNA用量一致。相對(duì)定量與絕對(duì)定量不同,相對(duì)定量不關(guān)切每一個(gè)樣品中目的基因表達(dá)產(chǎn)物（mRNA）的具體拷貝數(shù)z而關(guān)注目的基因在不同的細(xì)胞類型、不同的發(fā)育周期等條件下不同的轉(zhuǎn)錄效率,即基因的不同化表達(dá)。就硏究目的而論，該方式比絕對(duì)定量的應(yīng)用范圍更普遍、更符合硏究的目的。某目的基因在樣品與對(duì)照品間表達(dá)不同倍數(shù)的計(jì)算公式如下：公式說(shuō)明：Rel.Quantity:目的基因在樣品與對(duì)照品間表達(dá)不同的倍數(shù)；GOI:目的基因(GeneofInterest);Norm:內(nèi)參基因(ReferenceGenezNormalizerzHouseKeepingGene)Eff:PCR擴(kuò)増效率,分子部份為目的基因擴(kuò)増效率,分母部份為內(nèi)參基因的擴(kuò)増效率；利用該公式時(shí)，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)別離確信目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)増效率然后代入公式進(jìn)行計(jì)算；若是目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)増效率都接近于100%且相差小于5%也可將PCR擴(kuò)増效率默以為100%,如此公式就簡(jiǎn)化為2-AACt0?什么緣故需要設(shè)立內(nèi)參基因?若是僅僅比較目的基因的是不能準(zhǔn)確反映樣品間目的基因的表達(dá)不同的,最主若是受到3個(gè)變量的阻礙:1,樣品處置時(shí)不同的純化得率；2,RT-PCR進(jìn)程中不同的逆轉(zhuǎn)錄效率;3,QPCR反映體系中不同的cDNA加入量。由于上述3個(gè)變量在樣品間都很難操縱在相同的水平上,因此需要引入內(nèi)參基因來(lái)矯正上述變量進(jìn)行歸一化處置，使得所有樣品目的基因表達(dá)水平的比較是在相同的水平上進(jìn)行的，如此得出的結(jié)果才具有可信性與良好的重復(fù)性。（注意：內(nèi)參基因的（1+EffACt）位于分母的位置，進(jìn)行除法的運(yùn)算。）?如何選擇內(nèi)參基因？符合什么標(biāo)準(zhǔn)的基因能夠作為內(nèi)參基因？

i=由于上述內(nèi)參基因的用途,因此內(nèi)參基因的選擇必需知足以下3個(gè)條件：1,在不同的細(xì)胞、組織中具有恒定的表達(dá)；2，在不同的細(xì)胞周期、發(fā)育周期中具有恒定的表達(dá)；3,在不同的實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下具有恒定的表達(dá)。內(nèi)參基因的—樣小于2（即小于1倍的表達(dá)不同），一樣采納的內(nèi)參基因都是一些管家基因，利用最多的為:?-actin.GAPDH、18sRNA等。i=1=需要注意的是：并非傳統(tǒng)意義上的管家基因都能作為內(nèi)參基因，仍是需要與具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)合起來(lái)綜合考慮。例如GAPDH在II型糖尿病病人中就明顯的高表達(dá),不能作為內(nèi)參基因。因此在選擇內(nèi)參基因時(shí)建議：1,查閱相關(guān)文獻(xiàn)；2,設(shè)立多個(gè)內(nèi)參基因；3,采納表達(dá)譜的方式確信理想的內(nèi)參基因。1=?采納Singleplex仍是Multiplex?篇二：實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體實(shí)驗(yàn)步驟以下實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考：1樣品RNA的抽提取凍存已裂解的細(xì)胞室溫放置5分鐘使其完全溶解。兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿,蓋緊管蓋。手動(dòng)猛烈振蕩管體15秒后,15到30弋孵育2到3分鐘。4弋下lXXrpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為基層的紅色酚氯仿相,中間層和無(wú)色水相上層。RNA全數(shù)被分派于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試齊啲60%oRNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30。＜2孵育10分鐘后，于4°C下lXXrpm離心10分鐘?，F(xiàn)在離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。RNA清洗移去上清液，每lmITRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少lml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制）,清洗RNA沉淀?；靹蚝?4°CT7000rpm離心5分鐘。RNA干燥警惕吸去大部份乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。溶解RNA沉淀溶解RNA時(shí),先加入無(wú)RNA酶的水40pl用槍反復(fù)吹打幾回，使其完全溶解,取得的RNA溶液保留于?80°C待用。2RNA質(zhì)量檢測(cè)1）紫外吸收法測(cè)定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值,測(cè)定RNA溶液濃度和純度。濃度測(cè)定A260下讀值為1表示40pgRNA/ml0樣品RNA濃度(pg/ml)計(jì)算公式為:A260x稀釋倍數(shù)x40Mg/ml0具體計(jì)算如下:RNA溶于40plDEPC水中，取5ul,1:100稀釋至495訓(xùn)的TE中,測(cè)得A260=0.21RNA濃度二0.21xlOOx40pg/ml二840pg/ml或0.84pg/pl取5ul用來(lái)測(cè)量以后,剩余樣品RNA為35pl,剩余RNA總量為：35plx0.84pg/pl=29.4pg純度檢測(cè)RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度z比值范圍1.8到2.102)變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定①制膠lg瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60°C,10ml的10XMOPS電泳緩沖液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。lOxMOPS電泳緩沖滋濃度成份0.4MMOPS,pH7.00.1M乙酸鈉0.01MEDTA灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少能夠加入25Ml溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的lxMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。②預(yù)備RNA樣品取3|jgRNAz加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10pg/ml。加熱至7CTC孵育15分鐘使樣品變性。電泳上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2hz電泳至溟酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3cm。紫外透射光下觀看并拍照28S和18S核糖體RNA的帶超級(jí)亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀看到一個(gè)更小略微擴(kuò)散的帶,它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間能夠看到_片彌散的EB染色物質(zhì),可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備進(jìn)程中若是顯現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面顯現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。3樣品cDNA合成反映體系序號(hào)反映物劑量1逆轉(zhuǎn)錄buffer2pl2上游引物0.2pl3下游引物0.2|jldNTP0.1|j|5逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV0.5|jlDEPC水5|jlRNA模版2|jl8整體積lOpI輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心?；旌弦涸诩尤肽孓D(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70弋干浴3分鐘,掏出后當(dāng)即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5|jlz37°C水浴60分鐘。掏出后當(dāng)即95弋干浴3分鐘，取得逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保留于-80°C待用。4梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因（p-actin）實(shí)時(shí)定量PCR①p-actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備陽(yáng)性模板的濃度為1011,反映前取3pl按10倍稀釋（加水27pl并充分混勻）為1010,依次稀釋至10九、10八、107、10六、10五、104,以備用。②反映體系如下：標(biāo)準(zhǔn)品反映體系序號(hào)反映物劑量1SYBRGreen1染料lOpI2陽(yáng)性模板上游引物F0.5|j|3陽(yáng)性模板下游引物R0.5pldNTP0.5plTaq酶lpl6陽(yáng)性模板DNA5|jl7ddH2O32.5pl8整體積50|j|輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。管家基因反映體系：序號(hào)反映物劑量1SYBRGreen1染料10pl2內(nèi)參照上游引物F0.5|jl3內(nèi)參照下游引物R0.5pl4dNTP0.5pl5Taq酶lpl6待測(cè)樣品cDNA5pl7ddH2032.5pl8整體積50|j|輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。③制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反映條件為：93°C2分鐘,然后93°C1分鐘,55°C2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。5制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板①針對(duì)每一需要測(cè)量的基因,選擇一確信表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反映。反映體系:序號(hào)反映物劑量10xPCR緩沖液2.5ulMgCI2溶液1.5ul3上游引物F0.5ul4下游引物R0.5uldNTP混合液3ulTaq聚合酶1ulcDNA1ul8加水至整體積為25ul輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。35個(gè)PCR循環(huán)（94°C1分鐘;55°C1分鐘;72°C1分鐘）；72oC延伸5分鐘。②PCR產(chǎn)物與DNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，漠化乙錠染色,檢測(cè)PCR產(chǎn)物是不是為單一特異性擴(kuò)増條帶。③將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋：將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋：設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1X1010,依次稀釋至10九、10107、10六、10五、104幾個(gè)濃度梯度。6待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR所有cDNA樣品別離配置實(shí)時(shí)定量PCR反映體系。體系配置如下：序號(hào)反映物劑量1SYBRGvenl染料10ul2上游引物lul3下游引物luldNTPlulTaq聚合酶2ul6待測(cè)樣品cDNA5ul7ddH2O30ul8整體積50ul輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。將配制好的PCR反映溶液置于RealtimePCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)増反映。反映條件為：93°C2分鐘預(yù)變性，然后按93°C1分鐘，55°C1分鐘z72°C1分鐘,共40做個(gè)循環(huán),最后72°C7分鐘延伸。7實(shí)時(shí)定量PCR利用引物列表引物設(shè)計(jì)軟件：PrimerPremier5.0z并遵循以下原那么：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間幸免形成穩(wěn)固的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反映（即錯(cuò)配）。8電泳各樣品的目的基因和管家基因別離進(jìn)行RealtimePCR反映。PCR產(chǎn)物與DNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView?染色,檢測(cè)PCR產(chǎn)物是不是為單一特異性擴(kuò)増條帶。篇三：生物實(shí)驗(yàn)4實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)四定量PCR擴(kuò)増姓名：李宗翰專業(yè)：環(huán)境工程學(xué)號(hào):1432999同組人姓名：劉雪飛—、實(shí)驗(yàn)?zāi)康臏亓?xí)定量PCR原理,熟悉絕對(duì)定量的操作流程二實(shí)驗(yàn)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR反映體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積存實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方式。在PCR擴(kuò)増的指數(shù)時(shí)期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析三、實(shí)驗(yàn)儀器及材料realtimePCR儀（ABI7500,RotorGene3000）,微量移液器，Tip頭，0.2ml光學(xué)薄壁管，8聯(lián)PCR管，1.5ml離心管zSYBRMix,引物及108copy/ul標(biāo)準(zhǔn)品四、實(shí)驗(yàn)步驟—、標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋：取4個(gè)1.5ml的離心管,寫上標(biāo)記107z106,105,104,向每管加入90|j|ddH2Oz取lOpI108copy/ul的標(biāo)樣加入到107管中，充分混勻后，從管中取lOpI107copy/ul的液體到106管中。按上述操作依次稀釋，取得5個(gè)倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品。注意,每次稀釋都要換Tip頭。二配制預(yù)混液：取口9plddH2O.7pl引物4204f、7訓(xùn)引物4448r和7plRox到裝有175|j|SYBRMix液的1.5ml離心管中，混勻。3、分裝預(yù)混液取7個(gè)小離心管另U離標(biāo)記10八、107、10六、10五、104、UNK（未知樣）、NTC（陰性對(duì)照）。向其中別離加入42pl預(yù)混液和4.7|jl模板（1?5號(hào)加標(biāo)樣、6號(hào)加未知樣、7號(hào)加等量ddH20），混勻。4、戴上手套取兩個(gè)8聯(lián)管,并排放置管架上。別離月上述樣品20卩1至第1-7管中（第8管空出）,每一個(gè)樣品兩個(gè)重復(fù)，共14個(gè)樣品。將加好樣的8聯(lián)管振蕩。五、設(shè)置分析儀參數(shù)如下：95°C3min;95°C15s+60°C40s為f盾環(huán)，循環(huán)次數(shù)40,融解曲線溫度范圍60?95弋。振蕩好的樣品進(jìn)機(jī)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。六、擴(kuò)増后利用軟件分析CT值及未知樣的定量結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論_、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如何？試分析。答：實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析如下。（1X實(shí)驗(yàn)具體數(shù)據(jù)見(jiàn)下表QuantityWellTaskCtCtMeanCtSDQuantityMeanQuantitySDCtThresholdAlSTANDARD8.24888.25270.0055100000000A2STANDARD8.25658.25270.0055100000000BlSTANDARD11.389311.65980.3825100000000.3825B2STANDARD11.930311.65980.382510000000ClSTANDARD15.329214.96680.51261000000C2STANDARD14.604314.96680.51261000000D1100000STANDARD19.491219.30800.2590D2100000STANDARD19.124919.30800.2590ElSTANDARD22.538522.41960.168110000E2STANDARD22.300722.41960.168110000FlUNKNOWN8.93708.96910.045459501332583025841695285.625F2UNKNOWN9.00128.96910.045457103836583025841695285.625G1NTC32.5329G2NTC32.9549其中,A-E為標(biāo)準(zhǔn)樣品，F(xiàn)為位置樣品，G為陰性對(duì)照。每一個(gè)樣品做兩個(gè)平行