扁豆凝集素的分離純化與性質(zhì)描述說(shuō)明書(shū)

目錄TOC\o"1-5"\h\z一、前言2凝集素的概念及其簡(jiǎn)介2凝集素的分類3凝集素的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀3凝集素的應(yīng)用前景4本設(shè)計(jì)的主要研究?jī)?nèi)容包括：6二、扁豆凝集素的分離純化62.1試驗(yàn)材料6試驗(yàn)方法7扁豆凝集素粗品的制備7扁豆凝集素的純化7三、扁豆凝集素的性質(zhì)研究7試驗(yàn)材料7試驗(yàn)方法8扁豆凝集素的基本性質(zhì)檢測(cè)8扁豆凝集素的熱穩(wěn)定性測(cè)定8堿穩(wěn)定性測(cè)定9金屬離子結(jié)合特性試驗(yàn)9扁豆凝集素的糖抑特性試驗(yàn)9扁豆凝集素的抑菌試驗(yàn)9扁豆凝集素的凝血活性10參考文獻(xiàn)12生物工藝大實(shí)驗(yàn)扁豆凝集素的分離純化與性質(zhì)描述生物工藝大實(shí)驗(yàn)扁豆凝集素的分離純化與性質(zhì)描述#扁豆凝集素的分離純化與性質(zhì)描述一、前言凝集素的概念及其簡(jiǎn)介凝集素是自然界廣泛存在的一大類能凝集細(xì)胞、多糖或糖復(fù)合物的非源于免疫反應(yīng)的糖蛋白，進(jìn)一步被定義為非免疫球蛋白本質(zhì)的蛋白質(zhì)或糖蛋白，它能夠特異性識(shí)別并可逆結(jié)合復(fù)雜糖復(fù)合物中的糖鏈，而不改變所結(jié)合糖基的共價(jià)結(jié)構(gòu)。它們廣泛存在于各種各樣的生物體中，并在生命活動(dòng)如病毒、細(xì)菌、支原體和寄生蟲(chóng)感染、細(xì)胞和可溶性組分之間的尋靶作用、受精作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)、分化中都起著重要作用。Peumans和Damme在1995年將植物凝集素定義為至少具有一個(gè)可與單糖或寡聚糖特異可逆結(jié)合的非催化結(jié)構(gòu)域的植物蛋白。在植物凝集素的研究中，豆科植物凝集素是最早進(jìn)行研究，并且研究的最充分。豆科凝集素盡管在糖結(jié)合專一性有不同，但它們?cè)谏锘瘜W(xué)特性、一級(jí)結(jié)構(gòu)組成方面顯示出相似性，并且依據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)順序和x-衍射晶體圖譜分析表明：其糖結(jié)合區(qū)段也非常相似。由于一個(gè)植物種族的凝集素有如此廣泛的同源性，有力的揭示了這些蛋白質(zhì)的基因編碼有共同的祖先。豆科凝集素經(jīng)常作為凝集素研究的模式蛋白質(zhì)與其它種類相互對(duì)照。凝集素可作為一種探針，廣泛的應(yīng)用于糖精細(xì)結(jié)構(gòu)、醫(yī)學(xué)治療和鑒定，并在農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因工程方面，并有著良好的前景。有些豆科凝集素（如PHA）具有刺激外周血淋巴細(xì)胞RNA合成和有絲分裂，誘發(fā)人外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗癌淋巴因子，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，能使細(xì)胞凝集和腫瘤細(xì)胞失活等生物學(xué)活性；而且，人食用未熟透的菜豆會(huì)引起中毒，國(guó)內(nèi)也經(jīng)常有因食用了未熟透的菜豆而引起中毒的報(bào)道，現(xiàn)在知道這是由于菜豆凝集素的作用結(jié)果，因此對(duì)豆科凝集素的研究深受重視。凝集素是一種非常有用的工具，可用來(lái)檢測(cè)，分離復(fù)合糖（主要是糖蛋白），并進(jìn)行性質(zhì)研究；對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行組織化學(xué)研究，檢測(cè)從細(xì)胞分化到癌發(fā)生的生理和病理過(guò)程中細(xì)胞表面發(fā)生的變化。所以對(duì)豆科植物凝集素結(jié)構(gòu)、功能的進(jìn)一步研究，不僅可以揭示植物凝集素存在的其他功能，還會(huì)促進(jìn)分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展。[1]凝集素的分類[2]按來(lái)源分類可以分為植物凝集素，動(dòng)物凝集素和微生物凝集素三類。例如，扁豆凝集素(Lensculinarislectin，LCL)是植物凝集素素，雞乳糖凝集素素(Chickenlactoselenin，CLL)是動(dòng)物凝集素，而蘑菇凝集素素(Agaricusbisporuslectin,ABL)是真菌類的微生物凝集素。按凝集素在細(xì)胞中存在部位分類可以分為可溶性凝集素和膜結(jié)合凝集素。例如，唾液酸糖蛋白(Majorsialoglcoprotein)是紅細(xì)胞膜上面結(jié)合的凝集素蛋白，這種凝集素需用緩沖溶液，甚至采用去垢劑溶解才能進(jìn)一步純化。伴刀豆凝集素(ConcanavaliaA,ConA)是典型的可溶性凝集素，可溶于0．9％生理鹽水，可以采用經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化方式純化。按凝集素的糖結(jié)合專一性分類D-甘露糖，D-葡萄糖結(jié)合，例如蠶豆凝集素(Hciafabalcclin,VFL)和豌豆凝集素(Pisumsativumlectin.PSL)。2-乙酰氨基2-脫氧-D-葡萄糖結(jié)合，例如馬鈴薯凝集素(Solanumtuberosumlecfin，STL)和麥胚凝集素(Wheatgermagglutinin,WGA).2-乙酰氨基2-脫氧-D-半乳糖結(jié)合，例如剌槐凝集素(Robiniapseudoaccacialecfin,RPL)和蝸牛凝集素(Helixpomatialectin。HPL)。D-半乳糖結(jié)合，例如蓖麻凝集素(Ricinuscommunisagglutinin，RCA)和花生凝集素(Peanut(Arachishypogaea)agglutinin，PNA)。L巖藻糖結(jié)合，例如荊豆凝集素(Ulexeuropeuslectin。UEL)和歐洲百脈根凝集素(Lotustetragonolobusleetin，LTL)。唾液酸結(jié)合，例如，龍蝦凝集素(Homarusamericanuslectin，HAL)。凝集素的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀目前，人們已分離純化的凝集素逾1000種，它們大多為植物凝集素，其中僅豆科植凝集素即達(dá)600余種。通過(guò)分離純化人們可以對(duì)凝集素的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)與功能及編碼的基因作進(jìn)一步的研究。目前已純化的凝集素的分子量一般為lOTOOkDa,如最常見(jiàn)的伴刀豆球蛋白A分子量為104kDa,但小麥胚凝集素分子量?jī)H為36kDa。通常凝集素由亞基組成，一般為2個(gè)或4個(gè)，3個(gè)的少見(jiàn)。亞基產(chǎn)生的分子機(jī)制有三種解釋：不同亞基是不同基因編碼的產(chǎn)物；不同亞基由同一基因編碼，翻譯后裂解成分子量相同或不同的肽鏈；翻譯后發(fā)生不同程度的修飾。大多數(shù)凝集素的前體分子都比成熟分子大，翻譯后經(jīng)過(guò)裂解、糖基化或其它加工后成為成熟分子。[3凝]集素不同，化學(xué)組分也是不同的，有的是簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)，有的則為糖蛋白。不同的凝集素分子還具有特定的氨基酸組分。同時(shí)，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)凝集素的糖結(jié)合位點(diǎn)也是各異的，不同的凝集素分子識(shí)別復(fù)雜碳水化合物上的特定糖殘基，與糖發(fā)生可逆結(jié)合而不改變糖苷鍵的共價(jià)結(jié)構(gòu)。雖然它們的糖結(jié)合活性各不相同，但它們的可結(jié)合的糖基類型大體可分為以下6類：（1）甘露糖（葡萄糖）；（2）N—乙酰氨基葡萄糖；（3）半乳糖；（4）N一乙酰氨基半乳糖；（5）巖藻糖；（6）唾液酸。凝集素的應(yīng)用前景凝集素的特殊的生物學(xué)功能，使其具有廣泛的利用前景。特別是隨著生物工程的研究手段和研究領(lǐng)域的不斷擴(kuò)大，凝集素的各種實(shí)際應(yīng)用也展現(xiàn)了新的途徑。凝集素在生命機(jī)體中識(shí)別外來(lái)物，在體內(nèi)＜外）起調(diào)理作用。因此它在認(rèn)識(shí)和解決集約化、半集約化的養(yǎng)殖生物的防病治病中有重要作用。對(duì)凝集素認(rèn)識(shí)的普及和研究的深入將提高我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)總體水平。對(duì)凝集素開(kāi)發(fā)、利用和生化工程技術(shù)的拓展，將會(huì)使養(yǎng)殖業(yè)及其病害防治轉(zhuǎn)化為高技術(shù)類型。凝集素的防衛(wèi)作用可應(yīng)用于抗蟲(chóng)基因工程，為抗蟲(chóng)育種提供新的途徑。雪花蓮?fù)庠茨兀℅NA）對(duì)某些咀嚼式和刺吸式昆蟲(chóng)均有抗性，如煙草夜蛾、豇豆象、飛虱、葉蟬和蚜蟲(chóng)，但對(duì)高等動(dòng)物沒(méi)有毒性。將編碼雪花蓮?fù)庠茨爻墒斓鞍椎膃DNAGNA12和其前體蛋白eDNAGNA34插入到二元載體pBin438的雙倍增強(qiáng)子CaMV35S啟動(dòng)子或二元載體pBcopl的CoYMV啟動(dòng)子下游，分別構(gòu)建成植物表達(dá)載體pBGnal2、pBGna34、pBCGnal2和pBCGna34。凝集素由于能和糖專一性識(shí)別，而且糖的專一性范圍又廣，加上易于分離純化，所以經(jīng)常作為免疫學(xué)和糖生物學(xué)的分子探針，對(duì)生理、生化過(guò)程進(jìn)行研究。首先用標(biāo)記物將凝集素標(biāo)記，再利用標(biāo)記的凝集素來(lái)研究糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、在生物體內(nèi)的分布，也可用于研究生理、病理過(guò)程。比如研究精子在與卵子結(jié)合過(guò)程中，其細(xì)胞表面受體的種類和分布的變化：研究細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中，糖結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化和蛋白質(zhì)糖基化；惡性病變細(xì)胞表面糖類結(jié)構(gòu)變化及轉(zhuǎn)移過(guò)程中糖類結(jié)構(gòu)特征等等。由于凝集素可與糖分子專一性可逆結(jié)合，從而被廣泛用于分離純化糖分子、糖蛋白、糖脂。利用凝集素分離糖蛋白開(kāi)始于ConA分離酵母蔗糖酶?，F(xiàn)在已有商品化的ConA、扁豆凝集素、PNA等親合層析柱出售。目前，己應(yīng)用GNA純化鼠血清中免疫球蛋白2M的單克隆抗體，用ConA純化絨毛膜促性腺激素(HGG)、人血清白蛋白、胰島素受體等；還有，用HA分離干擾素和免疫球蛋白等。另外，部分凝集素對(duì)人類及動(dòng)物反轉(zhuǎn)錄病毒(含HIV)和巨細(xì)胞病毒具有選擇性抑制作用。[3]細(xì)胞在正常分化、發(fā)育或異常病變過(guò)程中，其表面糖鏈結(jié)構(gòu)有很大的變化，癌變細(xì)胞往往表現(xiàn)出糖鏈的變化。且癌變細(xì)胞表面特異凝集索受體發(fā)生變化，凝集素可作為生物探針探測(cè)細(xì)胞表面糖分布及變異細(xì)胞表面糖的變化。扁豆凝集素和豌豆凝集素可鑒別診斷肝癌和肝炎患者血清中血清甲胎蛋白(AFP)的升高是源于肝癌細(xì)胞或是其它病肝細(xì)胞。國(guó)內(nèi)有人采用此法鑒別肝癌和肝炎，使肝癌假陽(yáng)性率明顯下降。ConA可用于胎兒神經(jīng)管缺陷及另一些畸形，如脊柱裂的產(chǎn)前診斷，這是?個(gè)很有價(jià)值的輔助診斷方法，幾乎所有這類畸形的妊娠婦女，羊水中糖蛋白濃度顯著降低，不與ConA發(fā)生作用或僅有輕微作用。溶酶體蓄積性疾病以某些特殊的水解酶缺乏為特征，如巖藻糖苷蓄積癥病人，缺乏a—L一巖藻糖苷酶，其神經(jīng)元及其它某些類型的細(xì)胞可與荊豆凝集素強(qiáng)烈作用,以輔助診斷。T淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)凝集素激活后，可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，根據(jù)淋巴母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況，可反應(yīng)機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，監(jiān)視各種免疫抑制和免疫增強(qiáng)的療效。用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)艾滋病人的免疫功效，亦是一個(gè)簡(jiǎn)單有效的方法。PHA、ConA等植物凝集素用作皮內(nèi)注射可反應(yīng)腫瘤、肝炎等患者的細(xì)胞免疫能力。我國(guó)目前普遍采用PHA作促細(xì)胞分裂原評(píng)價(jià)各種疾病患者的免疫功能。SBA可選擇性沉淀在骨髓移植中引起排斥反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞，收集SBA處理過(guò)的骨髓成功地用于臨床骨髓移植。PHA配合化療、放療或其它治療能夠提高單一療法的療效。對(duì)頑固性白血病、晚期惡性滋養(yǎng)葉腫瘤應(yīng)用PHA合并療法取得了明顯療效。甘潤(rùn)良等用I標(biāo)記的花生凝集素對(duì)裸鼠載人胃癌進(jìn)行靶向治療，療效顯著，腫瘤抑制率達(dá)73．2％，可延緩腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了荷瘤宿主的生存期并且對(duì)小鼠沒(méi)有毒性作用。凝集素也可在固氮工程中發(fā)揮作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)識(shí)別根瘤菌的因子是豆科植物根上的凝集素。目前，固氮工程嘗試將豆科植物的凝集素基因轉(zhuǎn)化到非豆科植物，再接種豆科植物的根瘤菌，使該種非豆科植物被侵染和結(jié)瘤。固氮菌能在豌豆上形成根瘤，但不能在白三葉草根和發(fā)根中形成根瘤。若將PSL基因轉(zhuǎn)入自三葉草后，白三葉草根毛上也產(chǎn)生了根瘤。PSL定位于轉(zhuǎn)基因白三葉草根表皮細(xì)胞的外表面和根毛間段，但正常的三葉草和發(fā)根中則沒(méi)有PSL。這種固氮方法應(yīng)用于糧食作物將有很大的意義?？傊?，凝集素最初在植物中被檢測(cè)到并命名為盤(pán)凝索，一直到目前成為具有許多重要功能和用途的普遍存在的識(shí)別分子，在這120多年來(lái)，人們對(duì)凝集素的認(rèn)識(shí)已經(jīng)有了很大的提高。凝集素作為生物體內(nèi)一類特殊的蛋白質(zhì)(糖蛋白)，在防御病原體入侵、存貯營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、?；R(shí)別等方面有其獨(dú)特的功能。我們可以利用這些特性，在生物工程、臨床研究等各方面發(fā)揮作用，利用凝集素的功能造福人類。本設(shè)計(jì)的主要研究?jī)?nèi)容包括：對(duì)扁豆凝集素分離、純化過(guò)程。對(duì)扁豆凝集素的性質(zhì)特性，包括糖結(jié)合特性，金屬離子結(jié)合特性，熱穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性等進(jìn)行研究。二、扁豆凝集素的分離純化試驗(yàn)材料扁豆種子，無(wú)水乙醚，0.15mol/LNaCl,0.02mol/LTris-HCl,硫酸銨，聚乙二醇，DEAE-52,SephacrylS-300、CMFastFlow、SephadexG-25,丙烯酰胺，亞甲基雙丙烯酰胺，鏈霉蛋白酶(pronaseE),牛血清白蛋白(BSA)，對(duì)二甲基氨基苯甲醛(DAB)、N-溴代丁二酰亞胺(NBS)。試驗(yàn)方法扁豆凝集素粗品的制備取扁豆種子100g，去皮磨成粉末，用無(wú)水乙醚(1：4,v:v)于4°C浸泡脫脂2次。然后，用含0.15mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCI,pH7.8緩沖液(1：4,v:v)在4°C下浸提兩次每次24小時(shí)。提取液經(jīng)離心(4C,lOOOOrpm,30min)后，棄去沉淀，上清液采用硫酸銨分段鹽折法，取飽和度為40%?80%的沉淀，將沉淀溶于0.02mol/LTris-HCl,pH7.8緩沖液中得到相應(yīng)的粗品。⑷扁豆凝集素的純化粗品4C下充分透析除鹽，然后上經(jīng)0.02mol/LTris-HCI,pH7.8緩沖液平衡的DEAE-52陰離子交換柱，充分淋洗后，換用含0.5mol/LNacl的相同緩沖液進(jìn)行離子線性梯度洗脫，分部收集，流速0.5ml/min,3ml/管，經(jīng)紫外和凝集兔紅細(xì)胞活性檢測(cè)后，收集活性部分。此活性部分對(duì)0.02mol/LNaAc-HAc,pH5.0緩沖液充分透析，然后上用相同緩沖液平衡的CMFastFlow陽(yáng)離子交換柱，充分淋洗后，換用含0.5mol/LNaCl的相同緩沖液進(jìn)行離子線性梯度洗脫，分部收集，流速0.5ml/min,3ml/管，經(jīng)紫外和凝集兔紅細(xì)胞活性檢測(cè)后，收集活性部分。此活性部分用聚乙二醇20000濃縮后，對(duì)含0.15mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCl，pH7.8緩沖液充分透析，并用相同緩沖液平衡SephacrylS-300柱，然后在FPLC上進(jìn)行分子篩層析純化，分部收集，流速為lml/min,3ml/管，經(jīng)紫外和凝集兔紅細(xì)胞活性檢測(cè)后,收集活性部分，再過(guò)SephadexG-25柱除鹽后得扁豆凝集素純品。⑷三、扁豆凝集素的性質(zhì)研究試驗(yàn)材料扁豆凝集素提取液，考馬斯亮藍(lán)，高碘酸-Schiff試劑，生理鹽水，PBS緩沖液，2%兔血細(xì)胞懸液，緩沖系統(tǒng)，金屬離子，乳糖，蔗糖，麥芽糖，a-半乳糖，D-果塘和葡萄糖的蒸餾水溶液，大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌等PDA培養(yǎng)平板試驗(yàn)方法扁豆凝集素的基本性質(zhì)檢測(cè)純度鑒定和糖蛋白的確定采用柱狀圓盤(pán)聚丙烯酰胺凝膠電泳，用考馬斯亮藍(lán)和高碘酸-Schiff試劑分別染色，根據(jù)凝膠呈現(xiàn)色帶的情況確定扁豆凝集素的純度和是否是糖蛋白。扁豆凝集素的等電點(diǎn)測(cè)定采用聚丙烯酰胺凝膠電聚焦發(fā)測(cè)定其等電點(diǎn)，所用凝膠濃度為7%，兩性電解質(zhì)為ph3.0-10.0的Ampholin,其最后濃度為1.5%左右，上下電極分別是5%的磷酸而后5%的乙二胺溶液。[5]分子量的測(cè)定采用Bio-Gelp100凝膠色層法，以牛血清蛋白（68000）、卵清蛋白（45000）、胃蛋白酶或乳球蛋白（35000）、和糜蛋白酶原（24500）等為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用1molNaCl溶液作為平衡也和洗脫液，在01.2X100cm玻璃柱內(nèi)進(jìn)行。⑹扁豆凝集素的活力測(cè)定取96孔微型凝血板，在每一個(gè)孔內(nèi)滴入25卩10.9%生理鹽水。取25》l硫酸銨沉淀樣品，進(jìn)行系列倍比稀釋（從前一孔吸取25卩1液體，放入下一孔內(nèi)，充分混合后25》l液體放入下一孔內(nèi)，如此操作至倒數(shù)第二個(gè)孔），留下每一排的最后一孔，作為對(duì)照。在每一個(gè)孔內(nèi)滴入25u12%兔血紅細(xì)胞，室溫下放置30min后觀察。⑺3.2.2扁豆凝集素的熱穩(wěn)定性測(cè)定在96孔V型血凝板上加45卩1凝集素溶液與等量PBS緩沖液倍比稀釋后,放在溫度為30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C水浴中保溫5min后取出，待其冷卻至室溫，加入等量的2%兔血細(xì)胞懸液，振勻。1h后，用顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。血凝活力以凝集素最大稀釋倍數(shù)（以2n表示），以PBS作空白對(duì)照。比較凝集活性。[8]堿穩(wěn)定性測(cè)定在凝血性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定兔紅血球配制成2％(體積濃度)生理鹽水重懸液，分別使用以下緩沖液為溶劑配制濃度為1-5mg/mL的凝集素溶液：NaAc--HAc緩沖液(pH3.7-5.8)NaH2P04—Na2HP04緩沖液(pH627.8)Tris—Hcl緩沖液(pH8.23-9.10)Na2C03--NaHC03緩沖液(pH9.5-10.83)Na2HP04一NaOH緩沖液(pH11.2-11.9)KCl--NaOH緩沖液(pH12.2-13.0)0.09%生理鹽水配制好的溶液在25°C水浴鍋保溫30min后，分別加入融含25pl血球緩沖液和50》l此2%(體積濃度)紅血球重懸液的“V”形板孔中，振蕩lmin,室溫下靜置1.5-2h，觀察凝血結(jié)果。⑼金屬離子結(jié)合特性試驗(yàn)將離子交換層析得到的樣品裝入透析袋內(nèi)，放入20mmEDTA溶液中24h，以螯合凝集素中的金屬離子。然后用0.9%NaC!溶液充分透析去除EDTA。取透析后的樣品進(jìn)行倍比稀釋，加入25》l2%兔紅血細(xì)胞懸液。取25》l濃度為10mm的10個(gè)過(guò)渡金屬離子和一種非金屬離子，即Ba2+、K2+、Za2+、Li2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Fe3+、A13+和Mn2+等lO個(gè)金屬離子和NH+q離子放入V型血凝孔內(nèi)。另取25卩10.09%NaCl溶液作為對(duì)照。靜置1h后觀察現(xiàn)象并讀取血凝孔數(shù)。[10]扁豆凝集素的糖抑特性試驗(yàn)用0.9%生理鹽水倍比稀釋離子交換層析得到的樣品后，在每一個(gè)稀釋孔內(nèi)加入依次分別加入25卩150mM,100mM和200mM濃度的乳糖，蔗糖，麥芽糖，a-半乳糖，D-果塘和葡萄糖的蒸餾水溶液。隨后在每一個(gè)稀釋孔內(nèi)加入25》l2%兔紅血細(xì)胞懸液。靜置30min后觀察凝血現(xiàn)象并讀取凝血孔數(shù)。m扁豆凝集素的抑菌試驗(yàn)本過(guò)程采用濾紙圓片法，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行如下操作(所有器材均已滅菌)：將1mL滅菌生理鹽水注入長(zhǎng)滿菌絲或已形成孢予的病菌試管中，振蕩、搖勻。將菌液移入從50°C烘箱取出的PDA平皿，仔細(xì)搖晃、混勻，平放至冷卻、凝固。將生理鹽水過(guò)濾到1小試管中，用細(xì)菌過(guò)濾器將扁豆凝集素生理鹽水溶液過(guò)濾到另一小指管中。[12]用小鑷子將濾紙圓片在凝集素溶液中、生理鹽水中浸潤(rùn)(但不滴瀝)將濾紙圓片按以下規(guī)格擺放到先前準(zhǔn)備好的PDA平皿中，沿平皿圓周(距皿沿0.5cm)繞圓心每隔60度擺放1片，共5片，余下位置放生理鹽水片。將PDA平皿倒置，25C培養(yǎng)，此后l周內(nèi)，每天察記錄抑菌情況。[⑶扁豆凝集素的凝血活性紅血球溶液的制備按如圖1所示的流程進(jìn)行操作：從動(dòng)物體或人體現(xiàn)采的新鮮血液，按血：抗凝劑=9:1的比例保存在預(yù)裝有抗凝劑的30mL塑料離心管。帶回實(shí)驗(yàn)室離心、去除上清液，沉淀用生理鹽水重懸，再離心(如此重復(fù)4次)，最后用生理鹽水將沉淀配制成2％(體積濃度)紅血球溶液備用。[14]凝血反應(yīng)試驗(yàn)按如圖2所示的流程進(jìn)行操作：將96孔的“V'形孔凝血板安放在微型混和器上，往凝血板各孔滴加25pl血球緩沖液。接通電源開(kāi)始震蕩，往每行的第一孔滴加25pl凝集素樣品，與血球