枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕效果比較

枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕效果比較馬靜;劉志國;薛德林;索艷麗【摘要】以豆粕為主要原料，通過測定6株枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的粗蛋白、酸溶蛋白含量,并利用SDS對發(fā)酵豆粕中的大豆抗原蛋白降解情況進(jìn)行定性分析，比較枯草芽孢桿菌對豆粕的作用效果，篩選出發(fā)酵豆粕優(yōu)勢菌株.試驗結(jié)果顯示,與豆粕相比,6株枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕48、72、120h的粗蛋白和酸溶蛋白含量均有所提高，但提高的程度有所差異;菌株Y6發(fā)酵豆粕效果優(yōu)于其他五株枯草芽孢桿菌，發(fā)酵120h的粗蛋白提高了15.7%,酸溶蛋白含量可達(dá)9.85%,抗原完全降解.【期刊名稱】《現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)》【年(卷)，期】2019(000)002【總頁數(shù)】4頁(P24-27)【關(guān)鍵詞】枯草芽孢桿菌涸態(tài)發(fā)酵;豆粕;抗原蛋白;粗蛋白;酸溶蛋白【作者】馬靜;劉志國;薛德林;索艷麗【作者單位】遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司，遼寧沈陽110033;遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司，遼寧沈陽110033;遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司，遼寧沈陽110033;中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧沈陽110016;遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司，遼寧沈陽110033【正文語種】中文【中圖分類】S816豆粕因其蛋白質(zhì)含量豐富，成為目前畜牧業(yè)中使用最為廣泛的植物性蛋白原料，但豆粕中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，包括抗原蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水蘇糖、脲酶等［1］，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子嚴(yán)重影響了動物機體對豆粕中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，對動物機體的某些器官造成影響和損傷［2］。豆粕中抗原蛋白為大豆球蛋白（Glycinin，又稱11s球蛋白，由酸性多肽和堿性多肽組成）、陽伴大豆球蛋白（陽Conglycinin，又稱7s球蛋白，由a、a,、B三種亞基組成）很難去除，利用微生物發(fā)酵可以有效降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，在發(fā)酵過程中微生物分泌的酶可將豆粕中的大分子蛋白降解為易吸收的小分子蛋白。枯草芽孢桿菌是目前主要生產(chǎn)工業(yè)酶的菌種之一［3］，也是理想的微生物功能性飼料添加劑，其產(chǎn)生的芽孢有強的耐酸、耐膽鹽、耐熱等特性，維持并調(diào)整動物機體胃腸道的微生態(tài)平衡，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的酶可以促進(jìn)動物的消化吸收。利用枯草芽孢桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵豆粕，可以使豆粕中的各種抗?fàn)I養(yǎng)因子有效被降低，從而提高豆粕的飼用價值［4］。1材料與方法1.1試驗材料1.1.1原料國產(chǎn)去皮豆粕（粗蛋白含量43%）市場采購。1.1.2菌株菌株：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），編號Y1~Y6均由本公司實驗室保藏。1.1.3培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：蛋白腺10g，酵母提取物5g,氯化鈉10g，蒸餾水1000mL,固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂，高壓滅菌。1.2試驗方法1.2.1種子液制備將本實驗室保藏的6株枯草芽孢桿菌活化后分別接種到配制好的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)24h。1.2.2固體發(fā)酵及樣品處理稱取500g豆粕裝于三角瓶內(nèi)，將6株枯草芽孢桿菌（Y1~Y6）種子液按5%接種量接種于豆粕，即為6個試驗組（I~VI），加水使發(fā)酵豆粕的最初料、水質(zhì)量比為1:0.5，攪拌均勻后放置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵，每個試驗組分別于48、72、120h3個發(fā)酵時間點各取樣3份，60C烘干后粉碎過80目篩，測定烘干樣品的粗蛋白、酸溶蛋白含量以及大豆抗原蛋白的定性檢測，以未發(fā)酵豆粕為對照組。1.2.3水分測定按照GB/T6435標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定。1.2.4粗蛋白的測定按照GB/T6432-1994標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定。1.2.5酸溶蛋白的測定按照GB/T22492-2008標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定。1.2.6大豆抗原的定性分析采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）對抗原蛋白降解情況進(jìn)行定性分析。1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS22.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析及Duncan's法多重比較，P<0.05為差異顯著。2結(jié)果與分析2.1不同枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵豆粕粗蛋白及酸溶蛋白含量檢測結(jié)果枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕48、72、120h的粗蛋白及酸溶蛋白含量檢測結(jié)果如表1和表2所示。結(jié)果顯示，與對照組未發(fā)酵豆粕相比，發(fā)酵48、72、120h6個試驗組發(fā)酵豆粕的粗蛋白和酸溶蛋白含量均有所提高，隨著發(fā)酵時間的延長，每個試驗組在不同發(fā)酵時間粗蛋白和酸溶蛋白含量比較結(jié)果均為120h>72h>48h,發(fā)酵120h效果優(yōu)于發(fā)酵72h和48h。表1和表2結(jié)果顯示，比較6個試驗組發(fā)酵相同時間的粗蛋白及酸溶蛋白含量有所差異。發(fā)酵48h時，試驗組V和V的粗蛋白差異不顯著，與其他四組（I~IV）相比差異顯著（P<0.05）;發(fā)酵72h時，試驗組H至V的粗蛋白差異不顯著，試驗組VI的粗蛋白明顯高于其他五組（I~V），差異顯著（P<0.05）;發(fā)酵120h，試驗組V的粗蛋白仍明顯高于其他五組試驗組（I~V），差異顯著（P<0.05）;發(fā)酵48、72、120h時，試驗組VI的酸溶蛋白含量均高于其他五組試驗組（I~V），差異顯著（P<0.05）。結(jié)果表明，發(fā)酵48、72、120h，菌株Y6發(fā)酵豆粕粗蛋白和酸溶蛋白含量均優(yōu)于其他五株（Y1~Y5）枯草芽孢桿菌，發(fā)酵120h時粗蛋白提高了15.66%，酸溶蛋白含量可達(dá)9.85%。表1發(fā)酵豆粕48h、72h、120h粗蛋白含量（%）Table1Crudeproteincontentoffermentedsoybeanmealat48h,72hand120h注：發(fā)酵豆粕檢測結(jié)果均按檢測物中水分為10%計算；同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著（P>0.05），不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），下表同。時間48h72h120h對照組43.10±0.11e43.10±0.11d43.10±0.11e試驗組I44.35±0.09d45.01±0.11c48.21±0.17dH44.26±0.08cd45.94±0.08b48.40±0.14cdB44.48±0.15cd45.65±0.24b48.07±0.12bcdIV44.56±0.25bc45.78±0.08b48.15±0.07bcV44.76±0.04ab45.95±0.11b48.49±0.09bV44.89±0.13a46.28±0.06a49.85±0.35a表2發(fā)酵豆粕48h、72h、120h酸溶蛋白含量（%）Table2Acidsolubleproteincontentoffermentedsoybeanmealat48h,72hand120h時寸間48h72h120h對照組3.72±0.07d3.72±0.07e3.72±0.07e試驗組I5.92±0.13c7.77±0.11d8.47±0.13dH5.74±0.08bc7.89±0.06cd8.61±0.11cdB5.72±0.07bc7.69±0.10cd8.52±0.12bcdV5.80±0.19bc7.98±0.11c8.35±0.07bcV5.95±0.14b8.45±0.22b8.70±0.15bV6.56±0.06a8.98±0.10a9.85±0.07a2.2不同枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵豆粕抗原定性結(jié)果6株枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕48、72、120h的SDS結(jié)果如圖1所示。由圖1（b）所示，與豆粕條帶相比，6株菌發(fā)酵豆粕48h抗原均有部分降解，且降解程度不同，Y5與另外5株菌發(fā)酵豆粕相比7S球蛋白降解明顯，Y6與另外5株菌發(fā)酵豆粕相比11S球蛋白降解明顯；由圖1(C)所示，與48h相比，發(fā)酵72h時6株菌發(fā)酵豆粕抗原蛋白均進(jìn)一步降解，且11S球蛋白降解明顯，Y1~Y6發(fā)酵豆粕相比，Y6發(fā)酵豆粕抗原降解程度最大；由圖1(d)所示，與豆粕及發(fā)酵48h、72h結(jié)果相比，發(fā)酵120h,Y1~Y5菌株發(fā)酵豆粕抗原條帶顏色變淺，寬度變窄，抗原基本降解，而Y6發(fā)酵豆粕抗原條帶基本消失，完全降解。3討論圖1不同菌株發(fā)酵豆粕48h、72h、120hSDS結(jié)果Fig.1ResultsofSDSoffermentedsoybeanmealbydifferentstrainsfor48h,72hand120h0:豆粕；1、2、3、4、5、6分別為Y1~Y6發(fā)酵豆粕樣品研究表明，豆粕中的抗原蛋白即大豆球蛋白和P-伴大豆球蛋白是引起動物機體過敏和腹瀉的主要成分，劉明美等［5］研究大豆抗原蛋白對幼齡動物致敏作用，表明由于幼齡動物的消化器官發(fā)育不成熟，消化酶系發(fā)育不完善，消化功能不健全，進(jìn)入機體內(nèi)的大豆抗原蛋白可引起犢牛及仔豬的腹瀉，目前使用復(fù)合酶制劑消除抗原蛋白的方法成為研究熱點［6］,但是酶制劑成本較高，不利于長期、大量應(yīng)用到飼料中。微生物發(fā)酵是一種有效去除抗原蛋白的手段，效率高，成本低，可明顯提高飼料適口性，并且沒有殘留，應(yīng)用安全［7］。枯草芽孢桿菌在快速繁殖過程中能產(chǎn)生多種酶系，如堿性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、糖化酶和纖維素酶，且活性很高［8］。卓林霞等［9］研究枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)蛋白酶，結(jié)果顯示發(fā)酵豆粕中蛋白酶活力可達(dá)648U/g，較發(fā)酵前提高了2.55倍，說明枯草芽孢桿菌可通過固體發(fā)酵產(chǎn)生有活力的酶；程天德等［10］利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆粕，結(jié)果顯示85.93%的大豆蛋白質(zhì)被降解；管風(fēng)波等［11］通過研究枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆粕產(chǎn)蛋白酶，結(jié)果表明枯草芽孢桿菌不同菌株具有不同的發(fā)酵能力、產(chǎn)酶能力。本研究應(yīng)用不同菌株的枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕，相同發(fā)酵條件下，不同的時間、不同菌株發(fā)酵效果不同，發(fā)酵48h粗蛋白和酸溶蛋白含量有所升高，但抗原降解效果不明顯；發(fā)酵72h粗蛋白和酸溶蛋白含量與48h相比有所提高，抗原部分降解，條帶顏色變淺，且菌株Y6效果優(yōu)于其他菌株；發(fā)酵120h粗蛋白提高11.5%~15.7%，酸溶蛋白含量可達(dá)9.85%，且抗原降解效果好，菌株Y6發(fā)酵120h抗原完全降解，結(jié)果說明枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕可提高粗蛋白和酸溶蛋白含量，且菌株Y6對抗原作用效果最好。利用枯草芽孢桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵豆粕，可以提高豆粕粗蛋白及酸溶蛋白含量，并且產(chǎn)生多種消化酶可以有效的降解豆粕中抗原蛋白。此外，發(fā)酵可產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物，對促進(jìn)營養(yǎng)消化吸收、提高飼料轉(zhuǎn)化率、防病和促進(jìn)生長起重要作用［12］。4結(jié)論本試驗利用6株枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕，對發(fā)酵不同時間的豆粕進(jìn)行取樣測定，結(jié)果顯示，相同發(fā)酵條件下，6株菌發(fā)酵豆粕120h效果優(yōu)于48h和72h,且抗原降解程度隨著發(fā)酵時間的延長而增加，但不同枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵豆粕的粗蛋白及酸溶蛋白含量不同，且對抗原的降解作用也有所差異；枯草芽胞桿菌Y6發(fā)酵豆粕120h粗蛋白含量提高15.7%，酸溶蛋白含量可達(dá)9.85%，抗原完全降解，屬于降解豆粕抗原蛋白的優(yōu)勢菌株。本研究通過多重比較不同枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的粗蛋白及酸溶蛋白含量變化，發(fā)現(xiàn)不同的菌株發(fā)酵效果有所差異，且抗原降解程度也有所區(qū)別。為了提高發(fā)酵豆粕的品質(zhì)，也為發(fā)酵豆粕在飼料業(yè)的發(fā)展提供理論參考及實踐指導(dǎo)，在今后的研究中將對發(fā)酵豆粕的影響因素做進(jìn)一步篩選及分析。參考文獻(xiàn)【相關(guān)文獻(xiàn)】侯玉潔，徐俊，姚毅，等.發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)特點及其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].養(yǎng)豬，2017,4:17-21.田冬冬，張穎，劉志強，等.發(fā)酵豆粕在仔豬日糧中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2015，6:49-53.劉穎，張彬彬，孫冰玉，等.枯草芽孢桿菌高產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2014，35(13)：166-170.周爽，張青，齊曉芬，等枯草芽孢桿菌和中性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵豆粕方法的研究[J].食品工業(yè)，2016(37)：163-168.劉明美，趙國琪.大豆抗原蛋白對幼齡動物致敏作用的研究進(jìn)展[J].中國飼料，2011(14):6-8.BaoYR,WeiXQ.Researchsurveyofsoybeanantinutritionfactors[J].ChinaFoodandNutrition,2010(9):20-23.李婷琳，孫澤威.大豆抗原蛋白去除工藝的研究進(jìn)展[J].大豆科學(xué)，2012,31(2):312-315.FENGJ,LIUX,XUZR,etal.Effectoffermentedsoybeanmealonintestinalmorphologyanddigestiveenzymeactivitiesinweanedpiglets[J].Di