付強-金磁微粒為載體的乙肝病毒表面抗原免疫學檢測方法的建立(西北大學碩士學位答辯PPT)2007.5

金磁微粒為載體的乙肝病毒表面抗原免疫學檢測方法的建立

答辯人付強專業(yè)生物化學與分子生物學指導老師崔亞麗教授

答辯日期2007-5-31西北大學碩士研究生論文答辯1

答辯內(nèi)容

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背景介紹

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研究報告金磁微粒為載體的磁分離酶聯(lián)免疫法檢測乙肝病毒表面抗原方法的建立

金磁微粒為載體的化學發(fā)光酶免疫分析法檢測乙肝病毒表面抗原方法的建立

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全文總結(jié)

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致謝西北大學碩士研究生論文答辯2西北大學碩士研究生論文答辯背景介紹乙型肝炎病毒概述?乙肝病毒（HBV）是一種嗜肝性DNA病毒，它是引起乙型病毒性肝炎的病原體。

電鏡下HBV顆粒的三種形態(tài)（摘自NEnglJMed2004,350:1118-29）HBV結(jié)構(gòu)模擬圖3西北大學碩士研究生論文答辯背景介紹乙肝病毒表面抗原（HBsAg）4HBsAg種類大蛋白（LHBs）中蛋白（MHBs）主蛋白（SHBs）西北大學碩士研究生論文答辯背景介紹5HBsAg的主要作用介導病毒進入宿主細胞誘導機體產(chǎn)生保護性抗體（HBsAb）早期診斷的血清學標志乙肝病毒表面抗原的常用免疫學檢測方法比較

西北大學碩士研究生論文答辯方法

優(yōu)點

缺點

雙抗體夾心ELISA法

操作簡便、快速，特異性高

靈敏度不夠高，容易出現(xiàn)漏檢膠體金免疫層析測定法

簡便、快速，操作簡單等優(yōu)點，適用于急診檢驗的需要靈敏度不如ELISA法，須與ELISA法并用

免疫熒光法

特異性強、敏感性高、速度快非特異性染色問題尚未完全解決，技術(shù)程序也比較復雜放射免疫分析法

靈敏度高達ng甚至pg水平，特異性強，精度高，可進行超微量分析存在放射性污染，不易保存，穩(wěn)定性差背景介紹6西北大學碩士研究生論文答辯以磁性微粒為載體的磁分離酶聯(lián)免疫技術(shù)（MAIA）背景介紹?磁性微粒的定義：磁性微粒(magneticparticles)，又稱磁性微球(magneticbeads或magneticmicrospheres)，是由超順磁性納米粒子與高分子或其它無機材料復合形成的膠態(tài)顆粒。7金外殼磁內(nèi)核GoldMagTM-AS微米金磁微粒磁分離酶聯(lián)免疫法(magneticaffinityimmunoassay,MAIA)是20世紀80年代中期由瑞士Serono診斷中心發(fā)明的一種免疫檢測新技術(shù)。

MAIA技術(shù)具有靈敏度高、檢測速度快、特異性高、重復性好、無放射性污染等優(yōu)點，在醫(yī)學檢測、食品安全檢測等領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景。西北大學碩士研究生論文答辯化學發(fā)光免疫技術(shù)背景介紹概念：集靈敏的化學發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測定于一體的檢測技術(shù)。特點：

特異性高，敏感性高，操作簡便、快速，試劑無毒，安全穩(wěn)定，可自動化。目前，已有許多將化學發(fā)光免疫技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測的研究報道。如應(yīng)用化學發(fā)光免疫分析法定量檢測乙肝病毒標志物1，磁分離-酶標記-化學發(fā)光法測定促甲狀腺素2等；相關(guān)的檢測儀器，如：ACCESS化學發(fā)光免疫分析儀(美國BeckmanCoulter公司)81.化學發(fā)光免疫分析定量檢測乙肝病毒標志物方法學研究，標記免疫分析與臨床，2004,(11)3:157~159.2.磁分離-酶標記-化學發(fā)光法測定促甲狀腺素的應(yīng)用，國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗學分冊，2005,(26)4:193~198.西北大學碩士研究生論文答辯以金磁微粒為載體的HBsAg免疫學檢測方法原理圖背景介紹9++化學發(fā)光金磁微?！狝nti-HBsHBsAgAg-Ab復合物HRP-Ab+Luminol,H2O2,PIPAg-Ab-酶復合物｛TMB底物檢測吸光度與樣品濃度成正比西北大學碩士研究生論文答辯研究目的及意義?研究目的以金磁微粒為載體，建立乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的免疫學檢測方法，并用標準HBsAg血清盤對該方法進行驗證和比較，以期開發(fā)新的檢測系統(tǒng)用于HBsAg的檢測。

背景介紹?研究意義HBsAg的檢測可用于體檢、獻血員篩選、血液制品的復檢、了解乙肝病毒感染者的感染狀況、療效觀察及預后評估，另外還用于乙型肝炎的流行病學調(diào)查。10實驗I西北大學碩士研究生論文答辯Ⅰ.以金磁微粒為載體的磁分離酶聯(lián)免疫法檢測乙肝病毒表面抗原

HBV表面抗體在金磁微粒表面的包被

包被抗體和酶標抗體最佳工作濃度的選擇

溫育時間的選擇顯色時間的選擇精密度考察靈敏度考察特異性考察11實驗I西北大學碩士研究生論文答辯HBV表面抗體在金磁微粒表面的包被

包被前抗體溶液在280nm處具有明顯的光吸收，包被反應(yīng)完畢后剩余溶液在280nm處幾乎沒有光吸收出現(xiàn)，說明抗乙肝病毒表面抗原單克隆抗體幾乎全部包被在金磁微粒表面。

HBsAb包被前后的紫外吸收曲線

12實驗I西北大學碩士研究生論文答辯包被抗體和酶標抗體最佳工作濃度的確定

不同量的包被抗原和不同稀釋度的HRP-標記抗原條件下檢測的陽性和陰性血清結(jié)果注：P：陽性血清；N：陰性血清酶標抗體稀釋度

501002003004001:600PN1.3310.0562.3210.0582.5730.0692.5820.0512.7690.0531:800PN1.140.052.1680.0582.3080.0542.5330.0522.3620.0531:1000PN0.8480.051.8390.052.0740.052.1750.052.2080.051:2000PN0.5610.051.1130.051.3300.051.4720.051.5060.511:3000PN0.2940.050.3710.050.5370.050.4780.050.4830.05抗體包被量（ng/孔）

當控制陽性對照OD值在2.0以上，陰性對照OD值在0.05以下（小于0.05，以0.05計）時，有三個方案可滿足此條件，為了減少實驗成本，我們選擇抗原包被量為200ng/孔，酶標抗體1:1000稀釋作為本實驗的最佳條件。13實驗I西北大學碩士研究生論文答辯溫育時間的選擇吸光度值隨溫育時間的變化

本實驗中，選用溫育時間為25min，此時抗原抗體反應(yīng)已達平衡，且時間波動對吸光度值影響較小。

14實驗I西北大學碩士研究生論文答辯顯色時間的選擇5min10min15min陽性對照2.6912.860OUT陰性對照0.0630.0870.113不同顯色時間下的檢測結(jié)果

本實驗中，顯色時間為15min時，非特異性的值較高，而顯色10min和顯色5min相比，陽性值和陰性值均變化不大，說明5min時，顯色反應(yīng)已達平衡。因此，選擇5min作為最佳的顯色時間。15實驗I西北大學碩士研究生論文答辯臨界值(Cut-off)的確定16吸光度值OD=0.105

陰性血樣OD值分布平均值OD值：X=0.05根據(jù)常用的臨界值判定標準來計算該方法的臨界值，即為陰性對照平均值×2.1，陰性對照平均值<0.05時，陰性對照值以0.05計算，得Cut-off值為0.105，我們將OD=0.105作為本實驗中判定陽性血樣的臨界值。實驗I西北大學碩士研究生論文答辯金磁微粒為載體HBsAg檢測系統(tǒng)的精密性檢測結(jié)果

次數(shù)檢測結(jié)果(扣除空白值)陽性檢測平均值(扣除空白值)RSD(%)(批內(nèi)-)1P2.0582.2242.1702.1112.2132.1562.91N0.050.050.050.050.052P1.8502.1322.2172.2302.2192.1306.77N0.050.050.050.050.053P2.1372.1112.1902.1572.1492.1491.20N0.050.050.050.050.054P2.0912.1322.2302.1622.2042.1632.29N0.050.050.050.050.055P2.0452.0772.1712.1022.1502.1092.19N0.050.050.050.050.05RSD(%)(批間-)2.03

除一組檢測外，方法的批內(nèi)相對標準偏差（RSD）均小于5%，批間RSD僅為2.03%。另外，用該系統(tǒng)對HBsAg國家參考標準品也進行了精密度測定，檢測10份樣品的相對標準偏差（RSD）為8.3%，這符合HBsAg國家參考標準品的精密度要求（RSD應(yīng)小于15%）。說明金磁微粒為載體HBsAg檢測系統(tǒng)的精密性較好。17實驗I西北大學碩士研究生論文答辯靈敏度考察adr亞型陽性對照陰性對照0.2ng/mL0.5ng/mL1.0ng/mLOD（扣除空白）OUT0.050.1430.1540.145adw亞型陽性對照陰性對照0.5ng/mL1.0ng/mL2.0ng/mLOD（扣除空白）OUT0.050.1100.1770.300ay亞型陽性對照陰性對照0.5ng/mL1.0ng/mL2.0ng/mLOD（扣除空白）OUT0.050.0600.1080.184adr亞型陽性對照陰性對照0.2ng/ml0.5ng/ml1.0ng/mlOD（扣除空白）

OUT0.050.050.0910.187adw亞型陽性對照陰性對照0.5ng/ml1.0ng/ml2.0ng/mlOD（扣除空白）OUT0.050.0370.0910.204ay亞型陽性對照陰性對照0.5ng/ml1.0ng/ml2.0ng/mlOD（扣除空白）OUT0.050.0260.0740.146金磁微粒為載體HBsAg檢測系統(tǒng)的靈敏度檢測結(jié)果

商品化的ELISA試劑盒的靈敏度檢測結(jié)果

注：OUT表示所測值超出儀器的檢測范圍

18實驗I西北大學碩士研究生論文答辯特異性考察

用本系統(tǒng)檢測HBsAg國家參考品的20份陰性血清及3份強陽性血清，結(jié)果顯示，陰性符合率為100%(20/20)，陽性符合率為100%(3/3)。此外檢測了203份獻血者的血樣，其結(jié)果與應(yīng)用商品化試劑盒的結(jié)果一致。同時檢測了81份HBsAg陰性獻血者的血樣，其陰性符合率為100%(81/81)。

19陽性參考品1.4392.552.708陰性參考品0.0640.0710.0540.0460.0590.0820.0600.0510.0520.0670.0550.0520.0690.0530.0530.0540.0670.0550.0450.071實驗I西北大學碩士研究生論文答辯小結(jié)建立了以金磁微粒為載體，檢測血清中HBsAg的方法。精密性試驗表明，應(yīng)用該法檢測陽性血清及陰性血清時，方法的批內(nèi)及批間相對標準偏差在1.20~7%的范圍，符合臨床檢測要求。選用衛(wèi)生部臨床檢驗中心的HBsAg國家參考品對本系統(tǒng)進行靈敏度分析，結(jié)果顯示乙肝病毒表面抗原adw，adr，ay三種亞型的最低檢出濃度分別為0.5ng/ml，0.5ng/ml及1.0ng/ml；符合HBsAg國家參考品靈敏度檢測的標準，且與目前商品化ELISA試劑盒的檢測水平相當。用該方法檢測獻血員血清