高效液相色譜法課件

第三章高效液相色譜法(HPLC)第一節(jié)

概述一．定義以液體為流動(dòng)相的色譜法，包括1．經(jīng)典液相色譜法：普通固定相、流動(dòng)相常壓輸送2．高效液相色譜法：高壓輸送、高效固定相、在線檢測(cè)、儀器化二．HPLC與GC應(yīng)用范圍對(duì)比GC：有機(jī)物的20%HPLC：有機(jī)物的80%（適合揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大的高分子化合物及離子型的化合物）第三章高效液相色譜法(HPLC)一．定義以液體為流1三．HPLC的特點(diǎn)：①適用范圍廣②分離性能好③分析速度快④流動(dòng)相可選擇性范圍寬⑤靈敏度高⑥色譜柱可反復(fù)使用⑦流出組分容易收集⑧安全三．HPLC的特點(diǎn)：2第二節(jié)高效液相色譜法分類與基本原理

一．HPLC的分類

第二節(jié)高效液相色譜法分類與基本原理一．HPLC的分類3二．基本原理HPLC是將經(jīng)典液相色譜法與氣相色譜法的基本原理和實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合而產(chǎn)生的，因此氣相色譜法的基本概念，保留值于分配系數(shù)的關(guān)系，塔板理論及速率理論，都可用于高效液相色譜法，他們的主要差別在于流動(dòng)相的不同。（一）VanDeemter方程式

1．在GC中表現(xiàn)形式H=A+B/u+Cu--------填充柱

H=B/u+Cu--毛細(xì)管柱（A=0）二．基本原理1．在GC中表現(xiàn)形式42．在HPLC中B=2γDmDm∝T/ηHPLC中的Dm比GC中的Dg小105倍H=A+Cuu↑,H↑,n↓2．在HPLC中5第三節(jié)各類高效液相色譜法

一．液-固吸附色譜法

（一）分離機(jī)制

k↑,tR↑,t’R

↑吸附色譜法是被分離的組分分子與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面的活性中心，靠溶質(zhì)分子的吸附系數(shù)的差別而分離。第三節(jié)各類高效液相色譜法一．液-固吸附色譜法k↑,t6

（二）固定相1．硅膠多孔硅膠，表面積大，容量大。如（1）無定形多孔硅膠，塔板數(shù)2×104～5×104m-1（2）球形多孔硅膠，塔板數(shù)8×104m-1（3）堆積硅球，塔板數(shù)8×104m-12．高分子多孔微球（有機(jī)膠）分離機(jī)制：吸附或吸附、分配及空間排斥兼有特點(diǎn)：柱效低（103m-1）,但選擇性好，峰形好（二）固定相7

（三）流動(dòng)相烷烴（底劑）+極性調(diào)節(jié)劑----------二元、多元溶劑系統(tǒng)溶劑極性大，洗脫力強(qiáng)，k↓,tR↓（四）固定相和流動(dòng)相的選擇1．固定相的選擇：5～10μm,比表面積大，含水量小2．流動(dòng)相的選擇：TLC（薄層色譜）為先導(dǎo)（三）流動(dòng)相8二．液-液分配色譜法（一）分離機(jī)制1．正相液-液分配色譜法（NLLC）流動(dòng)相極性小于固定相極性-------正相色譜正相洗脫,極性小的先出色譜柱流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↑，k↓,tR↓

二．液-液分配色譜法9

2．反相液-液分配色譜法（RLLC）流動(dòng)相極性大于固定相極性-------反相色譜流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↓，k↑,tR↑極性大的先出色譜柱2．反相液-液分配色譜法（RLLC）10三．化學(xué)鍵合相色譜法(BPC)（一）反相鍵合相色譜法（RBPC）固定相：十八烷基鍵合相（ODS）流動(dòng)相：MeOH–H2O,CH3CN-H2O1.

分離機(jī)制-------吸附、分配兼而有之2.

流動(dòng)相極性與容量因子的關(guān)系流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↓，k↑,tR↑（主要用于非極性化合物的分離）三．化學(xué)鍵合相色譜法(BPC)11（二）正相鍵合相色譜法（NBPC）固定相：氨基、氰基鍵合相氰基與硅膠相似，比硅膠極性?。ü枘z可以分離的都可用氰基分離）氨基鍵合相------適合于分離糖類物質(zhì)流動(dòng)相：烷烴（底劑）+極性調(diào)節(jié)劑-----二元、多元溶劑系統(tǒng)

1．分離機(jī)制誘導(dǎo)力、色散力、范德華力2．流動(dòng)相極性與容量因子的關(guān)系流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↑，k↓,tR↓極性小的先出色譜柱（二）正相鍵合相色譜法（NBPC）12（三）離子對(duì)色譜法（PIC或IPC）RPIC----反相離子對(duì)色譜法（在極性流動(dòng)相加入離子對(duì)試劑，被分析的樣品離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離子生成不帶電的中性離子對(duì)，增加樣品離子在非極性固定相中的溶解度，分配系數(shù)增加，改善分離效果），1離子對(duì)試劑：分離酸性或帶負(fù)電荷物質(zhì)，選擇銨鹽離子對(duì)分離堿性或帶正電荷物質(zhì)，選擇烷基磺酸（硫酸）鈉（三）離子對(duì)色譜法（PIC或IPC）1離子對(duì)試劑：分離酸性132分離機(jī)制離子對(duì)模式說流動(dòng)相pH值：pH2～8有機(jī)溶劑的選擇：甲醇、乙腈2分離機(jī)制離子對(duì)模式說流動(dòng)相pH值：pH2～814（四）離子抑制色譜法(ISC)反相色譜法中，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，抑制樣品組分的解離，增加它在固定相中的溶解度，達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，這種技術(shù)稱為離子抑制色譜法。1．適用范圍：3.0≤pKa≤7.0的弱酸，7.0≤pKa≤8.0的弱堿

（四）離子抑制色譜法(ISC)152．容量因子及其影響因素對(duì)于弱酸：pH＜pKa,以分子形式存在，k↑,tR↑pH＞pKa,以離子形式存在，k↓,tR↓對(duì)于弱堿，情況相反3.

離子抑制色譜（反相）流動(dòng)相中加入弱酸（HAc）或弱堿（NH3·H2O）或緩沖液（磷酸鹽）流動(dòng)相pH2～82．容量因子及其影響因素16四．對(duì)流動(dòng)相的要求和洗脫方式（一）要求：（1）不與固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)（2）對(duì)樣品有良好的溶解度k1～10可用范圍，k2～5最佳范圍（3）與檢測(cè)器相適應(yīng)溶劑的截止波長(zhǎng)，如水190nm,甲醇205nm，測(cè)定波長(zhǎng)大于溶劑的截止波長(zhǎng)（4）純度高，粘度小

四．對(duì)流動(dòng)相的要求和洗脫方式17（二）洗脫方式：（1）恒組成溶劑洗脫（2）梯度洗脫（梯度淋洗或程序洗提）在一個(gè)分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動(dòng)相的濃度配比。用于極性差別較大的混合物的分離。

（二）洗脫方式：18薄層色譜法

一．分類和原理1．定義：固定相均勻地涂鋪在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬板上形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離的方法稱為薄層色譜法薄層色譜法一．分類和原理192分類

2分類20原理（吸附色譜法）吸附劑對(duì)物質(zhì)A、B具有不同的吸附能力，展開劑對(duì)A、B有不同的溶解、解吸能力，KA≠KB。K↑，移動(dòng)速度慢。原理（吸附色譜法）21

二．薄層色譜(TLC)參數(shù)（一）定性參數(shù)1.比移值（Rf）組分的Rf值主要受展開劑（柱色譜中的流動(dòng)相）的組成、比例影響二．薄層色譜(TLC)參數(shù)組分的Rf值主要受展22定時(shí)展開：Rf=u/uo①在TLC中定時(shí)展開，t相等②在柱色譜中定距展開，l=lo

Rf可用范圍為0.2～0.8,最佳范圍0.3～0.5定時(shí)展開：Rf=u/uo232.相對(duì)比移值（Rr）

Rf(a)，Rf(s)分別為組分a和參考物質(zhì)s在同一薄層板上、同一展開條件下測(cè)得的Rf值,la，ls分別為原點(diǎn)至組分a和參考物質(zhì)s的斑點(diǎn)中心的距離。優(yōu)點(diǎn)：可消除系統(tǒng)誤差，重現(xiàn)性好

2.相對(duì)比移值（Rr）Rf(a)，Rf(s)分別為組分a24

（二）相平衡常數(shù)1．分配系數(shù)與比移值之間的關(guān)系R’=u/uo,R’------組分在展開劑中出現(xiàn)的幾率Rf=l/lo=u/uo,所以R’=RfVs-------薄層板上固定相的體積，Vm------薄層板上展開劑的體積，組分K↑,Rf↓（二）相平衡常數(shù)25