堿性磷酸酶檢測試劑盒注冊技術審查指導原則國家食品藥品監(jiān)督管理

附件9堿性磷酸酶檢測試劑盒產(chǎn)品注冊技術審查指導原則本指導原則的主要目的是規(guī)范堿性磷酸酶檢測試劑（盒）的技術審評工作，幫助審評人員理解和掌握該類產(chǎn)品的原理、組成、性能、預期用途等內容，明確技術審評過程中應該關注和重點把握的內容，對產(chǎn)品安全性、有效性作出系統(tǒng)評價。本指導原則是對堿性磷酸酶檢測試劑（盒）的一般要求，審評人員應依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中的具體內容是否適用并對注冊申報資料的內容進行補充要求。本指導原則是對技術審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規(guī)、國家標準、行業(yè)標準的前提下使用本指導原則。本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內容也將進行適時的調整。一、適用范圍堿性磷酸酶檢測試劑（盒）是指基于分光光度法原理對人血清、血漿或其他體液中的堿性磷酸酶活性進行體外定量分析的試劑。本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產(chǎn)品。堿性磷酸酶活性的測定方法目前主要有連續(xù)監(jiān)測法和比色法兩類：1連續(xù)監(jiān)測法（磷酸對硝基苯酚底物法）堿性磷酸酶催化水解磷酸對硝基苯酚（4-生成對硝基苯酚（4-N，在特定波長處監(jiān)測吸光度變化速率，可計算堿性磷酸酶活性。2比色法（磷酸苯二鈉底物法）堿性磷酸酶催化水解磷酸苯二鈉，生成游離酚，酚與4-基安替比林結合，經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色的醌衍生物，在特定波長處監(jiān)測吸光度值，可計算堿性磷酸酶活性。從方法學考慮，本文主要指以堿性磷酸酶水解底物引起特定產(chǎn)物的吸光度的改變對堿性磷酸酶活性進行定量檢測的體外診斷試劑，不包括干化學、酶聯(lián)免疫及金標類檢測試劑。前列腺堿性磷酸酶試劑不屬于本指導原則涵蓋的范疇。依據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法》（試行）、《食品藥品監(jiān)管總局關于印發(fā)體外診斷試劑分類子目錄的通知》（食藥監(jiān)械管〔20〕3），肌酸激酶檢測試劑屬于酶類檢測試劑，管理類別為Ⅱ類，分類代號為68。0二、基本要求（一）綜述資料綜述資料主要包括產(chǎn)品預期用途、產(chǎn)品描述、方法學特征、生物安全性評價、研究結果總結以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內容，應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（以下簡稱《辦法》）和《體外診斷試劑注冊申報資料形式與基本要求》的相關要求。相關描述應至少包含如下內容：1.品預期用途及輔助診斷的臨床適應癥背景情況：（）堿性磷酸酶的生物學特征、結構與功能，在體內正常和病理狀態(tài)下的代謝途徑和存在形式。（）與預期用途相關的臨床適應癥背景情況，如臨床適應癥的發(fā)生率、易感人群等，相關的臨床或實驗室診斷方法等。2.品描述：包括產(chǎn)品所采用的技術原理，主要原材料的來源及制備方法，主要生產(chǎn)工藝過程及關鍵控制點，質控品、校準品的制備方法及溯源情況。3.關生物安全性方面的說明：由于體外診斷試劑中的主要原材料可能是由各種動物、病原體、人源的組織和體液等生物材料經(jīng)處理或添加某些物質制備而成，為保證產(chǎn)品在運輸、使用過程中對使用者和環(huán)境的安全，研究者應提供對上述原材料所采用的滅活等試驗方法的說明。4有關產(chǎn)品主要研究結果的總結和評價。5.他：包括同類產(chǎn)品在國內外批準上市的情況。相關產(chǎn)品所采用的技術方法及臨床應用情況，申請注冊產(chǎn)品與國內外同類產(chǎn)品的異同等。對于新診斷試劑產(chǎn)品，需提供被測物與預期適用的臨床適應癥之間關系的文獻資料。（二）產(chǎn)品說明書說明書承載了產(chǎn)品預期用途、試驗方法、檢測結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結果給出合理醫(yī)學解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對堿性磷酸酶檢測試劑說明書的重點內容進行詳細說明。1.產(chǎn)品名稱】（）試劑（盒）名稱由三部分組成：被測物名稱、用途、方法或原理。例如：堿性磷酸酶檢測試劑盒（磷酸對硝基苯酚底物法）。（2）英文名稱應當正確、完整、直譯，不宜只寫縮寫。2【包裝規(guī)格】包裝規(guī)格應明確單、雙或其他多試劑類型；如不同包裝規(guī)格有與之特定對應的機型，則應同時明確適用機型。如:R1:1×60ml,R2:1×15ml 日立710化分析儀3【預期用途】應至少包括以下幾部分內容：31明試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿和或其他體液中堿性磷酸酶的活性；同時應明確與目的檢測物相關的臨床適應癥背景情況。32性磷酸酶異常情況常見于哪些疾病，其升高或降低可能有哪些醫(yī)學解釋。如：堿性磷酸酶主要用于阻塞性黃疸、肝膽疾病、骨組織疾病等的檢查。生理性增高：兒童在生理性的骨骼發(fā)育期，堿性磷酸酶活力可比正常人高1～2倍；病理性升高：(1骨骼疾病如佝僂病、軟骨病等；(2肝膽疾病如肝外膽道阻塞、肝硬化、毛細膽管性肝炎等；(他疾病如甲狀旁腺機能亢進。病理性降低：見于重癥慢性腎炎、兒童甲狀腺機能不全、貧血等。作為支持性資料，申請人應提供由教科書、臨床專著、核心期刊文獻或英文S獻等有關臨床適應癥背景的資料。4.檢驗原理】應結合產(chǎn)品主要成分簡要說明檢驗的原理、方法，必要時可采取圖示方法表示，檢測原理的描述應結合產(chǎn)品主要組成成分、被測物和產(chǎn)物的關系進行描述：如：本產(chǎn)品以磷酸對硝基苯酚（4-底物，2氨基-基-醇（A為磷酸酰基受體物質，增進酶反應速率，在堿性磷酸酶（A催化下，4-N裂出磷酸基團，生成游離的對硝基苯酚（4-NP后者在堿性溶液中轉變成醌式結構，呈現(xiàn)較深的黃色。反應式如下：磷酸對硝基苯酚+H2O4-硝基苯酚磷酸鹽磷酸對硝基苯酚+AMP4-硝基苯酚+A鹽由于反應中4-生成速率與A性呈正比，因此在37℃、40下監(jiān)測吸光度上升速率，可得出A活性。5.主要組成成份】應明確以下內容：試劑盒提供的試劑組分的名稱、比例或濃度，各組分是否可以互換；如含有校準品或質控品，除明確組成成份及生物學來源外，還應明確其定值及溯源性，溯源性應寫明溯源的最高級別，包括標準物質或參考物的發(fā)布單位及編號，質控品應明確靶值范圍。例如：本試劑盒由R1R和校準品（選購）組成：R1AMP1.，o5/2.5m/L基乙二胺三乙酸（HET2.5mmol/LR2磷酸-基苯酚100/L0.5mmol/L校準品：含有堿性磷酸酶的人源血清基質，校準品具有批特異性，每批定值，定值見瓶簽標示，量值可溯源至國際參考物質JCCLSRM001b6【儲存條件及有效期】應明確未開封的試劑實際儲存條件及有效期，開封后的待機穩(wěn)定期或開瓶穩(wěn)定期。干粉試劑應明確復溶穩(wěn)定期。注：保存條件不應有模糊表述，如“常溫”、“室溫”。7【適用儀器】應明確可適用的具體品牌、型號的生化分析儀器。8.樣本要求】重點明確以下內容：樣本類型、處理、保存期限及保存條件（短期、長期），運輸條件等。如有血漿樣本，應注明對抗凝劑的要求（如草酸鹽、檸檬酸鹽、ED鹽對堿性磷酸酶活性造成干擾，應明確避免使用的提示）。冷藏冷凍樣本檢測前是否須恢復室溫，可凍融次數(shù)。特殊體液標本還應詳細描述對采集條件、保存液、容器要求等可能影響檢測結果的要求。9【檢驗方法】詳細說明試驗操作的各個步驟，包括：9劑配制方法、注意事項；9驗條件：溫度、時間、測定主副波長、試劑用量、樣本用量、測定方法、反應類型、反應方向、反應時間等以及試驗過程中的注意事項；9準：校準品的使用方法、注意事項、校準曲線的繪制。9量控制：質控品的使用方法、對質控結果的必要解釋以及推薦的質控周期等；建議在本部分注明以下字樣：如果質控結果與預期不符，提示檢測結果不可靠，不應出具檢測報告。9驗結果的計算：應明確檢驗結果的計算方法。超出線性范圍的樣本如進行稀釋，應結合可報告范圍研究結果明確稀釋液類型和最大可稀釋比例。1參考值（范圍）】應注明常用樣本類型的正常參考值（范圍），成人、兒童應按性別和年齡段，分別明確參考范圍，并說明參考值確定方法。建議注明“由于地理、人種、性別和年齡等差異，建議各實驗室建立自己的參考范圍”。1檢驗結果的解釋】說明可能對檢驗結果產(chǎn)生影響的因素，在何種情況下需要進行確認試驗。1檢驗方法的局限性】說明該檢驗方法的局限性，如：存在的干擾因素，明確黃疸、溶血、脂濁及藥物等內、外源性干擾物對測定的影響，同時列出干擾物的具體濃度。1產(chǎn)品性能指標】至少應詳述以下性能指標，性能指標應不低于標準有關技術指標的要求。13白吸光度及空白吸光度變化率；13析靈敏度；13準確度；13密度（重復性和批間差）；13性范圍（線性相關系數(shù)和線性偏差）。1注意事項】應至少包括以下內容：14試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床管理應結合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。14試劑盒僅供體外診斷用，試劑中含有的化學成分接觸人體后是否會產(chǎn)生不良的影響后果。14用不同方法學的試劑檢測所得結果不應直接相互比較，以免造成錯誤的醫(yī)學解釋；建議實驗室在發(fā)給臨床醫(yī)生的檢測報告注明所用試劑特征。14關人源組分的警告，如：試劑盒內的質控品、校準品或其他人源組分，雖已經(jīng)通過了HBs、HIV1目的檢測，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應將這些組分作為潛在傳染源對待。14本：（）采集時間要求、與用藥的先后順序或用藥后時間間隔等；（）對所有樣本和反應廢棄物都應視為傳染源對待。14他有關堿性磷酸酶測定的注意事項。1參考文獻】應當注明在編制說明書時所引用的參考文獻。1生產(chǎn)企業(yè)】應當注明企業(yè)名稱、地址（如注冊地址與生產(chǎn)地址不一致，應當分別列出）、郵政編碼、電話和傳真號碼、網(wǎng)址（如有）。1醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)許可證編號】、【醫(yī)療器械注冊證書編號】、【產(chǎn)品標準編號】、【說明書批準及修改時間】，未核準的內容可空缺。（三）擬定產(chǎn)品標準及編制說明擬定產(chǎn)品標準應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》的相關規(guī)定。如已有相應的國家行業(yè)標準發(fā)布，則企業(yè)標準的要求不得低于其相關要求。下面就標準中涉及的產(chǎn)品適用的相關標準和主要性能指標等相關內容作簡要敘述。1產(chǎn)品適用的相關標準：（）GB/T28抽樣程序及表（適用于對過程穩(wěn)定性的檢驗）（）GB/T—20體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質賦值的計量學溯源性（）GB/T（）YY/T

19包裝儲運圖示標志030風險管理對醫(yī)療器械的應用（）YY/T外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質物中酶催化濃度賦值的計量學溯源性（）YY/T0462醫(yī)療器械標簽、標記和提供信息的符號第部分：通用要求（）GB/T261臨床化學體外診斷試劑（盒）（）WS/30堿1磷酸酶(A活性濃度測定參考方法（）GB/T2822第部分：按接收質量限（AQ檢索的逐批檢驗抽樣計劃（10WS/T404檢驗項目參考區(qū)間血清丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、堿性磷酸酶和γ谷氨?；D移酶2.要性能指標：（）外觀：應與申請人聲稱試劑外觀一致。這里可以包括試劑盒包裝外觀、試劑內包裝外觀、試劑的外觀。（）裝量（凍干品不適用）：試劑裝量應不少于標示裝量。（3）空白吸光度：用蒸餾水、去離子水或其他指定溶液作為空白加入工作試劑作為樣品測試時，試劑空白吸光度應不大于企業(yè)規(guī)定的要求。（4）空白吸光度變化率：用蒸餾水、去離子水或其他指定溶液作為空白加入工作試劑作為樣品測試時，試劑空白吸光度變化率△A/min(37℃，405nm,1cm)≤0.005。（5）分析靈敏度用已知濃度或活性的樣品進行測試，記錄在試劑（盒）規(guī)定參數(shù)下產(chǎn)生的吸光度改變。換算為n單位吸光度差值（ΔA）或吸光度變化（ΔA/min）。應符合生產(chǎn)企業(yè)給定范圍。（）線性范圍用達到線性范圍上限活性的樣品和達到線性范圍下限活性的樣品，混合成至少5個稀釋濃度（xi。分別測試試劑盒，每個稀釋濃度測試3次，分別求出測定結果的均值（yi。以稀釋濃度（x）為自變量，以測定結果均值（yi為因變量求出線性回歸方程。按公式（1）計算線性回歸的相關系數(shù)（）?！?）稀釋濃度（xi代入求出線性回歸方程，計算y的估計值及y與估計值的相對偏差或絕對偏差。線性范圍應至少達到但不限于25～750U/（下限不得高于25U/L，上限不得低于750U/L。相關系數(shù)（）線性相關系數(shù)應不小于0.9。0（線性范圍下限應不低于產(chǎn)品的最低檢測限，不高于參考范圍下限）②25-100U/范圍內，線性絕對偏差應不超過±10U/L；101-70圍內，線性相對偏差應不超過±10%。（）測量精密度①批內重復性在重復性條件下，分別用試劑（盒）測試（50±10）U/L和(500±50)U/L的樣本或質控樣品，重復測試至少10次（n≥10），分別計算測量值的平均值（）和標準差（）。計算變異系數(shù)（C）應不大于5%。②批內瓶間差（干粉或凍干試劑）用(120±12)U/L的樣本或質控樣品測試同一批號的10個待檢試劑（盒），并計算10個測量值的平均值（1）和標準差（s）。用(120±12)U/L的樣本或質控樣品對該批號的1個待檢試劑（盒）重復測試10次，計算結果的均值（2）和標準差（s）。按公式（2）、（）計算瓶間差的變異系數(shù)（CV?！?）……（）當s1s時，令CV=0每個濃度下試劑（盒）批內瓶間差均應不大于5%③批間差用(120±12)U/L的樣本或質控樣品分別測試個不同批號的試劑（盒），每個批號測試次，分別計算每批次測定的均值(i=1,2,3)式（）、（）計算相對極差（）?！ǎǎ┦街校海械淖畲笾?；－中的最小值。試劑（盒）批間差相對極差應不大于10%。（）準確度①型式檢驗相對偏差：用試劑盒測定用評價常規(guī)方法的參考物質或有證參考物質或由參考方法定值的高、中、低三個濃度的人源樣品，測定值與標示值偏差應≤10%。比對試驗：用待測試劑盒與申請人選定分析系統(tǒng)（已在國內上市）分別檢測不少于4個在檢測范圍內的人源樣品，用線性回歸方法計算兩組結果的相關系數(shù)r2≥0.95,相對偏差≤10%。②出廠檢驗推薦使用型式試驗的方法進行檢測，申請人也可使用經(jīng)內部定值的質控品進行檢測，測得值與標示值偏差不得大于10%。測定樣本應至少包含兩個濃度點，一般應按醫(yī)學決定水平取堿性磷酸酶（A正常值和異常值濃度點。備注：選用經(jīng)定值的質控品進行出廠檢驗，申請人應能提供型式試驗方法與出廠檢驗方法等同的研究資料。（9）穩(wěn)定性檢測申請人聲稱已到期試劑，產(chǎn)品性能應符合空白吸光度、吸光度變化率、分析靈敏度、線性、測量精密度、準確度要求。凍干品應同時進行復溶穩(wěn)定性試驗，復溶后放置到有效期末，產(chǎn)品性能應符合空白吸光度、吸光度變化率、分析靈敏度、線性、測量精密度、準確度要求。（10）校準品和質控品的性能指標（如產(chǎn)品中包含）應至少包含外觀、裝量（干粉試劑可不做）、準確性、均一性、穩(wěn)定性。凍干型校準品和質控品還應檢測批內瓶間差和復溶穩(wěn)定性。（11）型式檢驗和出廠檢驗要求型式檢驗應包含標準中規(guī)定的所有性能指標；出廠檢驗應包含標準中除穩(wěn)定性、批間差以外的所有性能指標。（四）注冊檢測首次申請注冊的二類產(chǎn)品應該在國家食品藥品監(jiān)督管理部門認可的、具有相應承檢范圍的醫(yī)療器械檢測機構進行至少三個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。（五）主要原材料研究資料（如需提供）應提供主要原材料、校準品（如產(chǎn)品包含）、質控品（如產(chǎn)品包含）的選擇、制備、質量標準及驗證有關的研究資料。（六）主要生產(chǎn)工藝和反應體系的研究資料（如需提供）應包含產(chǎn)品的工藝流程圖和關鍵控制點、確定反應溫度、時間、緩沖體系比較等條件的研究資料、確定樣本和試劑盒組分加樣量的研究資料。A沖液通常分為三類：1惰性型：如碳酸鹽緩沖液和巴比妥緩沖液；2.抑制型：如甘氨酸緩沖液；3激活型：如ATrD沖液。激活型緩沖液，緩沖物質作為酶的一種底物（磷酸?；氖荏w），參與磷酸?；囊茡Q反應，因此能促進酶促反應速率。使用最適濃度和激活型緩沖液時，所測的A性要比使用惰性型緩沖液（如碳酸鹽緩沖液）時高～倍。D激活作用比A激活作用更強，因此，用不同緩沖液測定A性時，其參考值不同。A性與血清在反應液中所占的體積百分數(shù)有關。當血清體積分數(shù)從1/26降低到1/，測出的酶活性隨之增高；但低于1/，酶活性沒有進一步增加。（七）分析性能評估資料應至少包括具體的研究方法、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計方法、研究結論等。性能評估時應將試劑和所選用的校準品、質控品作為一個整體進行評價，評估整個系統(tǒng)的性能是否符合要求。性能評估應至少包括準確度、精密度、線性范圍、最低檢測限、分析特異性（抗干擾能力）、其他影響檢測的因素等。1準確度對測量準確度的評價依次包括：與國家標準品（和或國際標準品）的偏差分析、方法學比對等方法，申請人可根據(jù)實際情況選擇合理方法進行研究。1國家（國際）標準品的比對研究如果研究項目有相應國家標準物質或國際參考物質，則使用國家標準物質或國際參考物質進行驗證，計算檢測結果與靶值的相對偏差。注堿性磷酸酶項目目前有國家標準物質和國際參考物質)1法學比對采用參考方法或國內國際普遍認為質量較好的已上市同類試劑作為參比方法，與擬申報試劑同時檢測一批病人樣品（至少4例樣本），從測定結果間的差異了解擬申報試劑與參比方法間的偏倚。如偏倚很小或在允許的誤差范圍內，說明兩檢測系統(tǒng)對病人標本測定結果基本相符，對同一份臨床樣本的醫(yī)學解釋，擬申報試劑與參比方法相比不會產(chǎn)生差異結果。在實施方法學比對前，應分別