NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）試劑盒說明書

/NADP—蘋果酸脫氫酶（NADP—MDH）試劑盒說明書NADP蘋果酸脫氫酶（NADPMDH）試劑盒說明書微量法100管/96樣注意：正式測定前務(wù)必取23個預(yù)期差異較大的樣本做推測定測定意義：MDH（EC1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培育細(xì)胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是緊要的中心產(chǎn)物，連接多條緊要的代謝途徑。因此，MDH在細(xì)胞多種生理活動中扮演側(cè)緊要的角色，包括線粒體的能量代謝、蘋果酸天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。依據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD倚靠的MDH和NADP倚靠的MDH，NADPMDH重要存在于真核細(xì)胞中。測定原理：NADPMDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致340nm處光汲取下降。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。試劑的構(gòu)成和配制：試劑一、提取液100mL×1瓶，在4℃保存；試劑二、液體20mL×1瓶，在4℃保存；試劑三、粉劑×1瓶，20℃保存；樣本測定的準(zhǔn)備：1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：細(xì)菌或培育細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；依照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波碎裂細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。組織：依照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。2、血清（漿）樣品：直接檢測。測定步驟：1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)整波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。2、檢測工作液的配制：用時在試劑三中加入19mL試劑二和0.5mL蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復(fù)凍融；3、測定前將檢測工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本和195μL工作液，混勻后立刻記錄340nm處20s時的吸光值A(chǔ)1和1min20s后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1A2、注意：若A1A2大于0.5，需將酶液用提取液稀釋，使A1A2小于0.5，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。NADPMDH活力單位的計算：a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下1、血清（漿）NADPMDH活力的計算單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。NADPMDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=6430×ΔA2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADPMDH活力的計算:（1）按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。NADPMDH（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=6430×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計算：單位的定義：每g組每分鐘消耗1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。NADPMDH（nmol/min/g鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=6430×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。NADPMDH（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣÷V樣總×500）÷T=12.86×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.005mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，1min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。b.用96孔板測定的計算公式如下1、血清（漿）NADPMDH活力的計算單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。NADPMDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=12860×ΔA2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADPMDH活力的計算:（1）按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。NADPMDH（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=12860×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計算：單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。NADPMDH（nmol/min/g鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=12860×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。NADPMDH（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=25.72×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.