卵巢癌早期診斷和篩選

iTRAQ技術對卵巢癌早期篩查/診斷的蛋白質磷酸化修飾的研究

精選課件

卵巢癌的研究現狀

目前最普遍使用的卵巢癌生物標記物是腫瘤抗原CA125,盡管80%的晚期卵巢癌病人CA125濃度不正常,但是50%～60%的Ⅰ期卵巢癌病人CA125濃度增高。CA125作為標記物的陽性預測值不到10%。因此,需要尋找特異性更強和靈敏度更高的腫瘤分子標記物。

蛋白質組學的新進展盡管人類基因組包含了機體的所有遺傳信息,但其只是指導蛋白質合成，而構成細胞并發(fā)揮各種功能作用則是由蛋白質來完成，蛋白質還是機體多種不同類型細胞之間差異的決定因素。同樣,腫瘤細胞和正常細胞的差異在很大程度上也是由功能基因及其指導合成的蛋白質組的不同來決定的。因此，有必要從蛋白質組水平來揭示腫瘤的發(fā)生機制。蛋白質組學可全面、動態(tài)、定量地分析比較正常與癌變標本中蛋白質種類和數量的改變,不僅有助于腫瘤發(fā)病機制的闡明,還能篩選和鑒定蛋白質特異性標記和特異性抗原,在腫瘤的早期診斷、治療和新藥研制方面,具有廣闊的應用前景。研究背景精選課件

蛋白質的磷酸化修飾蛋白質的磷酸化修飾是生物體內重要的共價修飾方式之一是生物界最普遍也是最重要的一種蛋白質翻譯后修飾。磷酸化的失調會導致很多嚴重的人類疾病，如癌癥。磷酸化蛋白質檢測技術用于卵巢癌研究中，有利于尋找卵巢癌診斷和治療的靶點。目前，磷酸化蛋白質組學在定量研究方面多采用32P代謝標記、熒光染料染色的磷酸化蛋白質定量分析方法、同位素標記技術等。對于圖譜創(chuàng)建中許多磷酸化調控蛋白呈低豐度狀況,蛋白質鑒定技術敏感性的提高將是克服這一障礙的關鍵。隨著樣本制備技術和儀器設備的迅速發(fā)展,更好的富集策略和磷酸化定量兩大難點將會不斷得到克服,蛋白磷酸化位點的鑒定和定位技術也更易開展

穩(wěn)定同位素標記技術在定量準確度和規(guī)模化定量分析方面都有很大的應用前景。這種方法既可以研究全蛋白質組的變化,也可以結合磷酸化肽段的富集技術和串聯質譜技術對磷酸化肽段進行定量研究。目前,可用于肽段定量研究的iTRAQ、iCAT等技術同樣可用于磷酸化肽段的研究。研究背景精選課件研究背景我們?yōu)槭裁催x擇iTRAQ技術？

iTRAQ技術是一種新的、功能強大的可同時對多種樣品進行絕對和相對定量研究的方法，可以標記生物樣品中產生的所有肽段，增強任一給定蛋白的肽段覆蓋度，同時保留了諸如一些蛋白的翻譯后修飾的重要結構信息，可以實現在二級圖譜上的定量，具體原理已有詳細報道，但目前有關iTRAQ在磷酸化蛋白質定量方面的研究報道還很少。這種方法是建立在iTRAQ試劑的基礎上。iTRAQ實際上是一種同位素標記試劑包括一個帶電荷的報告基團，另外還有一個肽段反應基團和一個平衡基團。精選課件主要觀點和創(chuàng)新之處目前，國內外對于卵巢癌的早期篩查/診斷尚缺乏有效方法和特異性的腫瘤標志物。我們本次實驗意在通過對卵巢癌蛋白質組學研究，或得出正常卵巢和癌變卵巢表達蛋白的差異。

基于iTRAQ+蛋白組學研究+蛋白磷酸化修飾的差異基于iTRAQ標記結合質譜技術篩選卵巢癌血清標記物在國內雖有學者研究，但還沒有突破性的成果。我們發(fā)現國內外尚無學者研究卵巢癌表達蛋白磷酸化修飾的差異，我們此次通過研究卵巢癌表達蛋白磷酸化修飾的差異或得出正常卵巢和癌變卵巢表達蛋白的磷酸化修飾是否存在差異。從而尋找用于卵巢癌早期診斷的血清腫瘤標志物提供了一定的臨床前期研究基礎。之所以選擇磷酸化修飾作為研究對象，是因為蛋白質磷酸化是最常見，也是最重要的一種蛋白翻譯后修飾方式。蛋白質的磷酸化在真核生物的信號轉導中具有很重要的作用。精選課件基本思路和方法關注新浪微博jdpptor@經典PPT精選課件基本思路和方法1、血清來源:

選取醫(yī)院經病理證實為卵巢惡性腫瘤患者晨空腹血清20份，年齡33～70歲，設為卵巢癌組；經體檢無任何疾病的健康人群晨空腹血清20份，設為正常對照組。所采集的血清標本保存于-80℃冰箱；精選課件基本思路和方法2、血清差異蛋白篩選：1）去除高豐度蛋白：每組樣品先取10例冰上解凍。等體積混合得到混合血清。從中取20μL，用緩沖液A各稀釋4倍。加入0.22μm的離心過濾器4℃16000g離心1min，去除血清中碎片成分。取稀釋血清80μL，進行LC分離，流速0.125mL/min，在11～16min收集低豐度蛋白的流出組分。采用Bradord試劑盒檢測餾分蛋白濃度。其余樣本-80℃保存待用。2）蛋白定量標記：1.2mL的預冷丙酮加入300μL低豐度蛋白血清，見沉淀物形成。4℃15000g離心100min，棄上清，沉淀室溫放置20min使丙酮揮發(fā)完全。然后加入20μL溶解緩沖液充分混勻，使樣品充分溶解。每組樣品取100μg，加入2倍體積的還原劑，充分混合，60℃孵育1h。管內加入半胱氨酸封閉劑渦旋混合后室溫孵育10min。按1∶30（胰酶∶蛋白質）的比例向樣品管內加入消化酶，渦旋混合，37℃孵育16h。iTRAQ試劑室溫凍融，每管iTRAQ試劑加入70μL無水乙醇，渦旋混合，使之溶解后轉入樣品管。然后按照卵巢癌組加入質量數118Da和正常對照組119Da的標記分別加入樣品管，漩渦混勻，室溫孵育1h，真空冷凍干燥，去除標記中的胰蛋白酶和未標記的多肽；精選課件基本思路和方法3、二氧化鈦富集磷酸化肽段：稱取1mgTiO2放入50%ACN/0.1%FA(40μL)中，制成勻漿液，裝入GELoader槍頭中，用惰性材料塞緊。裝好的微柱依次用40μL的0．1%FA，80%ACN/0.1%TFA，40μL×2的300mmol/LLA/80%ACN/0.1%FA的溶液沖洗，將樣品注入微柱中，依次用40μL×2的300mmol/LLA/80%ACN/0.1%FA，40μL80%ACN/0.1%TFA，40μLH2O洗脫，最后用10μL×2的5%NH3·H2O收集，并用甲酸調至pH3；稱取1mgC18-AQ材料裝柱(同上),將裝好的微柱依次用40μLACN，40μL×2的50%ACN/0.1%FA溶液沖洗，再用40μL×2的0.1%FA溶液平衡微柱，將上述富集到的收集液上樣，再用40μL×2的0.1%FA溶液脫鹽，最后用20μL×2的50%ACN/0.1%FA溶液洗脫收集并旋干，再用10μL的50%ACN/0.1%FA溶解；精選課件基本思路和方法4、質譜分析：采用串聯質譜技術LC-MS/MS質譜分析，濃縮的iTRAQ標記樣本加入2mL稀釋液，調溶液pH值低于3。采用HPLC柱進行陽離子交換色譜分析。由強陽離子交換柱分離活的組份經真空干燥，多肽采用20μL溶劑A重懸，NanoLC分離并在線連接電噴霧串聯質譜分析。采用NanoAquityUPLC系統(tǒng)Nano在線連接電噴霧離子源的LTQOrbi?trapXL質譜儀。所有MS/MS譜圖采用Thermo公司的SEQUEST軟件進行，使用數據庫為人Swiss-Prot數據庫（Release2010-04）。多肽分子量誤差范圍為15ppm，碎片離子誤差為0.1Da；5、數據統(tǒng)計：定量分析蛋白磷酸化位點變化差異。精選課件總結

預計達到以下目標：①研究出卵巢癌血清定量疾病蛋白質磷酸化修飾的差異②為卵巢癌早期診斷和篩查提供更有效的臨床價值。精選課件參考文獻【1】彭小寧,彭司華,曾小敏,卵巢癌早期診斷方法的研究進展[J].國際病理科學與臨床雜志,2007,27(6):490-492【2】李國慶，肖哲峰，劉建平，等，腫瘤：一種蛋白質組病.2010,40（9）:788-794；【3】陳主初,梁宋平,肖志強,等.腫瘤蛋白質組學.長沙:湖南科技出版社,2002.1—9：454-463；【4】李文凱,李子博.蛋白質組學—一門正在崛起的蛋白質分子生物學,2007,12（9）20-25；【5】趙桂華，尹淑霞，郝萬東,等.蛋白質組學在腫瘤研究中的應用.產業(yè)與科技論壇，2009,8(5):15-17；【6】梁前進，王鵬程，白燕榮.蛋白質磷酸化修飾研究進展.科技導報，2012,30(31)，73-79；【7】楊策，王正國，朱佩芳.蛋白質組中蛋白質磷酸化研究進展.生理科學進展.2004，35（2），119-124；【8】隋少卉，王京蘭，蔡耘，錢小紅.磷酸化蛋白質組學分析和定量技術的研究進展.生物化學與生物物理進展.2007,34(3):240-245【9】李峰，關勇軍，陳主初.蛋白質組學及其在腫瘤研究中的應用.生物化學與生物物理進展2001；11（6）165-168；【10】李莉，唐杰，于春霞.基于iTRAQ標記結合2DnanoHPLC-ESI-OrbiTrapMS/MS技術篩選卵巢癌血清標記物.中國腫瘤臨床,2012,39(24):2075-2077；【11】鄒麗娟,李娟,萬慧慧.超濾膜截留-二氧化鈦選擇性富集-納升級液相色譜串聯質譜法檢測血清中內源性磷酸化肽,分析化學研究報告,2011,12,39(12),1781-1786；【12】王京蘭,錢小紅.磷酸化蛋白質分析技術在蛋白質組研究中的應用,分析化學評述與進展,2005,7（7）：1029-1035；【13】MokSC,,ChaoJ,SkatesS,etal.Prostasin,potential

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