SELDI蛋白質芯片篩選差異蛋白分子的二級鑒定課件

SELDI蛋白質芯片篩選差異蛋白分子的二級鑒定SELDI蛋白質芯片篩選差異蛋白分子的二級鑒定1主要內容：一、SELDI蛋白質芯片技術二、差異蛋白質電泳方法三、差異蛋白質的二級質譜鑒定

四、SELDI蛋白質芯片技術發(fā)展現狀

五、SELDI蛋白質芯片技術發(fā)展趨勢探討主要內容：一、SELDI蛋白質芯片技術2一、SELDI蛋白質芯片技術1、定義SELDI蛋白質芯片技術，即表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜(surface-enhancedlaserdesorption/ionization-timeofflight-massspectrometry)，是蛋白質組學研究中的一項新興技術，在識別特定蛋白質表達物、蛋自質差異分析、測定血清中小分子物質含量方面提供了新的思路與方法。2、應用該技術已經逐漸應用與臨床，目前已見其應用于傳染病、腫瘤等疾病診斷篩選的臨床報道。SELDI蛋白質芯片技術與傳統(tǒng)方法比較，SELDI技術對于5kDa以下的低分子量差異蛋白和低豐度的差異蛋白質的檢出效果較佳，而且該技術具有高通量、上樣量低和靈敏度高等優(yōu)勢。但經SELDI技術檢出的差異蛋自質僅具有分子量特征，需進一步進行分離和準確鑒定。

一、SELDI蛋白質芯片技術1、定義SELDI蛋白質芯片技術3二、差異蛋白質電泳方法1、Tricine-SDS分離蛋白

Tricine-SDS是用于分子量在1-10kD的肽類的方法。根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。該技術最初由shapiro于1967年建立，他們發(fā)現在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀６?、差異蛋白質電泳方法1、Tricine-SDS分4二、差異蛋白質電泳方法2、雙向凝膠電泳分離蛋白根據蛋白質等電點和分子量差異連續(xù)進行成垂直方向的兩次電泳。第一向為等電聚焦電泳，其基本原理是利用蛋白質分子的等電點不同進行蛋白質分離。第二向為十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），是按蛋白質分子量的大小進行分離的，再用考馬斯亮藍或P銀進行檢驗，最后進行結果對比，解析。二、差異蛋白質電泳方法2、雙向凝膠電泳分離蛋白5三、差異蛋白質的二級質譜鑒定

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4近年來，生命科學技術的創(chuàng)新和突破，尤其是質譜技術的革新，對蛋白質組學研究起到了關鍵的推動作用。質譜的數據結果是蛋白質組與序列數據庫聯系的橋梁。質譜（mass

spectrometry，MS）的基本原理是在樣品離子化后，根據不同離子質荷比的不同進行分離并確定分子量。質譜鑒定蛋白的方法具有靈敏度高，準確度高，易于實現自動化等優(yōu)點。

三、差異蛋白質的二級質譜鑒定146三、差異蛋白質的二級質譜鑒定80年代末，隨著兩種適合蛋白質研究的軟電離方式的出現即電噴霧離子化（ESI）和基質輔助的激光解析離子化（MALDI），使得質譜應用于生物大分子的鑒定成為可能。如今，質譜已成為蛋白研究中最重要的鑒定技術，是后基因組時代的關鍵核心技術。這種技術的應用范圍已經從細胞，組織以及整個有機體中蛋白質的表達到蛋白質翻譯后修飾等多個方面。包括蛋白消化、上樣打點操作、上機檢測及質譜數據庫檢索。

三、差異蛋白質的二級質譜鑒定80年代末，隨著兩種適合蛋白質研7四、SELDI蛋白質芯片技術發(fā)展現狀

SELDI蛋白質芯片技術，是用于蛋白質組學研究的一項新技術，它是在MALDI基礎上改進后實行表面增強的飛行質譜。SELDI蛋白質芯片技術的出現為蛋白質差異分析提供了新的有力工具，目前已應用于如多種傳染病及惡性腫瘤標志物檢測中。Schagger等用Tris-Tricine體系代替Tris-glycine體系后可很好地分離分子量在1～100kDa的蛋白質。該方法降低了分離膠的pH值(pH8.45)，使蛋自質的移動速度變慢，提高了電泳分辨率；其次，解除短肽-SDS復合物與SDS顆粒的共遷移效應，改善小分子量短肽的電泳效果。仉紅剛等研究考察該方法的靈敏度與分辨率，結果發(fā)現大致在35-70kDa范圍的蛋白(例如53kDa的微管蛋白-ɑ3)在Tricine-SDS中肉眼即能觀察到清晰的分離條帶-且重復性較理想。四、SELDI蛋白質芯片技術發(fā)展現狀SELDI蛋白質芯片8五、SELDI蛋白質芯片技術發(fā)展趨勢探討

近年來隨著質譜技術的不斷進步，質譜分辨率越來越高，蛋白鑒定的電噴霧傅立葉變換離子回旋共振高分辨質譜也采用的是一種具有超高質量分辨能力的新型質譜儀，它將電噴霧離子化(ESI)技術結合于傅立葉變換離子回旋共振質譜儀(FTICR-MS)。在離子源的電離技術上和質量分析器上有著各自的優(yōu)缺點。五、SELDI蛋白質芯片技術發(fā)展趨勢探討近年來9在離子源的電離技術上

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ESI技術與傳統(tǒng)的電子轟擊(EI)電離、化學電離(CI)、場解析(FD)離子化技術及快原子轟擊(FAB)離子化技術相比，具有更適于離子性極性化合物、質荷比小于4000、化學噪音低、容易獲得碎片離子信息、所鑒定蛋白質分子量可達1，000，000Da等優(yōu)點，但其離子源結構復雜，易受Na+、K+等金屬離子干擾，且不能用于分析非極性化合物的缺點仍難以避免。五、SELDI蛋白質芯片技術發(fā)展趨勢探討在離子源的電離技術上12ESI技術與傳統(tǒng)的10在質量分析器上

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與磁質譜儀、四極質量過濾器質譜儀、離子肼質譜儀相比，FTICR-MS具有較掃描型質譜(磁質譜、四極桿等)高得多的靈敏度；且其感應電流檢測離子的方式是非破壞性的，離子可繼續(xù)被儲存、分析，從而實現多級質譜分析；具有超高分辨能力和質量精確度(很容易實現幾十甚至上百萬的分辨率，無需內標就能達到小于2ppm的質量準確度，是現有分辨率最高且質量穩(wěn)定性較好的目前蛋白質和肽段測序中的頂端質譜儀。

五、SELDI蛋白質芯片技術發(fā)展趨勢探討在質量分析器上23與磁質譜儀、四極111

蛋白質芯片技術探討3

仉紅剛研究中所選兩種目標蛋白均為分子量均大于50kDa的極性分子，因而僅從各電離技術適用的質量范圍上即可首先對排除EI(小于1000Da)、CI(小于1000Da)、FD(小于2000Da)、FAB(200-6000Da)等的選擇，而選用所鑒定蛋白質分子量可達1,000，000Da且尤其適于離子性極性化合物的ESI技術。五、SELDI蛋白質芯片技術發(fā)展趨勢探討在質量分析器的選擇上，磁質譜儀雖堪稱經典，但不能較好地與離子化技術連用、且體積大造價高；四極質量過濾器質譜儀雖體積小造價低且重復性好，但分辨率較低；離子肼質譜儀動態(tài)范圍窄、不便確定是否適用于目標蛋白，且易受檢測器條件等多個儀器參數的影響因而重復性略差。故以SELDI蛋白質