目的基因的克隆課件

基因重組、基因診斷和基因治療

GeneticRecombination,Geneticdiagnosisandgenethereapy第十五章目錄基因重組、基因診斷和基因治療第十五章目錄1第一小節(jié)

DNA的重組

DNARecombination

第一小節(jié)

DNA的重組

DNARecomb2DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

(transduction)轉(zhuǎn)座

(transposition)同源重組(homologousrecombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specificrecombination)DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(t3第一小節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique第一小節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinati4重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試5相關(guān)概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系本節(jié)主要內(nèi)容相關(guān)概念本節(jié)主要內(nèi)容6一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(cl7技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)8DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)。DNA克隆9生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。生物技術(shù)工程:基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目10（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶11重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無53

外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功12限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶定義GGATCCGGATCC+BamHⅠ13作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）作用分類14第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；命名HindⅢ15Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)16BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC17（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)（三）目的基因cDNA(complementaryDN18（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA（四）基因載體定義常用載體19克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體?？寺≥d體(cloningvector)20載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；211.質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。1.質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)22目錄目錄23目的基因的克隆課件24λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克隆）2.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)2.噬菌體(phage)M13噬253.粘性質(zhì)粒(cosmid)3.粘性質(zhì)粒(cosmid)26酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他酵母人工染色體其他27二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受28以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程目錄以目錄29（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法30*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序31組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分32限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫目錄限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcosc33mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子34（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接（二）克隆載體的35BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目錄BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC36不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目錄不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg372.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端2.平端連接38目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體39受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌受體菌條件導(dǎo)入方式（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌40（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)

抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等（五）重組體的篩選41(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目錄(插入失活法)目錄42重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基43重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源44（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制。三、基因重組的意義（二）生物制藥（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆三、基因重組的意義（二）生物制藥45重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(

1b,

2a,

2b,

)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂目錄重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激46基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。（三）基因診斷基本過程區(qū)分或鑒定DNA的異常分離、擴(kuò)增待測的DNA片斷基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物47標(biāo)準(zhǔn).能正確擴(kuò)增靶基因；.能準(zhǔn)確區(qū)分單個(gè)堿基的差別；.本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定;.便于完全自動(dòng)化操作，適合大面積、大人群普查。標(biāo)準(zhǔn)48方法：.限制性酶切片段多態(tài)性分析；.分子雜交技術(shù).聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)方法：49

分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularHybridization&BlottingTechnology

分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularHybridiza50核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)

。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理核酸分子雜交(nucleicacidhybridiza51復(fù)性RNADNA復(fù)性RNADNA52（一）印跡技術(shù)（二）探針技術(shù)

探針(probe)一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。

（一）印跡技術(shù)探針(probe)53二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù)

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術(shù)

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析

(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。

二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù)(Southe54

其他斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點(diǎn)陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)其他55三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較56分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③目錄分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③目錄57放射自顯影照片目錄放射自顯影照片目錄58

生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnology

BiologicalChipTechnology59DNA芯片(DNAchip)

cDNA芯片(cDNAchip)是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上

。一、基因芯片基因芯片(genechip)DNA芯片(DNAchip)一、基因芯片基因芯片(gen60目錄目錄61是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)62

聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction

聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChai63