最全面蛋白質(zhì)提取與制備的原理和方法(精華版)

歡迎下載——精品資料歡迎下載——精品資料精品資料第#頁，共13頁相的層析柱時，混合物中各物質(zhì)因分子大小不同而被分離的技術(shù)。所指凝膠從廣義上說是一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如天然物質(zhì)中的馬鈴薯淀粉及瓊脂糖凝膠，人工合成品的葡聚糖凝膠及帶離子交換基團的葡聚糖凝膠等。把適當?shù)哪z顆粒裝填到玻璃管中制成層析柱，于柱內(nèi)加入欲分離的混合物，然后用大量蒸鎦水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物質(zhì)的分子大小和形狀不同，在洗柱過程中，分子量最大的物質(zhì)不能進入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外。分子量最小的物質(zhì)因能進入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢，致使最后流出柱外。整個過程和過濾相似，故又名凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾等。由于物質(zhì)在分離過程中的阻滯減速現(xiàn)象，有人也稱之為阻滯擴散層析、排阻層析等。凝膠過濾是分子篩的一種，在介紹凝膠過濾法之前，首先介紹分子篩的由來。McBain(1928)提出了分子篩的概念。后來發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象在許多地方都存在。Synge與Tiselins(1950)在解釋凝膠層中的電泳和電滲現(xiàn)象時引用了分子篩的概念。此后發(fā)現(xiàn)在柱層析中也有這種現(xiàn)象，于是許多工作者嘗試了一系列適用于生物高分子分離純化用的分子篩。至1959年P(guān)orath與Flodim找到部分水解的葡聚糖凝膠將其交聯(lián)，得到了商品名為交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)的分子篩。該分子篩具有許多良好的性能，在蛋白質(zhì)的分離分析中已被廣泛采用。Lathe與Ruthven(1956)曾利用分子篩效應(yīng)測定過分子大小與分子量。Flodin與Granath(1961)發(fā)現(xiàn)不同分子量的葡聚糖級分，其凝膠過濾行為與分子量大小有關(guān)。Andrew(1962)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中也有類似的性質(zhì).此后經(jīng)過不少人的實際應(yīng)用，完善了這一方法，形成一個可靠的測定高分子分子量的方法。凝膠層析是60年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡便的分離技術(shù)。由于設(shè)備簡單、操作方便和不需要有機溶劑，以及對高分子物質(zhì)有很高的分離效果，所以目前它已被生物化學、分子生物學、生物工程學及醫(yī)藥學等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。PH值與沉淀蛋白質(zhì)或酶原理相同，結(jié)晶的溶液PH值一般選擇在被結(jié)晶的白質(zhì)或酶的等電點附近，以利于晶體的析出。蛋溫度除少數(shù)情況外，通常選擇低溫條件進行。低溫條件對蛋白質(zhì)和酶不僅溶解度低且不易變性。在中性鹽溶液中結(jié)晶時，溫度可在0°C至室溫范圍內(nèi)選擇，在有機溶劑中結(jié)晶一般要求溫度較低。晶種不易結(jié)晶蛋白質(zhì)和酶如糜蛋白酶，往往加入微量的糜蛋白酶結(jié)晶可導致大量結(jié)晶的形成。有時用玻璃輕輕摩擦容器壁也可達到此目的。需加晶種才能形成結(jié)晶的蛋白質(zhì)或酶，大多數(shù)結(jié)晶收率都不高。金屬離子有些蛋白質(zhì)和酶結(jié)晶時還需加入金屬離子，如鐵蛋白在硫酸銨溶液中結(jié)晶時，加入少量鎘離子才形成菱狀結(jié)晶，烯醇化酶也常加入汞鹽后形成結(jié)晶。結(jié)晶時間在結(jié)晶條件比較適合的情況下，在幾小時甚至幾分名即可獲得結(jié)晶。但有些情況需數(shù)天甚至數(shù)月才能結(jié)晶完全，視各種蛋白質(zhì)和酶的具體情況不同而定。蛋白質(zhì)和酶的結(jié)晶大多數(shù)是針狀、棒狀、片狀，有的為八面體或立方體的菱狀結(jié)晶。結(jié)晶的大小與結(jié)晶時間及條件有關(guān)。6.蛋白質(zhì)的干燥干燥是將潮濕的固體、半固體或濃縮液中的水分（或溶劑）蒸發(fā)除去的過程。根據(jù)水分在固體中分布情況可分為表面水分、毛細管水分和被膜所包圍的水分3種。表面水分附著于固體表面，蒸發(fā)時完全暴露于外界空氣中，干燥最快、最均勻。毛細管水分存在于固體極細孔隙的毛細管中，水分子逸出比較困難，蒸發(fā)時慢并需較高溫度。膜包圍的水分如細胞中被細胞質(zhì)膜所包圍的水分，需經(jīng)緩慢擴散至膜外才能蒸發(fā)最難除去。被干燥的物質(zhì)其濕度與周圍空氣的濕度是一個動態(tài)平衡關(guān)系，暴露于大氣中的物質(zhì)是不會絕對干燥的。若使被干燥的物質(zhì)所含水分低于周圍空氣中水分，則必須放在嚴密封蓋的容器中進行干燥。用這種方法可得到含水量極低的干燥樣品，生物大分子制備得到所需的產(chǎn)品后，為了防止變質(zhì)易于保存和運輸，常需要干燥處理，最常用的方法是冷凍干燥和真空干燥，某些無活性核酸、微生物酶制劑和酪蛋白等工業(yè)產(chǎn)品則較多地應(yīng)用噴霧干燥、氣流干燥等直接干燥法。（1）真空干燥在相同溫度下，被干燥物質(zhì)所含水分或溶劑由于周圍空氣壓力的降低蒸發(fā)速度增加。真空度愈高，溶劑沸點愈低，蒸發(fā)愈快。其原理與真空濃縮（或稱減壓濃縮）相同。真空干燥適用于不耐高溫、易氧化物質(zhì)的干燥和保存，整個裝置包括干燥器、冷凝器、及真空泵3部分。干燥器頂部連接一帶活塞的管道接通冷凝器，氣化后的蒸氣由此管道通過冷凝管凝聚，冷凝器另一端連接真空泵，干燥器內(nèi)常放一些干燥劑如五氧化二磷、無水氯化鈣等，以便干燥保存樣品。（2）冷凍真空干燥冷凍真空干燥除利用真空干燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同的壓力下，水蒸氣壓隨溫度的下降而下降。在低溫下低壓下冰很容易升華為氣體。操作時通常將等干燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。干燥后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點，適用于各類生物大分子的干燥保存。樣品干燥時先在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪成薄層（厚度不超過1cm的液體），置于低溫冰箱內(nèi)凍固。另在真空干燥器內(nèi)用兩個培養(yǎng)皿分別放置固體氫氧化鈉和五氧化二磷，真空干燥上端抽氣通過五氧化二磷干燥管與真空泵相連。當放進等待干燥的凍塊后，立即封閉干燥器，開動真空泵，紅5?10h后得冷凍干燥品。也可將待干燥物質(zhì)置于圓底容器中，然后浸入干冰-乙醇混合而成的冷卻劑中，容器內(nèi)液體迅速凍成固體，抽真空后等干燥凍塊的水分子升華變成氣體，經(jīng)過冷凝器凝結(jié)為霜。冰凍的樣品逐漸失去水分變成疏松的干燥粉末。上述操作關(guān)鍵在于真空泵的高真空度及管道的口徑要合適。（3）噴霧干燥噴霧干燥是將液體通過噴灑裝置噴成霧滴后，與干燥介質(zhì)（通常為熱空氣）直接接觸干燥的方法。由于液體分散為霧滴時，直徑通常只有1?200um大小，與熱空氣接觸面大，水分蒸發(fā)很快。在100°C的熱空氣中只需不到1秒的時間即可干燥。因干燥時間短和水分蒸發(fā)時吸收熱量，使液滴及其附近的空氣溫度較低，故工業(yè)上常用。7.樣品貯藏保存保存方法和生物大分子穩(wěn)定性有很大關(guān)系，生物大分子的貯藏保存可分為干態(tài)和液態(tài)貯藏兩種。但不論是干態(tài)或液態(tài)貯藏均應(yīng)避免長期暴露于空氣中防止微生物的污染。溫度對生物大分子的穩(wěn)定性影響很大，低溫保存在大多數(shù)情況下是有利的。(1)干態(tài)貯藏干燥的制品一般比較穩(wěn)定，如制品含水量很低，要低溫情況下物質(zhì)大分子活性可在數(shù)月甚至數(shù)年無顯著變化。貯藏方法也很簡單，只將干燥后的樣品置于干燥容器內(nèi)(內(nèi)裝有干燥劑)密封，保存于0?4°C冰箱中即可。有時為了取樣方便和避免取樣時樣品吸水和污染，可先將樣品分裝于許多小瓶中，每次用時只取出1瓶。(2)液態(tài)貯藏液態(tài)貯藏的優(yōu)點是使樣品免去干燥這一步驟，生物大分子的生理活性和結(jié)構(gòu)破壞較少；缺點是需要較嚴格的防腐措施，貯藏時間不能太長，如樣品量大時封裝運輸不方便，實驗室常采取少量安瓿封存法。液態(tài)貯藏注意事項如下：樣品不能太稀，必須濃縮至一定濃度后才能封裝貯藏，樣品太稀時易引起生物大分子變性作用。一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑，常用防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質(zhì)和酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，酶也可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性。此外鈣、鋅、硼酸等鹽溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸與氯化鈉的標準緩沖液中。貯藏溫度要求較低，大多數(shù)在0C左右冰箱保存即可，有的則要求更低溫度，但注意某些具有活性的大分子如DNA溶液低溫保存時，不宜使溶液結(jié)冰免其分子結(jié)構(gòu)被破壞。另有文獻報道某些蛋白質(zhì)和酶在低溫中反而引起變性。故應(yīng)分加情況對待，不能一概而論?？傊?，生物大分子的貯藏和保存，溫度和水分是影響穩(wěn)定性的兩個主要因素。其次，各種穩(wěn)定劑的應(yīng)用是否適當關(guān)系也很大。實際應(yīng)用時應(yīng)全面加以考慮。8.蛋白質(zhì)純度蛋白質(zhì)提純以后需要有指標來說明它的純度，從原則上看有許多制備純化蛋白質(zhì)的方法是可以將它們改成分析方法的，如各種分析的電泳、微量凝膠過濾法、各種層析、結(jié)晶出現(xiàn)、生物活力及免疫分析等。用一種方法一個條件來分析蛋白質(zhì)的純度是不夠的。由于蛋白質(zhì)數(shù)量多，性質(zhì)相似者在所難免，一個條件下兩個蛋白質(zhì)不能分開的可能性是很大的，一般均希望用兩種以上的方法來分析蛋白質(zhì)的純度。只有一種檢定方法時應(yīng)該用兩種以上條件來鑒定。對蛋白質(zhì)純度的要求因工作需要而異，生物制品考慮制品體內(nèi)的副作用，物理化學研究要求不干擾對象的物化性質(zhì)，化學結(jié)構(gòu)分析要示雜質(zhì)含量低于分析方法的靈敏度等等均要作具體分析。確定蛋白質(zhì)(或多肽)樣品的純度標準大致如下。即分子大小是否均一，電荷是否均一，是否具有恒定的氨基酸組成，是否具有單一的N末端和C末殘基，進一步純化時生物活性是否再有提高及能否結(jié)晶等，從N末端端測順序一在4步以上。如果都是單一的氨基酸殘基，則含雜質(zhì)可能為十六般萬分之一。上述幾條是較嚴格的要求，很難全都達到。通常以電泳時呈現(xiàn)一條帶以及末端殘基鑒定是單一的即可進行順序測定。隨著分析技術(shù)水平的不斷提高，經(jīng)常還將一種曾認為是純的蛋白質(zhì)分離成幾個組分，即出現(xiàn)微不均一性(Microheterogeneity)的現(xiàn)象。這種不均一性可分為兩類情況。一類是在蛋白質(zhì)肽鏈合成后在加工中產(chǎn)生的，如糖蛋白由于含糖量不同，它們的電泳行為常表現(xiàn)很大差異，又如賴氨酸的甲基化，絲氨酸的磷?；约盎酋；?，也會產(chǎn)生電泳行為的不均一性；還有一些則是在分離純化過程中人為產(chǎn)生的，如脫酰氨等，這種不均一性對蛋白質(zhì)順序分析不會帶來太大的困難。另一類不均一性是由于基因家族產(chǎn)生的，它們