人教版高中生物選修3 專題1基因工程11 DNA重組技術的基本工具 教學課件

選修3現(xiàn)代生物技術專題專題1.基因工程1.1DNA重組技術的基本工具一、基因重組技術的概念二、DNA重組技術的基本工具選修3現(xiàn)代生物技術專題專題1.基因工程1.1DNA重組1一、基因工程的概念1．手段：通過體外____________和____________等技術，賦予生物以新的____________。2．目的：按照人們的愿望進行嚴格的設計，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的_________和____________。3．設計和施工水平：____________水平，因此，基因工程又叫做DNA重組技術。DNA重組轉基因遺傳特性生物類型生物產(chǎn)品DNA分子一、基因工程的概念1．手段：通過體外____________2二、DNA重組技術的基本工具1．限制性核酸內切酶——“分子手術刀”(又稱限制酶)。(1)來源：主要是從____________中分離純化出來的。(2)功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的______________斷開，因此具有________性。經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：__________和________。原核生物磷酸二酯鍵專一黏性末端平末端二、DNA重組技術的基本工具1．限制性核酸內切酶——“分子手3前者是限制酶在它識別序列的______________將DNA的兩條鏈切開產(chǎn)生的，后者是限制酶在它識別序列的____________切開產(chǎn)生的。中心軸線兩側中心軸線處二、DNA重組技術的基本工具(3)種類EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶識別序列均為6個核苷酸，其中EcoRⅠ識別的序列為_________，從__和___直接切割，產(chǎn)生的末端為_________;SmaⅠ識別的序列為___________,從___和___直接切割，產(chǎn)生的末端為_________GAATTCGA黏性末端CCCGGGCG平末端前者是限制酶在它識別序列的______________將DN42．DNA連接酶——“分子縫合針”。(1)作用：將______________“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的______________，形成重組DNA分子。(2)種類。①E·coliDNA連接酶：只能縫合DNA片段的____________。雙鏈DNA片段磷酸二酯鍵黏性末端二、DNA重組技術的基本工具2．DNA連接酶——“分子縫合針”。雙鏈DNA片段磷酸二酯鍵5②T4DNA連接酶：既可縫合DNA片段的黏性末端，又可縫合DNA片段的________，但連接后者的效率________。3．運載體——“分子運輸車”。(1)作用：攜帶__________進入受體細胞。(2)種類：質粒、__________的衍生物、動植物病毒等。平末端低外源基因λ噬菌體二、DNA重組技術的基本工具②T4DNA連接酶：既可縫合DNA片段的黏性末端，又可縫合D6①能夠在受體細胞中進行__________，或整合到____________上，隨染色體DNA進行同步復制。②有一個至多個__________切割位點，供外源基因插入。③具有特殊的________________，供重組DNA的鑒定和選擇。自我復制染色體DNA限制酶遺傳標記基因(3)特點:二、DNA重組技術的基本工具①能夠在受體細胞中進行__________，或整合到____7一、目的基因的獲取有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用。載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉化。才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。1.2基因工程的基本操作程序二、基因表達載體的構建三、目的基因導入受體細胞四、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種8一、目的基因的獲?。ㄒ唬┠康幕蛑饕傅氖蔷幋a蛋白質的結構基因，也可以是一些具有調控作用的因子（調節(jié)基因）。對基因組中某個基因通過克隆擴增，獲得該基因進行研究或應用稱這種基因為目的基因。1.概念一、目的基因的獲取（一）目的基因主要指的是編9凡是編碼阻遏或激活結構基因轉錄的蛋白質的基因都稱為調節(jié)基因。把基因區(qū)分為結構基因和調節(jié)基因若著眼于這些基因所編碼的蛋白質的作用：2.結構基因和調節(jié)基因凡是編碼酶蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白或晶體蛋白等蛋白質的基因都稱為結構基因。（一）目的基因一、目的基因的獲取啟動子終止子啟動子終止子凡是編碼阻遏或激活結構基因轉錄的蛋白質的基因都10若轉入目的基因都是為了合成所需的酶、抗體、蛋白質激素、結構蛋白質，則需轉入結構基因。若轉入目的基因是為了調控某個結構基因的活動，則可轉入調節(jié)基因。2.結構基因和調節(jié)基因（一）目的基因從基因工程的目的看一、目的基因的獲取若轉入目的基因都是為了合成所需的酶、抗體、蛋白11（1）基因文庫的概念（二）目的基因的獲取途徑1.從基因文庫中獲取一、目的基因的獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因?；蚪M文庫部分基因文庫（cDNA文庫）未知序列（2）基因文庫的類型（1）基因文庫的概念（二）目的基因的獲取途徑1.從基因文庫中12（3）從基因組文庫中獲取目的基因一、目的基因的獲取

基因組文庫概念如果基因文庫包含了某種生物的所有基因，那么，這種基因文庫叫做基因組文庫。（3）從基因組文庫中獲取目的基因一、目的基因的獲取基因組文13一、目的基因的獲取

基因組文庫的構建提取某種生物的全部DNA用適當?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫導入受體菌中儲存一、目的基因的獲取基因組文庫的構建提取某種生物的全部DNA14

cDNA文庫的概念（4）從cDNA文庫中獲取目的基因（二）目的基因的獲取途徑如果基因文庫只包含了某種生物的一部分基因，這種基因文庫叫做部分基因文庫。一、目的基因的獲取cDNA文庫的概念（4）從cDNA文庫中獲取目的基因（二）15

cDNA文庫的構建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA重組載體與載體連接雙鏈cDNA片段DNA聚合酶cDNA文庫導入受體菌中儲存單鏈DNA反（逆）轉錄酶反（逆）轉錄法一、目的基因的獲取cDNA文庫的構建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mR16非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子編碼區(qū)RNA聚合酶轉錄mRNA前體剪接有關的酶剪接mRNA單鏈DNA逆轉錄酶逆轉錄DNA聚合酶復制cDNA不含非編碼系列。即不含非編碼區(qū)和內含子

cDNA文庫的構建反（逆）轉錄法一、目的基因的獲取非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子編碼區(qū)R17基因組DNA文庫cDNA文庫

基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較一、目的基因的獲取基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫18

基因組文庫與cDNA文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以區(qū)別一、目的基因的獲取基因組文庫與cDNA文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文19聯(lián)系

基因組文庫與cDNA文庫的比較一、目的基因的獲取聯(lián)系基因組文庫與cDNA文庫的比較一、目的基因的獲取20（二）目的基因的獲取途徑2.鳥槍法這種方法有如用獵槍發(fā)射的散彈打鳥，無論哪一顆彈粒擊中目標，都能把鳥打下來。（1）概念未知序列又叫“散彈射擊法”。將目的DNA隨機地處理成大小不同的片段，再將這些片段的序列連接起來的測序方法。(直接分離法)一、目的基因的獲?。ǘ┠康幕虻墨@取途徑2.鳥槍法這種方法有212.鳥槍法未知序列（2）過程供體細胞中的DNA許多DNA片段限制酶受體細胞導入產(chǎn)生特定性狀目的基因分離一、目的基因的獲取表達運載體與載體連接DNA連接酶2.鳥槍法未知序列（2）過程供體細胞中的DNA許多DNA片段222.鳥槍法未知序列（2）過程一、目的基因的獲取2.鳥槍法未知序列（2）過程一、目的基因的獲取233.化學合成法（二）目的基因的獲取途徑一、目的基因的獲取已知序列（1）根據(jù)已知的核苷酸序列合成DNA法結構基因的核苷酸序列目的基因化學合成DNA合成儀3.化學合成法（二）目的基因的獲取途徑一、目的基因的獲取已知24（2）據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法3.化學合成法已知序列根據(jù)已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列推測目的基因化學合成結構基因的核苷酸序列推測一、目的基因的獲?。?）據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法3.化學合成法已知序列25（二）目的基因的獲取途徑4.利用PCR技術擴增目的基因（1）概念多聚酶鏈式反應，是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能短時間內將微量的DNA大幅增加。這項技術是由穆里斯（K.Mullis）等人于1988年發(fā)明的，為此，穆里斯在1993年獲得諾貝爾化學獎。一、目的基因的獲?。ǘ┠康幕虻墨@取途徑4.利用PCR技術擴增目的基因（1）264.利用PCR技術擴增目的基因（2）原理DNA雙鏈半保留復制的原理，在體外將基因的核苷酸序列不斷地加以復制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。（3）前提條件一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。一、目的基因的獲取4.利用PCR技術擴增目的基因（2）原理DN27（4）條件四種脫氧核苷酸DNA引物（左引物和右引物）：熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）模板DNA：原料：4.利用PCR技術擴增目的基因一小段單鏈DNADNA聚合酶（耐高溫）：目的基因一、目的基因的獲?。?）條件四種脫氧核苷酸DNA引物（左引物和右引物）：熱穩(wěn)定284.利用PCR技術擴增目的基因（5）擴增方式（6）結果以指數(shù)方式擴增，即2n（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）。使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增。一、目的基因的獲取4.利用PCR技術擴增目的基因（5）擴增方式（6）結果以指數(shù)294.利用PCR技術擴增目的基因（7）過程（變性、退火、延伸）一、目的基因的獲取變性加熱至90～95℃雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈的DNA；冷卻至55～60℃引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合，形成局部雙鏈；

退火4.利用PCR技術擴增目的基因（7）過程（變性、退火、延伸）304.利用PCR技術擴增目的基因（7）過程（變性、退火、延伸）一、目的基因的獲取加熱至70～75℃在Taq酶的作用下，以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈。

延伸4.利用PCR技術擴增目的基因（7）過程（變性、退火、延伸）31一、目的基因的獲取反應的條件熱變性退火（復性）延伸（7）過程4.利用PCR技術擴增目的基因一、目的基因的獲取反應的條件熱變性退火（復性）延伸（7）過程32一、目的基因的獲取（7）過程4.利用PCR技術擴增目的基因一、目的基因的獲?。?）過程4.利用PCR技術擴增目的基因331234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍4.利用PCR技術擴增目的基因一、目的基因的獲取（7）過程1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸334理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

4.利用PCR技術擴增目的基因一、目的基因的獲?。?）擴增結果的曲線圖理想拷貝數(shù)=2n4.利用PCR技術擴增目的基因一、目的基因的35具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點。4.利用PCR技術擴增目的基因（9）優(yōu)點一、目的基因的獲取具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出36（10）PCR技術擴增與DNA復制的比較DNA復制PCR技術場所原理條件解旋方式酶特點結果堿基互補配對原則堿基互補配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復制、邊解旋邊復制半保留復制、全解旋再復制體外復制主要在細胞核內大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內的DNA聚合酶、解旋酶等4.利用PCR技術擴增目的基因一、目的基因的獲?。?0）PCR技術擴增與DNA復制的比較DNA復制PCR技術37二、基因表達載體的構建小結從基因文庫中獲取鳥槍法獲取化學合成法獲取PCR技術獲取從基因組文庫中獲取從cDNA文庫中獲取二、基因表達載體的構建小結從基因文庫中獲取鳥槍法獲取化學合成38二、基因表達載體的構建基因表達載體的構建是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。二、基因表達載體的構建基因表達載體的構建是實施39二、基因表達載體的構建1.過程（1）用一定的限制酶切割質粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。（2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。（3）將切下的目的基因片段插入質粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）。二、基因表達載體的構建1.過程（1）用一定的限制酶切割質粒，40二、基因表達載體的構建1.過程質粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）限制酶處理同一種二、基因表達載體的構建1.過程質粒DNA分子一個切口兩個切口41二、基因表達載體的構建2.連接結果（1）運載體與目的基因的連接（2）目的基因與目的基因的連接（3）運載體與運載體的連接二、基因表達載體的構建2.連接結果（1）運載體與目的基因的連42二、基因表達載體的構建3.目的（1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。（2）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。為什么要構建表達載體？思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？（P15）二、基因表達載體的構建3.目的（1）使目的基因在受體細胞中43科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基因在棉花體內沒有表達。然后在插入抗蟲基因的質粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W家又在有啟動子、抗蟲基因的質粒中插入終止子(抗蟲基因尾端)，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。資料分析:科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復雜的過程和44二、基因表達載體的構建4.表達載體的結構（2）啟動子（3）終止子（4）標記基因位于基因的首端,是mRNA結合位點位于基因的末端,終止轉錄檢測目的基因是否導入受體細胞（1）目的基因二、基因表達載體的構建4.表達載體的結構（2）啟動子（3）終45不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構建上述元件的主要理由是：（1）作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？（P15）5.幾個問題二、基因表達載體的構建不可以。（1）作為基因工程表達載體，只需含46a.生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；b.通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；c.目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；d.為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控元件，如增強子等；e.有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。二、基因表達載體的構建必須構建上述元件的主要理由是：a.生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子475.幾個問題（2）表達載體為什么一定要有啟動子？a.生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能有利于基因的表達；b.通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體細胞無法轉錄。二、基因表達載體的構建5.幾個問題（2）表達載體為什么一定要有啟動子？a.生物之間48是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。（4）標記基因有什么作用？5.幾個問題終止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄。（3）終止子的作用是什么？二、基因表達載體的構建是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將49①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵。③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少。④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。二、基因表達載體的構建①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DN50常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因導入受體細胞的原理：（一）轉化三、將目的基因導入受體細胞借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。是某一基因型的細胞從周圍介質中吸收來自另一基因型的細胞的DNA而使它的基因型和表現(xiàn)型發(fā)生相應變化的現(xiàn)象。該現(xiàn)象首先發(fā)現(xiàn)于細菌。常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵51（二）方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞三、將目的基因導入受體細胞（二）方法將目的基因導入將目的基因導入將目的基因導入農(nóng)桿菌轉521.將目的基因導入植物細胞農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法三、將目的基因導入受體細胞1.將目的基因導入植物細胞農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法三53（1）農(nóng)桿菌轉化法

農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物的受傷部位（受傷處的細胞會分泌大量酚類化合物、中性糖，從而使農(nóng)桿菌移向這些細胞），并誘導產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。三、將目的基因導入受體細胞（1）農(nóng)桿菌轉化法農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中54根癌農(nóng)桿菌能在自然條件下趨化性地感染140多種雙子葉植物或裸子植物的受傷部位，并誘導產(chǎn)生冠癭瘤。引發(fā)冠癭瘤的原因是，Ti質粒上的T-DNA上有8個左右的基因在植物細胞內表達，指導合成一種非常特殊的化合物冠癭堿，進而引起轉化細胞癌變。發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)根農(nóng)桿菌則誘導產(chǎn)生發(fā)狀根，其特征是大量增生高度分支的根系。其Ri質粒上有一段T-DNA。（1）農(nóng)桿菌轉化法三、將目的基因導入受體細胞根癌農(nóng)桿菌能在自然條件下趨化性地感染140多55根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中，并且可以通過減數(shù)分裂穩(wěn)定的遺傳給后代，這一特性成為農(nóng)桿菌介導法植物轉基因的理論基礎。

原理

Ti質粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。三、將目的基因導入受體細胞根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細胞中分別含有Ti質56科研人員將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術，再生出轉基因植株。農(nóng)桿菌介導法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導轉化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應用。

原理三、將目的基因導入受體細胞科研人員將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DN57Ti質粒表達新性狀目的基因表達載體構建轉入含有Vir致病基因農(nóng)桿菌導入植物外植體細胞插入植物細胞染色DNA新的植物個體植物組培技術③轉化過程:為什么？為什么？Ti質粒表達新性狀目的基因表達載體構建轉入含有Vir致病基因58③轉化過程:DNA③轉化過程:DNA59三、將目的基因導入受體細胞三、將目的基因導入受體細胞60利用農(nóng)桿菌對植物進行轉化，首先將目的基因插入到Ti質粒衍生的轉化載體上，形成重組DNA，然后將重組DNA轉入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌，再通過上述農(nóng)桿菌侵染植物外植體。三、將目的基因導入受體細胞③轉化過程:利用農(nóng)桿菌對植物進行轉化，首先將目的基因插入到Ti61植物傷口處的細胞分泌大量的酚類化合物、中性糖，酚類化合物如乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（HO-AS）等，一些中性糖如L-阿拉伯糖、D-木糖等，上述物質既是根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又是農(nóng)桿菌中毒性基因Vir表達的誘導物，在它們的作用下，導致T-DNA的加工和轉移，從而侵染植物細胞。研究表明，作為主要誘導物的乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮等酚類物質，主要在雙子葉植物細胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，因此根瘤農(nóng)桿菌不易直接侵染單子葉植物。三、將目的基因導入受體細胞為什么農(nóng)桿菌只侵染雙子葉植物和裸子植物而不能侵染單子葉植物呢？若想將一個抗病基因導入單子葉植物，如小麥，從理論上說，你認為應該怎樣做？植物傷口處的細胞分泌大量的酚類化合物、中性糖62要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物。要加趨化和誘導的物質，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導性）的基因，使T-DNA轉移并插入到染色體DNA上。如果想將一個抗病毒基因轉入小麥，也可以用農(nóng)桿菌，但要注意兩點：若想將一個抗病基因導入單子葉植物，如小麥，從理論上說，你認為應該怎樣做？三、將目的基因導入受體細胞要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌63④優(yōu)點農(nóng)桿菌Ti質粒轉化系統(tǒng)與其他基因轉化體系相比，具有許多突出的優(yōu)點：A.該轉化體系是模仿或稱之為利用天然的轉化載體系統(tǒng)，成功率高，效果好；B.農(nóng)桿菌Ti質粒轉化系統(tǒng)的機理研究得最清楚，方法最成熟，應用也最廣泛；三、將目的基因導入受體細胞④優(yōu)點農(nóng)桿菌Ti質粒轉化系統(tǒng)與其他基因轉化體64C.農(nóng)桿菌Ti質粒轉化系統(tǒng)轉化的外源基因以單拷貝為多數(shù)，遺傳穩(wěn)定性好，并且多數(shù)符合孟德爾遺傳規(guī)律，因此轉基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料；D.農(nóng)桿菌Ti質粒轉化系統(tǒng)操作比較容易，需要的儀器設備簡單，易于推廣。④優(yōu)點農(nóng)桿菌Ti質粒轉化系統(tǒng)與其他基因轉化體系相比，具有許多突出的優(yōu)點：三、將目的基因導入受體細胞C.農(nóng)桿菌Ti質粒轉化系統(tǒng)轉化的外源基因以單65（2）基因槍法適用于單子葉植物該法又稱粒子轟擊，高速粒子噴射技術或基因槍轟擊技術，是由美康奈爾大學生物化學系John.C.Sanford等于1983年研究成功。是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。三、將目的基因導入受體細胞

定義（2）基因槍法適用于單子葉植物該法又稱粒子66將直徑4um的鎢粉或金粉在供體DNA中浸泡，然后用基因槍將這些粒子打入細胞、組織或器官中，具有一次處理多個細胞的優(yōu)點，但轉化效率較低。另外這種方法也用于基因治療和抗體制備，并已取得初步成效。

基因槍法過程三、將目的基因導入受體細胞將直徑4um的鎢粉或金粉在供體DNA中浸泡67（3）花粉管通道法適用于被子植物三、將目的基因導入受體細胞（3）花粉管通道法適用于被子植物三、將目的基因導入受體細胞68

植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），經(jīng)過珠心進入胚囊，最終轉化尚不具備正常細胞壁的合子或早期胚胎細胞(被整合到受體細胞的基因組中)，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉基因的新個體。過程（3）花粉管通道法三、將目的基因導入受體細胞實例：抗蟲棉的培育植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通692.將目的基因導入動物細胞（1）方法三、將目的基因導入受體細胞思考：為什么要用受精卵而不用體細胞？顯微注射法將基因表達載體提純，用顯微儀注射到受精卵中2.將目的基因導入動物細胞（1）方法三、將目的基因導入受體細70顯微注射法（microinjection）是利用管尖極細（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內。三、將目的基因導入受體細胞顯微注射法（microinjection）71（2）操作程序三、將目的基因導入受體細胞基因表達載體受精卵移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物含目的基因的受精卵顯微注射導入培養(yǎng)后（2）操作程序三、將目的基因導入受體細胞基因表達載體受精卵移72這種顯微注射術的程序，需有相當精密的顯微操作設備，制造長管尖時，需用微量吸管拉長器，注射時需有固定管尖位置的微量操作器。這種技術的長處為任何DNA在原則上均可傳入任何種類的細胞內。此法已成功運用于包括小鼠、魚、大鼠、兔子及許多大型家畜，如牛、羊、豬等基因轉殖動物。（3）技術要求三、將目的基因導入受體細胞這種顯微注射術的程序，需有相當精密的顯微操733.將目的基因導入微生物細胞

常用法：Ca2+處理法

常用菌：大腸桿菌

微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少三、將目的基因導入受體細胞3.將目的基因導入微生物細胞常用法：Ca2+處理法常用菌74受態(tài)細胞（competentcell）：主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說，使得細胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞，便于外源基因或載體進入感受態(tài)細胞。由于細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。理化方法誘導細胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。三、將目的基因導入受體細胞受態(tài)細胞（competentcell）：主要75④過程Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA思考：為什么要用Ca2+處理受體細胞？用Ca2＋處理，增加細菌細胞壁的通透性。三、將目的基因導入受體細胞④過程Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合76④CaCl2法的過程A.將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0℃）預處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹，同時Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構，促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，誘導細胞成為感受態(tài)細胞細胞。膜通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA相粘附并在細胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復合物。聯(lián)合其它的二價金屬離子（如Mn、Co）、DMSO或還原劑等物質處理細菌，則可使轉化率提高100～1000倍。三、將目的基因導入受體細胞④CaCl2法的過程A.將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（077B.此時，將該體系轉移到42℃下做短暫的熱刺激（90s），細胞膜的液晶結構會發(fā)生劇烈擾動，并隨機出現(xiàn)許多間隙，外源DNA就可能被細胞吸收。進入細胞的外源DNA分子通過復制、表達，實現(xiàn)遺傳信息的轉移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。C.將轉化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出帶有外源DNA分子的陽性克隆。三、將目的基因導入受體細胞④CaCl2法的過程B.此時，將該體系轉移到42℃下做短暫的熱刺激（90s），細78受體生物

植物

動物

微生物受體細胞導入方法受精卵、體細胞受精卵細胞、個體農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術用Ca2+處理成感受態(tài)細胞三、將目的基因導入受體細胞4.導入三種不同生物受體細胞的方法的比較受體生物植物動物微生物受體細胞受精卵、體細胞79小結導入植物細胞導入動物細胞導入微生物細胞三、將目的基因導入受體細胞農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法CaCl2法不能百分之百成功的導入受體細胞中小結導入植物細胞導入動物細胞導入微生物細胞三、將目的基因導入80（一）分子水平上檢測四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細胞中的標記基因是否表達。2.檢測轉基因生物染色體的DNA上是否出入了目的基因，這是目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關鍵。3.檢測目的基因是否轉錄出來mRNA，這是檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步，采用DNA和RNA分子雜交技術。4.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質（一）分子水平上檢測四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細胞81導入受體細胞導入重組質粒導入普通質粒未導入質粒如何確定細胞中含有重組質粒？質粒上的標記基因人工在質粒上插入標記基因導入受體細胞導入重組質粒導入普通質粒未導入質粒如質粒上的人82四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細胞中的標記基因是否表達。（1）常見的標記基因四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因抗生素抗性基因使細菌對氨芐青霉素、氯霉素等抗生素產(chǎn)生抗性的基因。使細菌對四環(huán)素產(chǎn)生抗性的基因。產(chǎn)生

-內酰胺酶，使氨芐青霉素轉變?yōu)榍嗝雇幔沟?青霉素指示液（藍灰色）褪色。四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細胞中的標記基因是否表達83是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細胞發(fā)育功能的化學物質。以前被稱為抗菌素，事實上它不僅能殺滅細菌而且對霉菌、支原體、衣原體、螺旋體、立克次氏體等其它致病微生物也有良好的抑制和殺滅作用，通常將抗菌素改稱為抗生素?？股?四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細胞中的標記基因是否表達。（2）幾種抗菌物質的作用是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等84從放線菌金色鏈叢菌的培養(yǎng)液等分離出來的抗菌物質，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用，對結核菌、變形菌等則無效。四環(huán)素：四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細胞中的標記基因是否表達。（2）幾種抗菌物質的作用從放線菌金色鏈叢菌的培養(yǎng)液等分離出來的抗菌物85四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細胞中的標記基因是否表達。（2）幾種抗菌物質的作用殺死生長的細菌，但不殺死停止生長的細菌。環(huán)絲氨酸：主要用于對青霉素敏感的革蘭氏陽性菌、陰性菌的感染，如大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌等。氨芐青霉素：四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測受體細胞中的標記基因是否表達86四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因（3）質粒上的標記基因四、目的基因的檢測與鑒定四環(huán)素氨芐青霉（3）質粒上的標記基因四、目的基因的檢測與鑒定87（4）利用四環(huán)素抗性基因插入失活進行檢測四、目的基因的檢測與鑒定如果在四環(huán)素抗性基因上插入外源DNA，導致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。四環(huán)素抗性基因失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；四環(huán)素抗性基因不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。（4）利用四環(huán)素抗性基因插入失活進行檢測四、目的基因的檢測與88導入重組質粒導入普通質粒未導入質粒含四環(huán)素+環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基不抗四環(huán)素，生長被抑制并保留抗四環(huán)素，細菌生長，被環(huán)絲氨酸殺死含氨芐青霉素培養(yǎng)基無環(huán)絲氨酸使碘-青霉素指示液（藍灰色）褪色不抗四環(huán)素，生長被抑制不能使碘-青霉素指示液（藍灰色）褪色四、目的基因的檢測與鑒定導入重導入普未導入含四環(huán)素+環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基不抗四環(huán)素，生長被89（5）利用氨芐青霉素抗性基因插入失活進行檢測如果氨芐青霉素抗性基因上插入外源DNA，導致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。四、目的基因的檢測與鑒定外源DNA插入氨芐青霉素抗性基因（5）利用氨芐青霉素抗性基因插入失活進行檢測如果氨芐青霉素抗90（1）方法DNA分子雜交技術（DNA與DNA分子雜交）2.檢測轉基因生物染色體的DNA上是否出入了目的基因，這是目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關鍵。四、目的基因的檢測與鑒定（1）方法DNA分子雜交技術（DNA與DNA分子雜交）2.檢91（2）基因探針又稱“寡核苷酸探針”，簡稱“探針”，就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可以僅僅是目的基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉錄而來的RNA。DNA探針將一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或熒光染料等標記后制成的探針?？膳c固定在硝酸纖維素膜的DNA或RNA進行互補結合，經(jīng)放射自顯影或其他檢測手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。四、目的基因的檢測與鑒定（2）基因探針又稱“寡核苷酸探針”，簡稱“探92①首先取出轉基因生物的基因組DNA；②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針；③使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（3）過程轉基因生物的DNADNA探針14N14N變性變性15N15N穩(wěn)定性同位素四、目的基因的檢測與鑒定①首先取出轉基因生物的基因組DNA；②將含目的基因的DN93四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定943.檢測目的基因是否轉錄出來mRNA，這是檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步，采用DNA和RNA分子雜交技術。（1）方法分子雜交技術（DNA與mRNA分子雜交）變性DNA探針15N15N轉基因生物的mRNA14N14N（2）過程四、目的基因的檢測與鑒定3.檢測目的基因是否轉錄出來mRNA，這是檢測目的基因是否發(fā)95蘇云金桿菌將Bt毒蛋白注射小鼠體內從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體

出現(xiàn)雜交帶組織培養(yǎng)Bt毒素蛋白蛋白質提取4.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質（1）方法抗原-抗體雜交（2）過程四、目的基因的檢測與鑒定蘇云金桿菌將Bt毒蛋白注射小鼠體內從小鼠血管抽出血液分離出抗96四、目的基因的檢測與鑒定（二）個體水平上檢測抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。四、目的基因的檢測與鑒定（二）個體水平上檢測抗蟲、抗病接種實97思考與探究3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關細胞器功能的知識，結合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？提示：有些蛋白質肽鏈上有共價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內質網(wǎng)和高爾基復合體上加工完成的，內質網(wǎng)和高爾基復合體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。思考與探究3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關98提示：基本操作如下：（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。（2）將cDNA前接在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構建成一個表達載體。（3）將表達載體導入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死亡；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌的群落，則表明β-珠蛋白基因已進入其中。（4）培養(yǎng)進入了β-珠蛋白的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取β-珠蛋白。4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成部分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的β-珠蛋白，想一想，應如何進行設計？思考與探究提示：基本操作如下：4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成部99尋根問底提示：結構基因文科是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲取，也可以通過反轉錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構建基因文庫。1.為什么要構建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內提取不行么？尋根問底提示：結構基因文科是獲取目的基因的方法之一，并不是唯100提示：有人采用總DNA注射法進行遺傳轉化，即將一個生物中的總的DNA提取出來，用過注射或花粉管通道法導入手提植物，沒有進行表達載體的構建，這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定是什么基因導入了手提植物。此法目前爭