地中海貧血基因診斷課件

地中海貧血基因診斷LOGO地中海貧血基因診斷LOGO地中海貧血

地中海貧血介紹1

發(fā)病機制2

基因診斷和治療3地中海貧血地中海貧血介紹11925年,Cooley描述了一個幼兒患有貧血,并伴發(fā)有有核紅細胞增多癥.此后,意大利,希臘等地中海區(qū)域也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并報道類似疾病,因該病首先在地中海區(qū)域發(fā)現(xiàn),因此被稱為地中海貧血.(thalassemia).“地中海貧血癥”來源1925年,Cooley描述了一個幼兒患有貧血,并伴發(fā)有有核地中海貧血癥介紹地中海貧血(THAC)是一種較為常見的單基因遺傳性疾病，多出現(xiàn)在我國的南方各省，又以海南及兩廣沿海地區(qū)多發(fā)。其主要致病機制為α珠蛋白或β珠蛋白基因出現(xiàn)缺失或具有缺陷，從而引起血紅蛋白中不同肽鏈出現(xiàn)合成比例失衡，進而導(dǎo)致了溶血性貧血疾病的發(fā)生。地中海貧血癥介紹珠蛋白基因的結(jié)構(gòu)及表達1.珠蛋白基因的結(jié)構(gòu)α珠蛋白基因簇16p13β珠蛋白基因簇11p15珠蛋白基因的結(jié)構(gòu)及表達1.珠蛋白基因的結(jié)構(gòu)α珠蛋白基因簇地中海貧血的分型

·α地中海貧血：根據(jù)造成人貧血病情的嚴重性將其分為4種類型?！う碌刂泻Ｘ氀焊鶕?jù)造成病情的嚴重性分為3種類型：

·重型地中海貧血

·中間型地中海貧血

·輕型地中海貧血地中海貧血的分型·α地中海貧血：根據(jù)造成人貧血病情的嚴重性α地中海貧血(α地貧)的類型名

稱

基因型

缺失基因

a鏈的合成

Bart’s水腫胎兒綜合征

a0/a0

――/――

0

HbH病

a＋/a0

α―/――

25％

標(biāo)準(zhǔn)型

aA/a0

αα/――

50％

a＋/a＋

α―/α―

靜止型

aA/a＋

αα/α―

75％

正

常

aA/aA

αα/αα

100％

缺失一個α基因——尚有部分α鏈合成者，α+地貧；缺失兩個α基因——α鏈完全不能合成者，α0地貧。α地中海貧血(α地貧)的類型名稱基因型缺失基因a鏈4個α基因缺失→→α珠蛋白缺失→→γ4/高氧親和力→→組織嚴重缺氧A.HbBart’s胎兒水腫綜合癥4個α基因缺失→→α珠蛋白缺失→→γ4/高氧親和力→→組織嚴3個α缺失→β4

B.血紅蛋白H?。é?/α+）高氧親和力→組織缺氧H包涵體→溶血→貧血3個α缺失→β4C.標(biāo)準(zhǔn)型α地中海貧血

（α0/αA或α+/α+）D.靜止型α地中海貧血（α+/αA）C.標(biāo)準(zhǔn)型α地中海貧血

（α0/αA或α+/α+）D.靜

重型

地貧：(0／

0、+／

+、0／

0)

輕型

地貧：(0／

A、0／

A、0／

A)

中間型

地貧：(+(高F)／

+(高F)、+／

+)

遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)增多癥(HbFα2γ2)地貧臨床類型

β珠蛋白生成障礙性貧血重型地貧：(0／0、+／+、0／A.重型β地中海貧血患者不能合成β鏈α鏈過剩而沉降到紅細胞膜上，引起膜的性能改變，發(fā)生嚴重的溶血反應(yīng)，引起肝脾增大。組織缺氧，促進紅細胞生成素分泌，刺激骨髓增生，骨質(zhì)受損變得疏松，可出現(xiàn)鼻塌眼腫、上頷前突、頭大額隆等特殊的“地中海貧血面容”。A.重型β地中海貧血患者不能合成β鏈地中海貧血基因診斷課件B.中間型β地中海貧血

一般是β+地中海貧血基因的純合子，患者的基因型通常為β+（高F）／β+（高F）或β+／δβ+。病人的癥狀介于重型和輕型之間，故稱為中間型。C.輕型β地中海貧血

發(fā)生于β0或β+地中海貧血基因的雜合子，無任何臨床癥狀。B.中間型β地中海貧血C.輕型β地中海貧血D.遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)增多癥HbFα2γ2遺傳缺陷導(dǎo)致δ和β基因表達受到抑制，而γ鏈合成卻異常增高，使成人紅細胞內(nèi)的胎兒血紅蛋白HbF持續(xù)增多。D.遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)增多癥HbFα2γ2地中海貧血的分子機制α地中海貧血的分子機制地中海貧血的分子機制基因缺失：缺失型α地中海貧血基因突變：非缺失型α地中海貧血基因缺失基因突變編碼序列突變；轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列突變（TATAbox)；RNA加工和修飾信號序列突變（GT-AG接頭）地中海貧血的分子機制α地中海貧血的分子機制地中海貧血的分地中海貧血基因診斷課件地中海貧血基因診斷α地中海貧血的基因診斷步驟PCR擴增基因型分析

α地中海貧血的基因診斷結(jié)果地中海貧血基因診斷α地中海貧血的基因診斷步驟PCR擴增基因PCR擴增缺失型突變檢測PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min，98℃

45s，66℃30s，72℃

3min，35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。非缺失型突變檢測PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min，94℃60s，55℃30s，72℃60s，35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR擴增基因型分析將上述PCR擴增產(chǎn)物與膜條100℃變性10min，43℃雜交2h以上，洗膜，加入酶標(biāo)抗生物素蛋白，再次洗膜，加入酶底物顯色，具體步驟按說明書進行操作。雜交及顯色完成后，觀察膜條上的藍色斑點，若只有野生型探針處(N)顯色，為該位點的野生純合子;若只有突變型探針處(M)顯色，為該位點的突變純合子;若野生型探針處(N)和突變型探針處(M)均顯色，為該位點的雜合子?；蛐头治靓恋刂泻Ｘ氀幕蛟\斷結(jié)果樣本基因型缺失型和非缺失型α－地貧基因突變檢測結(jié)果見圖1和圖2。圖1缺失型α－地貧基因突變檢測結(jié)果圖2非缺失型α－地貧基因突變檢測結(jié)果α地中海貧血的基因診斷結(jié)果圖1缺失型α－地貧基因突變檢測結(jié)β地中海貧血的基因診斷步驟

PCR擴增反向點雜交(reversedot-blot,RDB)雜交結(jié)果判定

α地中海貧血的基因診斷結(jié)果β地中海貧血的基因診斷步驟

PCR擴增反向點雜交(revPCR擴增

抽取受檢者EDTA抗凝血2ml，按試劑盒操作說明書提取患者DNA,在A、B兩管PCR反應(yīng)液中分別加入提取的DNA2ul。PCR反應(yīng)條件為:93℃預(yù)變性5min;93℃變性30s,復(fù)性60℃

30s,72℃延伸1min,35個循環(huán);最后72℃延伸5min。PCR擴增反向點雜交(reversedot-blot,RDB)

將上述PCR擴增產(chǎn)物與膜條100變性10min,42℃雜交4h以上,洗膜,加入酶標(biāo)抗生物素蛋白,再次洗膜,加入酶底物顯色,觀察結(jié)果。具體步驟按說明書進行操作。反向點雜交(reversedot-blot,RDB)

雜交結(jié)果判定

雜交結(jié)果判定

雜交結(jié)果判定

雜交膜條上結(jié)合的14種ASO探針排列順序見表1。探針排列成3排,上排和中排分別對應(yīng)8種常見突變位點的野生型(N)和突變型(M)探針,下排分別對應(yīng)顯色反應(yīng)控制點,空白點和6種稀少突變位點的突變型(M)探針。雜交及顯色完成后,顯色反應(yīng)控制點呈邊緣清晰的藍色圓點,否則需要重新檢查雜交過程。所有的野生型(N)顯色,突變型(M)不顯色為正常人;某一位點的野生型(N)和突變型(M)均顯色,為這一位點的雜合子;某一位點只有突變型(M)顯色,野生型(N)不顯色,為這一位點的突變純合子;某兩個位點的野生型(N)和突變型(M)均顯色,為這兩個位點的雙重雜合子。雜交結(jié)果判定β地中海貧血的基因診斷5種突變等位基因β地中海貧血的基因診斷5種突變等位基因關(guān)于基因治療的展望不久的將來,人類可望在基因的分子結(jié)構(gòu)上自我認識,了解人體內(nèi)60兆個細胞中的約10萬個基因以及它們的特征和功能,這樣影響人類健康的所有疾病均能作預(yù)防基因治療,我們期待著這一天的早日到來。關(guān)于基因治療的展望不久的將來,人類可望在基因的分子結(jié)參考文獻[1]《地中海貧血88例基因診斷結(jié)果分析》[2]《地中