四國(guó)藥典細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)比

CP(2015版)1143EP〔8.0〕2.6.14USP〔36〕85JP〔16〕6.06定義CP(2015)EP(8.0)USP(36)JP(16)

本法系利用鱟試劑來檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)素素本法利用鱟試劑〔從美洲鱟或中華鱟——阿米巴細(xì)胞溶解產(chǎn)物制備而來〕檢測(cè)由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素或?qū)?nèi)毒素進(jìn)展定量檢查和定量供試品內(nèi)毒素的方法。本法利用鱟〔美洲鱟或中華鱟〕阿米巴細(xì)胞溶解產(chǎn)物制備的用于內(nèi)毒素檢測(cè)的鱟試劑〔LAL〕檢定內(nèi)毒素本法利用鱟試劑〔從美洲鱟或中華鱟——阿米巴細(xì)胞溶解產(chǎn)物制備而來〕檢測(cè)由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素或?qū)?nèi)毒素進(jìn)展定量方法方法CP(2015)EP(8.0)一、凝膠法二、光度測(cè)定法1、濁度法2、顯色基質(zhì)法A：凝膠法：限度試驗(yàn)B：凝膠法：定量試驗(yàn)C：動(dòng)態(tài)濁度法D：終點(diǎn)顯色法USP(36)USP(36)JP(16)F：終點(diǎn)濁度法一、凝膠法二、光度測(cè)定法1、濁度法2、顯色法一、凝膠法二、光度測(cè)定法1、濁度法2、顯色法儀器CP(2015)EP(8.0)USP(36)JP(16)

干熱滅菌法2530分鐘以上干熱滅菌法2530分鐘以上干熱滅菌法2530分鐘以上干熱滅菌法2530分鐘以上溶液制備溶液制備CP(2015)EP(8.0)供試品溶液的制備某些供試品需進(jìn)展復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。必要時(shí)，可調(diào)整被測(cè)溶液(或其稀釋液〕的pH鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0-8.0的范圍內(nèi)為宜，可使用適宜的酸、堿溶液或緩沖液調(diào)整pH值。酸或堿溶液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢査用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。緩沖液必需經(jīng)過驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。內(nèi)毒素儲(chǔ)藏標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制備內(nèi)毒素儲(chǔ)藏標(biāo)準(zhǔn)溶液；所用的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品必需先用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)，如內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)BRP。內(nèi)毒素以國(guó)際單位〔IU〕表示。IU的換算見國(guó)際衛(wèi)生組織公布的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。注：一國(guó)際單位I〕內(nèi)毒素相當(dāng)于一個(gè)內(nèi)毒素單位E.U。依據(jù)包裝說明書上的標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)毒素儲(chǔ)藏標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)簽上關(guān)于制備和貯存的說明。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備充分混合內(nèi)毒素儲(chǔ)藏標(biāo)準(zhǔn)溶液后，用細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)檢查用水〔BET檢查用水〕稀釋，制成適當(dāng)?shù)南盗邢♂屢?，即得BET檢查用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。得到的稀釋液應(yīng)盡快使用，以免因吸附而導(dǎo)致活性損失。供試品溶液的制備除非另有說明，以BET檢查用水溶解或稀釋活性成分或藥品來制備供試品溶液。某些成分或藥品可能在其它的水溶液中溶解度更高。如有必要，調(diào)整待測(cè)溶液〔或它的稀釋液〕的pH值，使鱟試劑和供試品溶液的混合物的pH值在所選鱟試劑生產(chǎn)商的指定pH范圍內(nèi)。一般要求供試品溶液的pH6.0-8.0?？捎明c試劑生產(chǎn)商推舉的酸、堿或適當(dāng)?shù)木彌_溶液來調(diào)解pH值。酸或堿溶液須用BET檢查用水在去除內(nèi)毒素的容器中配制。緩沖液必需經(jīng)過驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。USP(36)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素儲(chǔ)藏液WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)過的USP內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制備的。內(nèi)毒素用EU表示?！咀ⅲ?EU=1IU】?jī)?nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液——將內(nèi)毒素儲(chǔ)藏液混合均勻，再用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水對(duì)其作適當(dāng)?shù)南盗邢♂尅１M快使用稀釋液，以避開因吸附而失去活性。供試液——供試溶液是通過用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解、稀釋藥物制備。某些物質(zhì)或制劑可能在其他水溶液中被更適當(dāng)?shù)厝芙狻⑾♂?。如有必要，調(diào)整待測(cè)溶液的pH值，使鱟試劑和樣品的混合物pH在由鱟試劑生產(chǎn)者定的pH范圍內(nèi)。通常使用于pH范圍在6.0-8.0的產(chǎn)品。pH的緩沖劑必需進(jìn)展驗(yàn)證無內(nèi)毒素和干擾因子。JP(16)

內(nèi)毒素儲(chǔ)藏標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備以BET10000100比照標(biāo)準(zhǔn)品，制取細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)〔BET〕的內(nèi)毒素儲(chǔ)藏標(biāo)準(zhǔn)溶液。內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位E〕1EU相當(dāng)于1個(gè)內(nèi)毒素國(guó)際單位I。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備充分混合內(nèi)毒素儲(chǔ)藏標(biāo)準(zhǔn)溶液后，用水稀釋，即得BET檢查用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。得到的稀釋液應(yīng)盡快使用，以免因吸附而導(dǎo)致活性損失。供試品溶液的制備除非另有說明，以除非另有說明，以BET待測(cè)溶液的pH值，使鱟試劑和供試品溶液的混合物的pH值在所選鱟試劑的使用pH范圍內(nèi)。一般要求供試品溶液的pH值范圍為6.0-8.0。試液或調(diào)整pHBET內(nèi)毒素限值確實(shí)定及最大有效稀釋倍數(shù)CP(2015) 藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)一般按以下公式確定：L=K/M式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性單位〕表示；K為人每千克體重每小時(shí)最大可承受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg?h)表示，注射劑K=5EU/(kg?h)，放射性藥品注射劑K=2.5EU/(kg?h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kg?h)；M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/(kg?h)、mg/(kg?h)或U/(kg?h60kg計(jì)算，人體外表積按1.62m2計(jì)算。注射時(shí)間假設(shè)缺乏1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。供試品每平方米體外表積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量(M)。按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特別狀況，可依據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際狀況做必要調(diào)整，但需說明理由。最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗(yàn)中供試品溶液被允許到達(dá)稀釋的最大倍數(shù)〔1-MVD),在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)展內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。用以下公式來確定MVD:MVD=cL/λ式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；c為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí)，c的單位需為mg/ml或U/ml,當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則c等于l.0ml/ml。如需計(jì)算在MVD時(shí)的供試品濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c=λ/L；λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度〔EU/ml)，或是在光度測(cè)定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。EP(8.0)

最大有效稀釋倍數(shù)〔MVD〕指可檢測(cè)出內(nèi)毒素限值的供試品溶液的最大稀釋倍數(shù)。MVD按以下公式確定：MVD=內(nèi)毒素限值×供試品溶液濃度/λ內(nèi)毒素限值：在劑量的根底上，注射藥物的活性成分的內(nèi)毒素限度為K/MK=人每公斤體重每小時(shí)最大可承受的內(nèi)毒素劑量〔EU/kg〕M＝人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量。專論中，注射劑的活性成分的內(nèi)毒素限度的單位有IU/ml、IU/mg、IU/生物活性單位等。供試品溶液的濃度表示法：－當(dāng)內(nèi)毒素限度以質(zhì)量〔IU/mg〕表示時(shí)，用mg/ml-當(dāng)內(nèi)毒素限度以〔IU/ml〕表示時(shí)，用ml/ml-當(dāng)內(nèi)毒素限度以生物單位〔IU/Unit〕Units/mlλ=指凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，或指濁度法或顯色法使用的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線上最低點(diǎn)〔IU/ml)的對(duì)應(yīng)值。USP(36) 最大有效稀釋倍數(shù)〔MVD〕指可檢測(cè)出內(nèi)毒素限值的供試品溶液的最大稀釋倍數(shù)。按以下公式確定：MVD=內(nèi)毒素限值×供試品溶液濃度/λK/M2，其中K是每千克體重內(nèi)毒素的閾值熱劑量；M是每千克體重產(chǎn)品的最大推舉劑量。當(dāng)進(jìn)展間隔頻繁注射和連續(xù)輸液時(shí)，MEU/mL,EU/mg,EU/單位生物活性等。供試液濃溶液——mg/mL:內(nèi)毒素規(guī)定為重量〔EU/mg〕的狀況下表示；Units/mL：內(nèi)毒素規(guī)定為重量〔EU/單位生物活性〕的狀況下表示；mL/mL：內(nèi)毒素規(guī)定為重量〔EU/mL〕的狀況下表示。λ：凝膠法〔EU/mL〕或者用于濁度法和顯色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度的標(biāo)示靈敏度。JP(16)

最大有效稀釋倍數(shù)〔MVD〕指可檢測(cè)出內(nèi)毒素限值的供試品溶液的最大稀釋倍數(shù)。MVDMVD=內(nèi)毒素限值×供試品溶液濃度/λ內(nèi)毒素限值：依據(jù)劑量，注射劑的內(nèi)毒素限度即為K/M的值，其中K為人每公斤體重可承受的內(nèi)毒素中熱原的最小量EU/k，M小時(shí)的最大供試品劑量。供試品溶液的濃度表示法：當(dāng)內(nèi)毒素限度以質(zhì)量〔EU/mg〕表示時(shí)，用mg/mL表示濃度。當(dāng)內(nèi)毒素限度以〔EU/mEq〕當(dāng)內(nèi)毒素限度以〔EU/mEq〕表示時(shí)，用mEq/mL表示濃度。當(dāng)內(nèi)毒素限度以生物單位〔EU/Unit〕表示時(shí)，用Units/mL表示濃度。當(dāng)內(nèi)毒素限度以體積〔EU/mL〕表示時(shí)，用mL/mLλ：指凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度〔EU/mL)，或?yàn)闈岫确ɑ蝻@色法使用的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線上最低點(diǎn)〔EU/mL)的對(duì)應(yīng)值。凝膠法CP(2015) 凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反響的原理進(jìn)展限度檢測(cè)或半定量檢測(cè)內(nèi)毒素的方法。鱟試劑靈敏度復(fù)核EU/ml表示。當(dāng)使用批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的轉(zhuǎn)變時(shí)，應(yīng)進(jìn)展鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。依據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值(A)15分鐘，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒。取分裝有0.1ml鱟試劑溶液的10mm×75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加人0.lml不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管參加0.1ml37±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，假設(shè)管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫順拿取試管過程應(yīng)避開受到振動(dòng)，造成假陰性結(jié)果。當(dāng)最大濃度2λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性比照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算反響終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值(λc)。λc=antilg〔∑X/n〕式中X為反響終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值〔lg)。反響點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最終一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度；n為每個(gè)濃度的平行管數(shù)。當(dāng)λc在0.5-2λ(包括0.5λ和2λ)時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢査，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。干擾試驗(yàn)按表1制備溶液A、B、C和D(MVD)的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。表1凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/被參加內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)稀釋后內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液——－2B2λ/供試品溶液供試品溶液12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/檢查用水檢查用水12λ221λ240.5λ280.25λ2D無/檢查用水－－－2注：A為供試品溶液；B為干擾試驗(yàn)系列；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的比照系列；D為陰性比照。只有當(dāng)溶液A和陰性比照溶液D的全部平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，試驗(yàn)方為有效。當(dāng)系列溶液B的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。MVDMVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)?？赏ㄟ^對(duì)供試品進(jìn)展更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法(如過濾、中和、透析或加熱處理等)排解干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排解干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)展干擾試驗(yàn)。當(dāng)進(jìn)展藥的內(nèi)毒素檢査試驗(yàn)前，或無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)展干擾試驗(yàn)。當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝轉(zhuǎn)變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重進(jìn)展干擾試驗(yàn)。EP(8.0) 凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反響的原理來檢測(cè)或定量?jī)?nèi)毒素的方法。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，可引起鱟試液凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度。為確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、有效，應(yīng)依據(jù)預(yù)備試驗(yàn)中的說明開展試驗(yàn)，復(fù)核鱟試劑的標(biāo)示靈敏度和試驗(yàn)的干擾因素。預(yù)備試驗(yàn)鱟試劑的標(biāo)示靈敏度復(fù)核試驗(yàn)靈敏度用IU/ml表示。應(yīng)在鱟試劑用于檢查內(nèi)毒素之前對(duì)靈敏度進(jìn)展復(fù)核；復(fù)核試驗(yàn)需要制備標(biāo)示靈敏度λ的4支平行管。當(dāng)使用批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的轉(zhuǎn)變時(shí)，應(yīng)進(jìn)展鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。BET2λ、λ、0.5λ0.25λ四種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在每支試管中，分別混合等體積〔通常為0.1mL)的鱟試液和標(biāo)準(zhǔn)溶液。如使用的是裝有鱟試劑凍干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接加入溶液。依據(jù)鱟試劑生產(chǎn)商的建議，將反響混合物孵育一段時(shí)間(通常在37±1℃下保存60±2分鐘)，在此過程中，不能震驚試管。凝膠的完整性測(cè)試：如使用試管作為容器，先將試管從保溫箱中取出，再緩緩將試管倒轉(zhuǎn)1800。假設(shè)形成了堅(jiān)實(shí)的凝膠，倒轉(zhuǎn)后凝膠不移位，此時(shí)將該項(xiàng)檢查的結(jié)果記錄為陽(yáng)性。如未能形成堅(jiān)實(shí)且不變形的凝膠，該項(xiàng)檢查的結(jié)果即為陰性。僅在最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的全部平行管的檢查結(jié)果均為陰性的狀況下，試驗(yàn)方為有效。反響終點(diǎn)濃度指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最終一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。將終點(diǎn)濃度取對(duì)數(shù)，計(jì)算它們的平均值，再將平均值的結(jié)果取反對(duì)數(shù)，最終的表達(dá)式如下：終點(diǎn)濃度的幾何平均值＝lg-1(Σe/f)Σe＝所用系列溶液的終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值的和f＝平行管的數(shù)量反響終點(diǎn)的濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的測(cè)量值IU/m。當(dāng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.λ至2.λ劑的標(biāo)示靈敏度為λ，可用于內(nèi)毒素的檢查。干擾因素試驗(yàn)開展該項(xiàng)試驗(yàn)的目的是檢查供試品溶液中反響的增加因素或阻抑因素的存在。2.6.14.-1制備溶液A、B、C、D。供試品的稀釋度不得超過MVD，且供試品溶液不能檢查出內(nèi)毒素，具體操作見〔1〕預(yù)備試驗(yàn)的〔i〕鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)。2.6.14-1溶液內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋劑稀釋倍數(shù)稀釋后內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液－－－4B2λ/供試品溶液供試品溶液12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/BETBET12λ221λ240.5λ280.25λ2D0/BET－－－2A=經(jīng)檢查無內(nèi)毒素的溶液B=干擾試驗(yàn)用C=鱟試劑標(biāo)示靈敏度的比照品D=陰性比照品〔BET〕依據(jù)〔1〕預(yù)備試驗(yàn)下的〔i〕鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)中列出的公式，計(jì)算B和C溶液的終點(diǎn)濃度的幾何平均值。如試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響到試驗(yàn)結(jié)果的變化，須重進(jìn)展干擾因素試驗(yàn)。只有當(dāng)溶液AD的全部平行管中無反響、且溶液C的結(jié)果在復(fù)核的鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方有效。經(jīng)測(cè)定，假設(shè)溶液B的靈敏度在[0.5λ，2.0λ]間，可判定供試品溶液在該試驗(yàn)條件下，對(duì)試驗(yàn)無干擾；反之則判定供試品溶液對(duì)試驗(yàn)?zāi)苄纬筛蓴_。假設(shè)供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)展不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)。使用靈敏度更高的鱟試劑進(jìn)展內(nèi)毒素的檢查時(shí)，由于靈敏度更高的鱟試劑能排解試驗(yàn)的干擾因素，供試品的稀釋倍數(shù)也可適當(dāng)放寬?？赏ㄟ^其他適宜的方法〔如過濾、中和、透析或加熱處理等〕排解干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排解干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)展干擾試驗(yàn)。USP(36)凝膠法系通過LAL即為L(zhǎng)AL試劑的標(biāo)示靈敏度。為確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、有效，應(yīng)依據(jù)凝膠法的預(yù)備試驗(yàn)中的說明開放試驗(yàn)，復(fù)核鱟試劑的標(biāo)示靈敏度和試驗(yàn)的干擾因素。凝膠法的預(yù)備試驗(yàn)LALLAL試劑批中至少一支西林瓶。用LAL試劑用水對(duì)倍稀釋USPRS2λ、λ、0.5λ0.25λ〔λ的定義見上文。每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度和陰性比照品平行作4LAL條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的轉(zhuǎn)變時(shí)，應(yīng)進(jìn)展LAL在每支試管中，分別混合等體積〔如0.1mL)的LAL試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液。如使用的是裝有LAL試劑凍干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接參加溶液。依據(jù)LAL生產(chǎn)廠家的說明，保溫裝有反響試劑混合物的試管〔通常在31℃下保存62分鐘保溫完畢后，為測(cè)試凝膠的完整性，緩緩將每個(gè)容器倒轉(zhuǎn)1800。假設(shè)形成了堅(jiān)實(shí)的凝膠，倒轉(zhuǎn)后凝膠不移位，此時(shí)將該項(xiàng)檢查的結(jié)果記錄為陽(yáng)性。如未能形成凝膠，或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、在倒轉(zhuǎn)過程中消滅了滑脫，該項(xiàng)檢查的結(jié)果即為陰性。僅在最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的全部平行管的檢查結(jié)果均為陰性的狀況下，方可判定試驗(yàn)有效。反響終點(diǎn)濃度指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最終一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。使用下面的公式，計(jì)算終點(diǎn)濃度的幾何平均值：終點(diǎn)濃度的幾何平均值＝lg-1(Σe/f)Σef為平行管的數(shù)量。反響終點(diǎn)的幾何平均值即為L(zhǎng)AL試劑的標(biāo)示靈敏度〔單位為EU/m0.5λ2.0λ之間，可判定受試LALλ。1制備溶液A、B、C、D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過MVD的溶液，按LAL復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。用檢查法給出的公式計(jì)算溶液B、C1凝膠法的阻抑/增加試驗(yàn)溶液的制備溶液內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋劑 稀釋倍數(shù)稀釋后內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液— －－4B2λ/供試品溶液供試品溶液 12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/LALLAL試劑用水 12λ221λ240.5λ280.25λ2D無/BET— －－2A：去除內(nèi)毒素的供試品溶液B：干擾試驗(yàn)溶液C：LALD：LAL如試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響到試驗(yàn)結(jié)果的變化，須重進(jìn)展干擾因素試驗(yàn)。只有當(dāng)溶液A和D中無反響、且溶液C的結(jié)果在復(fù)核的標(biāo)示靈敏度范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方有效。計(jì)算溶液B的鱟試劑靈敏度，假設(shè)值在[0.5λ，2.0λ]間，可判定供試品溶液在該濃度下無干擾作用；反之則判定供試品溶液對(duì)試驗(yàn)?zāi)苄纬筛蓴_。假設(shè)供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)展不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)。使用靈敏度更高的鱟試劑進(jìn)展內(nèi)毒素的檢查時(shí)，由于靈敏度更高的鱟試劑能排解試驗(yàn)的干擾因素，供試品的稀釋倍數(shù)也可適當(dāng)放寬?？赏ㄟ^對(duì)供試品溶液或進(jìn)展更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法〔如過濾、中和、透析或加熱處理等〕排解干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排解干擾且不會(huì)造成內(nèi)毒素的活性損失，要使用預(yù)先添加了USP內(nèi)毒素RSJP(16)凝膠法系通過LAL即為L(zhǎng)AL試劑的標(biāo)示靈敏度。為確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、有效，應(yīng)依據(jù)凝膠法的預(yù)備試驗(yàn)中的說明開放試驗(yàn)，復(fù)核鱟試劑的標(biāo)示靈敏度和試驗(yàn)的干擾因素。凝膠法的預(yù)備試驗(yàn)LALLAL試劑批中至少一支西林瓶。用LAL試劑用水對(duì)倍稀釋USPRS2λ、λ、0.5λ0.25λ〔λ的定義見上文。每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度和陰性比照品平行作4LAL條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的轉(zhuǎn)變時(shí)，應(yīng)進(jìn)展LAL在每支試管中，分別混合等體積〔如0.1mL)的LAL試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液。如使用的是裝有LAL試劑凍干粉末的西林瓶或安瓿，可向其中直接參加溶液。依據(jù)LAL生產(chǎn)廠家的說明，保溫裝有反響試劑混合物的試管〔通常在31℃下保存62分鐘保溫完畢后，為測(cè)試凝膠的完整性，緩緩將每個(gè)容器倒轉(zhuǎn)1800。假設(shè)形成了堅(jiān)實(shí)的凝膠，倒轉(zhuǎn)后凝膠不移位，此時(shí)將該項(xiàng)檢查的結(jié)果記錄為陽(yáng)性。如未能形成凝膠，或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、在倒轉(zhuǎn)過程中消滅了滑脫，該項(xiàng)檢查的結(jié)果即為陰性。僅在最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的全部平行管的檢查結(jié)果均為陰性的狀況下，方可判定試驗(yàn)有效。反響終點(diǎn)濃度指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最終一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。使用下面的公式，計(jì)算終點(diǎn)濃度的幾何平均值：終點(diǎn)濃度的幾何平均值＝lg-1(Σe/f)Σef為平行管的數(shù)量。反響終點(diǎn)的幾何平均值即為L(zhǎng)AL試劑的標(biāo)示靈敏度〔單位為EU/m0.5λ2.0λ之間，可判定受試LALλ。1制備溶液A、B、C、D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過MVD的溶液，按LAL試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。用檢查法給出的公式計(jì)算溶液B、C的反響終點(diǎn)的幾何平均值。1凝膠法的阻抑/增加試驗(yàn)溶液的制備溶液內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋劑 稀釋倍數(shù)稀釋后內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液— －－4B2λ/供試品溶液供試品溶液 12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/LALLAL試劑用水 12λ221λ240.5λ280.25λ2D無/BET— －－2A：去除內(nèi)毒素的供試品溶液B：干擾試驗(yàn)溶液C：LALD：LAL如試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響到試驗(yàn)結(jié)果的變化，須重進(jìn)展干擾因素試驗(yàn)。只有當(dāng)溶液A和D中無反響、且溶液C的結(jié)果在復(fù)核的標(biāo)示靈敏度范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方有效。計(jì)算溶液B的鱟試劑靈敏度，假設(shè)值在[0.5λ，2.0λ]間，可判定供試品溶液在該濃度下無干擾作用；反之則判定供試品溶液對(duì)試驗(yàn)?zāi)苄纬筛蓴_。假設(shè)供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)展不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)。使用靈敏度更高的鱟試劑進(jìn)展內(nèi)毒素的檢查時(shí)，由于靈敏度更高的鱟試劑能排解試驗(yàn)的干擾因素，供試品的稀釋倍數(shù)也可適當(dāng)放寬。可通過對(duì)供試品溶液或進(jìn)展更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法〔如過濾、中和、透析或加熱處理等〕排解干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排解干擾且不會(huì)造成內(nèi)毒素的活性損失，要使用預(yù)先添加了USP方法能有效地排解干擾且不會(huì)造成內(nèi)毒素的活性損失，要使用預(yù)先添加了USP內(nèi)毒素RS再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)展干擾試驗(yàn)。凝膠限度試驗(yàn)CP(2015)按表2制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數(shù)不超過MVD并且已經(jīng)排解干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。表2凝膠限度試驗(yàn)溶液的制備編號(hào) 內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A 0/供試品溶液2B 2λ/供試品溶液2C 2λ/檢查用水2D 0/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為供試品陽(yáng)性比照；C為陽(yáng)性比照；D為陰性比照。結(jié)果推斷保溫60分鐘±2分鐘后觀看結(jié)果。假設(shè)陰性比照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性比照溶液B的平行管均為陽(yáng)性，陽(yáng)性比照溶液C的平行管均為陽(yáng)性，試驗(yàn)有效。假設(shè)溶液A的兩個(gè)平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。假設(shè)溶液AA的兩個(gè)平行管A需做4支平行管，假設(shè)全部平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定。假設(shè)供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD而溶液A消滅不符合規(guī)定時(shí)，需將供試品稀釋至MVD重試驗(yàn)，再對(duì)結(jié)果進(jìn)展推斷。EP(8.0) 按鱟試劑標(biāo)示靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下有關(guān)形成含內(nèi)毒素的堅(jiān)實(shí)凝膠的說明進(jìn)展操作，該法可檢查供試品溶液的內(nèi)毒素含量是否超出了內(nèi)毒素限度。方法按表2.6.14-2制備溶液A、B、C、D。試驗(yàn)方法見〔1〕預(yù)備試驗(yàn)的〔i〕鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)。2.6.14-2溶液 內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液A 0/供試品溶液

22λ/供試品溶液 22λ/BET檢查用水 20/BET檢查用水 2制備溶液〔供試品陽(yáng)性比照，稀釋倍數(shù)不得超過MV。依據(jù)〕預(yù)備試驗(yàn)〔i〕〔陽(yáng)性比照〕所含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的濃度為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的兩倍。溶液D〔陰性比照〕為BET結(jié)果推斷只有溶液BCDA如溶液的平行管的檢查結(jié)果均為陽(yáng)性時(shí)：如供試品的稀釋倍數(shù)為MVD，供試品不符合規(guī)定。如供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD，應(yīng)將供試品溶液稀釋至較大但不超過MVD的倍數(shù)，再次開展試驗(yàn)。假設(shè)溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽(yáng)性，另一管為陰性，需進(jìn)展復(fù)試。如復(fù)試中，溶液A的兩個(gè)平行管均呈陰性，可將供試品判為符合內(nèi)毒素限度要求。USP(36) 方法——按表2制備溶液A、B、C、D。按凝膠法預(yù)備試驗(yàn)的LAL試劑標(biāo)示靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。以該四種溶液為一組試驗(yàn)的供試品，每組試驗(yàn)做兩組平行。2凝膠限量試驗(yàn)溶液的制備溶液內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A0/供試品溶液2B2λ/供試品溶液2C2λ/LAL2D無/LAL試劑用水2用稀釋倍數(shù)不超過MVD的稀釋液制備溶液A和供試品陽(yáng)性比照品；制備方法見凝膠法預(yù)備試驗(yàn)的干擾試驗(yàn)項(xiàng)。陽(yáng)性比照溶液B和C含有內(nèi)毒素LALDLAL結(jié)果推斷——只有陽(yáng)性比照溶液B和C的平行管的試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性、陰性比照溶液D的平行管的試驗(yàn)結(jié)果均為陰性時(shí)，試驗(yàn)方有效。溶液AA供試品不合格。假設(shè)溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽(yáng)性，另一管為陰性，需進(jìn)展復(fù)試。如復(fù)試中，溶液A的兩個(gè)平行管均呈陰性，可將供試品判為符合內(nèi)毒素限度要求。假設(shè)供試品溶液再小于MVD的稀釋倍數(shù)下得到的試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，應(yīng)將供試品溶液以更大的但不超過MVD的倍數(shù)進(jìn)展稀釋，再次開展試驗(yàn)。JP(16)按鱟試劑標(biāo)示靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下有關(guān)形成含內(nèi)毒素的堅(jiān)實(shí)凝膠的說明進(jìn)展操作，該法可檢查供試品溶液的內(nèi)毒素含量是否超出了內(nèi)毒素限度。方法按表2制備溶液A、B、C、D。以該四種溶液為一組試驗(yàn)的供試品，每組試驗(yàn)做兩組平行。依據(jù)〕預(yù)備試驗(yàn)項(xiàng)下的i〕干擾因素試驗(yàn)的說明制取溶液A和。孵育溫度、孵育時(shí)間和形成凝膠確實(shí)認(rèn)方法見〕預(yù)備試驗(yàn)的鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)。2溶液內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A0/供試品溶液2B2λ/供試品溶液2C2λ/BET2D0/BET2結(jié)果推斷只有溶液BCDA假設(shè)溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽(yáng)性，另一管為陰性，需進(jìn)展復(fù)試。如復(fù)試中，溶液A的兩個(gè)平行管均呈陰性，可將供試品判為符合內(nèi)毒素限度要求。以MVD稀釋的溶液A的兩個(gè)平行管均為陽(yáng)性時(shí)，供試品不符合內(nèi)毒素限度要求。假設(shè)供試品溶液再小于MVD的稀釋倍數(shù)下得到的試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，應(yīng)將供試品溶液以MVD凝膠半定量試驗(yàn)CP(2015) 本方法系通過確定反響終點(diǎn)濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。按表3制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。結(jié)果推斷假設(shè)陰性比照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性比照溶液B的平行管均為陽(yáng)性，系列溶液C的反響終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.5-2λ，試驗(yàn)有效。系列溶液A中每一系列的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以λ，為每個(gè)系列的反響終點(diǎn)濃度。假設(shè)檢驗(yàn)的是經(jīng)稀釋的供試品，則將終點(diǎn)濃度乘以供試品進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)，即得到每一系列內(nèi)毒素濃度c。式CE=antilg(∑c/2)]。假設(shè)試驗(yàn)中供試品溶液的全部平行管均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ(假設(shè)檢驗(yàn)的是稀釋過的供試品，則記為小于λ乘以供試品進(jìn)展半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)〕。假設(shè)任何系列內(nèi)毒素濃度不小于規(guī)定的限值時(shí)，則判定供試品不符合規(guī)定。當(dāng)供試品溶液的全部平行管均為陽(yáng)性，可記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ。表3凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)A內(nèi)毒素濃度/被參加內(nèi)毒素的溶液無/供試品溶液稀釋用液檢查用水稀釋倍數(shù)1所含內(nèi)毒素的濃度－平行管數(shù)22-24-28-2B2λ/供試品溶液－12λ2C2λ/檢查用水檢查用水12λ22λ240.5λ280.25λ2D無/檢查用水－－－2注：A為不超過MVD1倍、2倍、4倍和8倍，最終的稀釋倍數(shù)不得超過MVD。B為2λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A(供試品陽(yáng)性比照)。C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的比照系列。D為陰性比照。EP(8.0) 〔i〕 方法通過將供試品滴定至反響終點(diǎn)，對(duì)供試品所含的細(xì)菌內(nèi)毒素定量。按表2.6.14-3制備溶液A、B、C、D。以該四種溶液為一組試驗(yàn)的供試品，每組試驗(yàn)做兩組平行。具體試驗(yàn)操作見〔1〕預(yù)備試驗(yàn)的〔i〕鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)。2.6.14-3溶液A內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液無/供試品溶液稀釋劑BET稀釋倍數(shù)1稀釋后內(nèi)毒素的濃度－平行管數(shù)22-24-28-2B2λ/供試品溶液－12λ2C2λ/BETBET12λ221λ240.5λ280.25λ2D無/BET－－－2AMVDBET1248最終的稀釋倍數(shù)不得超過MVD。溶液B=2λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A〔供試品陽(yáng)性比照〕溶液C=含有2λ、λ、0.5λ0.25λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的BETD=BET〔陰性比照〕〔ii〕 計(jì)算和結(jié)果推斷符合以下三個(gè)條件時(shí)，可將試驗(yàn)判為有效：溶液D〔陰性比照〕的兩組平行管均顯陰性，溶液B〔供試品陽(yáng)性比照〕的兩個(gè)平行管均顯陽(yáng)性，溶液C0.5λ—2λ之間。測(cè)定溶液A的內(nèi)毒素濃度，計(jì)算溶液A的系列稀釋液的終點(diǎn)濃度時(shí)，應(yīng)將內(nèi)毒素濃度記為終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以λ?！病?〕〔i〕鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下的公式。照試驗(yàn)使用的是供試品的稀釋液，計(jì)算時(shí)，將檢查結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，即得到原始溶液的內(nèi)毒素濃度。如在有效的試驗(yàn)中，供試品的檢查結(jié)果均顯陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ〔照試驗(yàn)使用的是供試品的稀釋液，檢查結(jié)果應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ乘以供試品的最小稀釋倍數(shù)。如供試品的全部結(jié)果均為陽(yáng)性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ〔如，在表2.6.14-3×λ。如內(nèi)毒素的濃度小于其專論中的規(guī)定濃度，可判定供試品符合檢查要求。USP(36) 通過確定反響終點(diǎn)濃度，測(cè)定供試品的內(nèi)毒素的含量。按表3制備溶液A、B、C、D。按凝膠法的預(yù)備試驗(yàn)項(xiàng)下的LAL試劑標(biāo)示靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下的說明操作。3凝膠定量試驗(yàn)溶液的制備溶液A內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液無/供試品溶液稀釋劑BET稀釋倍數(shù)*1稀釋后內(nèi)毒素的濃度－平行管數(shù)22-24-28-2B2λ/供試品溶液－12λ2C2λ/LALBET12λ221λ240.5λ280.25λ2D無/LAL－－－2A：不超過MVDLAL1248這些溶液的最終的稀釋倍數(shù)也不得超過MVD。也可選用其它適宜的溶液。溶液B：2λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A〔供試品陽(yáng)性比照。C：以LAL2λ、1λ、0.5λ0.25λ的兩組〔4〕比照系列。D：LAL〔陰性比照。計(jì)算和結(jié)果推斷：符合以下三個(gè)條件時(shí)，可將試驗(yàn)判為有效〕陰性比照溶液D的兩組平行管均顯陰性〔〕供試品陽(yáng)性比照溶液B兩個(gè)平行管均顯陽(yáng)性〕溶液C的終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.λ-λ之間。系列溶液A中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以λ，為每個(gè)系列的反響終點(diǎn)濃度。全部平行管反響終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度〔計(jì)算公式見凝膠法預(yù)備試驗(yàn)的LAL試劑標(biāo)示靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)。假設(shè)檢驗(yàn)時(shí)承受的是供試品溶液的稀釋液，則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)，要將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。如試驗(yàn)中供試品溶液的全部平行管均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ〔假設(shè)檢驗(yàn)的是稀釋過的供試品，則記為小于λ乘以供試品進(jìn)展定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)λ〔38λ。假設(shè)內(nèi)毒素濃度小于各論中規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。JP(16) 通過將凝膠滴定至反響終點(diǎn)，測(cè)量供試品的內(nèi)毒素終點(diǎn)濃度。〔i〕 方法按表3制備溶液A、B、C、D。以該四種溶液為一組試驗(yàn)的供試品，每組試驗(yàn)做兩組平行。依據(jù)〔1〕預(yù)備試驗(yàn)項(xiàng)下的〔ii〕干擾因素試驗(yàn)的說明制取溶液AB。孵育溫度、孵育時(shí)間和形成凝膠確實(shí)認(rèn)方法見〔1〕預(yù)備試驗(yàn)的〔i〕鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)。3溶液A內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液0/供試品溶液稀釋劑BET稀釋倍數(shù)*1稀釋后內(nèi)毒素的濃度－平行管數(shù)22-24-28-2B2λ/供試品溶液－12λ2C2λ/BETBET12λ221λ240.5λ280.25λ2D0/BET－－－2**可適當(dāng)調(diào)整溶液AMVD?！瞚i〕 計(jì)算和結(jié)果推斷符合以下三個(gè)條件時(shí)，可將試驗(yàn)判為有效a〕陰性比照溶液D的兩組平行管均顯陰性b〕供試品陽(yáng)性比照溶液B〔c〕C0.5λ—2λ之間。反響終點(diǎn)指溶液A的系列稀釋液中最終一管呈陽(yáng)性。計(jì)算溶液A的內(nèi)毒素濃度時(shí)，應(yīng)將內(nèi)毒素濃度記為終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以λ。用〔1〕預(yù)備試驗(yàn)項(xiàng)下的〔i〕鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下的公式計(jì)算兩組平行試驗(yàn)的內(nèi)毒素濃度的幾何平均值。如溶液A的稀釋液均顯陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ乘以溶液A的最小稀釋倍數(shù)。如溶液A的全部稀釋液均呈陽(yáng)性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ。依據(jù)溶液A的內(nèi)毒素濃度的平均值計(jì)算供試品的內(nèi)毒素濃度〔單位為EU/m、EU/m、EU/mE、EU/uni。光度測(cè)定法CP(2015) 光度測(cè)定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。濁度法終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是依據(jù)反響混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)的濁度〔吸光度或透光率〕之間存在的量化關(guān)系來測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反響混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度或透光率所需要的反響時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。顯色基質(zhì)法系利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反響過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。依據(jù)檢測(cè)原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反響混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團(tuán)的量之間存在的量化關(guān)系來測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反響混合物的吸光度或透光率到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的檢測(cè)值所需要的反響時(shí)間，或檢測(cè)值增加速度的方法。光度測(cè)定試驗(yàn)需在特定的儀器中進(jìn)展，溫度一般為37℃±1℃.供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時(shí)間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)說明進(jìn)展。為保證濁度和顯色試驗(yàn)的有效性，應(yīng)預(yù)先進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)曲線的牢靠性試驗(yàn)以及供試品的干擾試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的牢靠性試驗(yàn)當(dāng)使用批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件有任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的轉(zhuǎn)變時(shí)，需進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)曲線的牢靠性試驗(yàn)。用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素制成溶液，制成至少3個(gè)濃度的稀釋液(相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10)，最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測(cè)限。每一稀釋步驟的混勻時(shí)間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時(shí)要求做2支陰性比照，當(dāng)陰性比照的吸光度或透光率小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的檢測(cè)值或反響時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的反響時(shí)間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)展線性回歸分析。依據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r確實(shí)定值應(yīng)大于或等于0.980，試驗(yàn)方為有效。否則須重試驗(yàn)。干擾試驗(yàn)選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度(設(shè)為λm)，作為供試品干擾試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度。按表4A、B、C和D。表4光度測(cè)定法干擾試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度被參加內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液2B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)〔或四周點(diǎn)〕的濃度〔設(shè)為λm〕供試品溶液2C至少3個(gè)濃度〔最低一點(diǎn)設(shè)為λ〕檢查用水每一濃度至少2D無檢查用水2注：A為稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液。B為加人了標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)內(nèi)毒素濃度的，且與溶液A有一樣稀釋倍數(shù)的供試品溶液。C為如“標(biāo)準(zhǔn)曲線的牢靠性試驗(yàn)”項(xiàng)下描述的，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液。D為陰性比照。ct和cs，再按下式計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率(R〕。R=(cs-ct)/λm×100%當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%-200%，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在指定的范圍內(nèi)，須按“凝膠法干擾試驗(yàn)”中的方法去除干擾因素，并重復(fù)干擾試驗(yàn)來驗(yàn)證處理的有效性。當(dāng)鱟試劑、供試品的來源、處方、生產(chǎn)工藝轉(zhuǎn)變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重進(jìn)展干擾試驗(yàn)。檢査法使用系列溶液C生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算溶液A的每一個(gè)平行管的內(nèi)毒素濃度。試驗(yàn)必需符合以下三個(gè)條件方為有效：(1)系列溶液C的結(jié)果要符合“標(biāo)準(zhǔn)曲線的牢靠性試驗(yàn)”中的要求；(2)用溶液B中的內(nèi)毒素濃度減去溶液A中的內(nèi)毒素濃度后，計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%-200%的范圍內(nèi)；(3)陰性比照的檢測(cè)值小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的檢測(cè)值或反響時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的反響時(shí)間。結(jié)果推斷假設(shè)供試品溶液全部平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判定供試品符合規(guī)定。假設(shè)大于或等于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判定供試品不符合規(guī)定。注：本檢査法中，“管”的意思包括其他任何反響容器，如微孔板中的孔。EP(8.0) 〔1〕濁度法本法利用檢測(cè)鱟試液凝膠的濁度變化來測(cè)定供試品中內(nèi)毒素的濃度。依據(jù)檢測(cè)原理，這種方法又可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法〔方法F〕系依據(jù)在孵育終止時(shí)，反響混合物的濁度〔吸光度或透光率〕與內(nèi)毒素濃度之間的量化關(guān)系來測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法〔方法C〕是檢測(cè)反響混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度需要的反響時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。依據(jù)鱟試劑生產(chǎn)商的建議，光度測(cè)定試驗(yàn)應(yīng)在孵育溫度下進(jìn)展〔通常為31℃。顯色法〔方法DE〕該法系利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反響使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素的含量的方法。依據(jù)檢測(cè)原理，這種方法又可分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法〔方法E〕是依據(jù)反響混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團(tuán)的量之間存在的量化關(guān)系來測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法〔方法D〕是檢測(cè)反響混合物的色度到達(dá)某一預(yù)定吸光度〔或透光率〕所需要的反響時(shí)間，或檢測(cè)色度增長(zhǎng)速度的方法。依據(jù)鱟試劑生產(chǎn)商的建議，光度測(cè)定試驗(yàn)應(yīng)在孵育溫度下進(jìn)展〔通常為31℃。預(yù)備試驗(yàn)為確保濁度法和顯色法試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、有效，應(yīng)依據(jù)下面的說明，預(yù)先進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)曲線的牢靠性和干擾因素試驗(yàn)。當(dāng)試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的轉(zhuǎn)變時(shí)，需要驗(yàn)證試驗(yàn)方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的牢靠性試驗(yàn)用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液制成至少三個(gè)濃度的稀釋液，以獵取標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)鱟試劑生產(chǎn)商的建議〔pH等毒素標(biāo)準(zhǔn)濃度的溶液至少做三支平行管。使用動(dòng)態(tài)法檢測(cè)時(shí)，如預(yù)期范圍超過2log，為使標(biāo)準(zhǔn)曲線反映出每個(gè)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，應(yīng)相應(yīng)增加標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在鱟試劑生產(chǎn)商規(guī)定的內(nèi)毒素濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)確實(shí)定值︱r0.980。干擾因素試驗(yàn)選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度。按表2.6.14-4制備溶液A、B、C、D。在鱟試劑生產(chǎn)商的建議測(cè)試條件〔供試品和鱟試液體積、供試品于鱟試液的體積比、孵育時(shí)間等〕下，對(duì)這些溶液開展試驗(yàn)，每種溶液至少做兩組平行。2.6.14-4溶液內(nèi)毒素濃度配制內(nèi)毒素的溶液平行管或微孔數(shù)A無供試品溶液2B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)供試品溶液2C至少3個(gè)濃度〔最低濃度規(guī)定為λ〕BET2D0BET2A=稀釋倍數(shù)不超過MVD溶液B=參加了標(biāo)準(zhǔn)曲線終點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)濃度內(nèi)毒素的、且與溶液A有一樣稀釋倍數(shù)的供試品溶液。溶液C=如“3.預(yù)備試驗(yàn)〔i〕標(biāo)準(zhǔn)曲線的牢靠性試驗(yàn)”項(xiàng)下描述的、用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液。溶D=BET〔陰性比照〕用含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的平均內(nèi)毒素含量減去供試品溶液的平均內(nèi)毒素含量，計(jì)算內(nèi)毒素的平均回收率。50%-200%之間時(shí)，可認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液中不存在干擾因素。當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在指定范圍內(nèi)，應(yīng)依據(jù)凝膠法章節(jié)的“1.預(yù)備試驗(yàn)〔ii〕干擾因素試驗(yàn)”項(xiàng)下的說明排解干擾因素。重復(fù)干擾因素實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證處理的有效性。檢查法方法按3〕預(yù)備試驗(yàn)下的ii〕干擾因素試驗(yàn)”項(xiàng)下操作步驟。計(jì)算用系列溶液C生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液A的每一個(gè)平行管的內(nèi)毒素濃度。試驗(yàn)必需符合以下三個(gè)條件方有效。溶液D〔陰性比照〕的試驗(yàn)結(jié)果不得大于所用鱟試劑的說明書中規(guī)定的空白值的限度。陽(yáng)性比照系列溶液C的檢查結(jié)果要符合“3.預(yù)備試驗(yàn)〔i〕標(biāo)準(zhǔn)曲線的牢靠性試驗(yàn)”中的要求。用溶液B中的內(nèi)毒素濃度減去溶液A中的內(nèi)毒素濃度后，計(jì)算出的回收率在50%-200%的范圍內(nèi)。結(jié)果推斷假設(shè)校正了稀釋倍數(shù)和濃度后，由溶液A的內(nèi)毒素濃度計(jì)算得到的供試品內(nèi)毒素平均濃度小于供試品的內(nèi)毒素限度，可推斷供試品符合細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的要求。試劑鱟試液依據(jù)鱟試劑生產(chǎn)商的建議，用BET鱟試劑鱟試劑系從鱟〔美洲鱟或中華鱟〕的阿米巴細(xì)胞溶解產(chǎn)物制備而來。該試劑僅指在符合有關(guān)權(quán)威法規(guī)的生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的鱟試劑產(chǎn)品。鱟試劑除了能與內(nèi)毒素發(fā)生反響外，也能與某些β-葡聚糖反響。制備不與β-葡聚糖反響的鱟試劑時(shí)，需用鱟變形細(xì)胞溶解物中除去可與β-葡聚糖反響的GGBET〔細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水〕BET檢查用水指注射用水R或由其他方法制取的內(nèi)毒素含量低于所用鱟試劑的檢測(cè)限的水。為供給相關(guān)信息，有下面的章節(jié)。USP(36)濁度法系測(cè)量濁度的增加。依據(jù)檢測(cè)原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是依據(jù)反響混合物中的內(nèi)毒素濃度及其在孵育終止時(shí)的濁度〔吸光度或透光率〕之間存在的定量關(guān)系來測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反響混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反響時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。顯色法系利用檢測(cè)LAL試劑與內(nèi)毒素反響使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素的含量的方法。這種方法也可分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反響混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團(tuán)的量之間存在的定量關(guān)系來測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反響混合物的色度到達(dá)某一預(yù)定吸光度〔或透光率〕所需要的反響時(shí)間，或檢測(cè)色度增長(zhǎng)速度的方法。依據(jù)LAL試劑生產(chǎn)廠家的建議，光度測(cè)定試驗(yàn)的試驗(yàn)溫度一般為37±1℃。光度測(cè)定法的預(yù)備試驗(yàn)為確保濁度法和顯色法試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、有效，應(yīng)依據(jù)下面的說明，預(yù)先進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)曲線的牢靠性和干擾因素試驗(yàn)。如試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的轉(zhuǎn)變時(shí)，必需重進(jìn)展驗(yàn)證。標(biāo)準(zhǔn)曲線的牢靠性試驗(yàn)——用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成至少三個(gè)濃度的稀釋液，以獵取標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)LAL試劑生產(chǎn)廠家的說明〔體積比、pH等，每種標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度至少做三支平行管。如動(dòng)態(tài)法的預(yù)期范圍超過2個(gè)對(duì)數(shù)，為使標(biāo)準(zhǔn)曲線反映出每個(gè)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，應(yīng)相應(yīng)增加標(biāo)準(zhǔn)品溶液。依據(jù)LAL︱必需大于等于0.98。干擾因素試驗(yàn)——選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C、D，每種溶液至少做兩組平行。遵照LAL試劑生產(chǎn)廠家的說明〔供試品和LAL試劑體積、供試品與LAL試劑的體積比、孵育時(shí)間等，對(duì)這些溶液開展試驗(yàn)。4光度測(cè)定法干擾試驗(yàn)溶液的制備溶液 內(nèi)毒素濃度無標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)

供試品溶液供試品溶液

22至少3個(gè)濃度〔最低一點(diǎn)設(shè)為λ〕 LAL試劑用水無 LAL試劑用水

22A：稀釋倍數(shù)不超過MVD溶液B：參加了標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)濃度內(nèi)毒素的、且與溶液A有一樣稀釋倍數(shù)的供試品溶液。溶液C：為“光度測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線牢靠性試驗(yàn)”項(xiàng)下描述的、用于