第二章第二節(jié)基因克隆的載體

第二章第二節(jié)基因克隆的載體第1頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)基因克隆的載體

載體的概念及特點質(zhì)粒載體（plasimidvectors）噬菌體載體（phagevectors）柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvectors）第2頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月引言載體（vector）：能攜帶目的基因進入宿主細(xì)胞進行擴增和表達的工具。作為基因克隆的載體必須具備以下特性：能在寄主細(xì)胞中進行獨立的復(fù)制和表達；具有1-2個選擇標(biāo)記基因，如對抗生素的抗性基因等；具備多克隆位點（MultipleCloneSites，MCS），而且可攜帶外源DNA片段的長度范圍較寬;自身分子量較小，在寄主細(xì)胞中的拷貝數(shù)高，易于操作和DNA的制備。具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移。第3頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月載體的分類根據(jù)載體工作方式的不同可分為質(zhì)粒載體（plasimidvectors）、噬菌體載體（phagevectors）、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體（考斯質(zhì)粒）第4頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的概念：質(zhì)粒是一種廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中獨立于染色體以外的能自主的復(fù)制的裸露的遺傳物質(zhì)。大多數(shù)質(zhì)粒是閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒。一質(zhì)粒載體（plasimidvectors）第5頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月

質(zhì)粒的特點（1）自主復(fù)制性。質(zhì)粒含有自己的復(fù)制起始位點（Origin,簡稱ori），有些質(zhì)粒具有獨立的復(fù)制子結(jié)構(gòu)（Replicon），因此，質(zhì)粒DNA可以自主復(fù)制，形成少則幾個多則成百上千個拷貝。（2）可擴增性。在格蘭氏陰性細(xì)菌中，質(zhì)粒的復(fù)制一般有兩種復(fù)制形式，即嚴(yán)緊型（Stringent）和松弛型（Relaxed）。第6頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的復(fù)制類型：一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。根據(jù)拷貝數(shù)的多少將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒（stringentplasmid）,拷貝數(shù)為1-5；“松弛型”質(zhì)粒（relaxedplasmid）,拷貝數(shù)為6-60。不過，即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間也可能有很大的變化。第7頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月嚴(yán)緊型質(zhì)粒（Stringent）：這類質(zhì)粒的復(fù)制由細(xì)胞內(nèi)DNA聚合酶Ⅲ介導(dǎo)，并被質(zhì)粒上編碼的蛋白因子正調(diào)控，由于這些蛋白因子極不穩(wěn)定使得每個細(xì)胞只能復(fù)制少數(shù)幾個質(zhì)?？截?，一般把一個細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)少于5個的質(zhì)粒稱為嚴(yán)緊型質(zhì)粒。松弛型質(zhì)粒（Relaxed）：這類質(zhì)粒的復(fù)制需要半衰期較長的DNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶及其他復(fù)制輔助蛋白因子，這類質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中一般可達到30~50個拷貝，所以稱為松弛型質(zhì)粒。第8頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的氯霉素擴增：當(dāng)宿主細(xì)胞進入生長后期，加入氯霉素可以抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的生物合成，阻斷宿主菌的大部分代謝途徑，松弛型質(zhì)粒就能利用豐富的原料及能量進行復(fù)制，最終每個細(xì)胞就能累積上千個DNA分子，把這種操作稱為質(zhì)粒的氯霉素擴增。第9頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）可轉(zhuǎn)移性。在移動基因mob、轉(zhuǎn)移基因tra、順式作用元件bom等因子的作用下，許多野生型質(zhì)?？梢酝ㄟ^細(xì)胞的接合（conjugation）作用從一個宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個宿主細(xì)胞中。第10頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）不相容性。具有相同或相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)及特征的兩種不同的質(zhì)粒不能穩(wěn)定的存在于同一個受體細(xì)胞的現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性（incompatibility）。細(xì)胞分裂第11頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月理想質(zhì)粒的改造與構(gòu)建（1）刪除不必要的DNA區(qū)域。盡量縮小質(zhì)粒的相對分子量，以提高外源DNA的裝載量；一般大于20Kb的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率很低而且不穩(wěn)定。（2）滅活某些質(zhì)粒的編碼基因。如滅活編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的mob基因以提高質(zhì)粒的安全性，滅活對質(zhì)粒的復(fù)制產(chǎn)生負(fù)調(diào)控的基因，以提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)。第12頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）加入易于識別的選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因：在基因工程中的一類用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞（菌）的抗性基因，通過在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以篩選得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（菌）。常用的抗生素抗性基因有：Ampr(氨芐青霉素抗性基因)、Kanr(卡那霉素抗性基因)、Tetr(四環(huán)素抗性基因)、Cmr或cat(氯霉素抗性基因)、Neor(新霉素抗性基因)；第13頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月LacZ△M15缺失第11-41位的氨基酸LacZ’N端140個氨基酸LacZ′MCS140個氨基酸+MCSLacZ1024個氨基酸LacZ△M15F質(zhì)粒載體LacZE.coliLacZ△M15+LacZ′X-galLacZ△M15+LacZ′ΩDNAX-gal篩選標(biāo)記基因：α-互補第14頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月

大腸桿菌

-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且釋放出一種藍色物質(zhì)，當(dāng)該酶的

-片段和

-片段分開時就失去了這種顯色的功能。通常將缺失了第11-41位氨基酸的編碼片段的LacZ△M15構(gòu)建在F質(zhì)粒上先轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，而將編碼該酶N端140個氨基酸的

-片段的LacZ′基因插入到載體的多克隆位點的側(cè)翼序列中。當(dāng)含有LacZ′基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時，載體編碼的

-片段就能和寄主編碼的片段發(fā)生互補并具有了對底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被稱為是

-互補（

alpha-complementation）.將這種篩選方式稱為藍白斑篩選）第15頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月藍白斑篩選第16頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）在篩選標(biāo)記基因內(nèi)引入具有多種限制性內(nèi)切酶識別及切割位點，即多克隆位點（MultipleCloneSite,即MCS）,便于外源基因的重組；多克隆位點(MCS)：克隆載體中的一段用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點組成，而且每個限制性內(nèi)切酶位點應(yīng)該在整個載體中是唯一的。（5）根據(jù)外源基因克隆和表達的不同要求，加裝特殊的基因表達調(diào)控元件。第17頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的分類：根據(jù)其功能和用途將人工構(gòu)建的質(zhì)粒分為以下幾類：克隆質(zhì)粒、測序質(zhì)粒、整合質(zhì)粒、穿梭質(zhì)粒、探針質(zhì)粒、表達質(zhì)粒等。第18頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的種類及用途（1）克隆質(zhì)粒。用于克隆和擴增外源基因。第19頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）測序質(zhì)粒。有MCS，并在MCS兩端設(shè)有兩個不同的引物，便于DNA測序。如pUC18/19。第20頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）整合質(zhì)粒。含有整合酶編碼基因及整合特異性的位點序列，克隆在這類質(zhì)粒上的基因在進入宿主細(xì)胞后能準(zhǔn)確的重組整合在受體細(xì)胞染色體基因組的特定位點上。（4）穿梭質(zhì)粒。這類質(zhì)粒含有兩種不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的選擇標(biāo)記性基因，因此能在兩種不同的種屬細(xì)胞中復(fù)制并檢測。如大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒。（5）探針質(zhì)粒。這類載體用來構(gòu)建或篩選克隆基因的表達調(diào)控元件，如啟動子和終止子。第21頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（6）表達質(zhì)粒。這類質(zhì)粒在MCS的上游和下游分別裝有兩套轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動子、合適的核糖體結(jié)合位點（SD-序列）以及強有力的終止子結(jié)構(gòu)使得克隆在合適位點上的任何外源基因均能在受體細(xì)胞中高效表達，如pET系列質(zhì)粒。第22頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第23頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒DNA的提取與純化第24頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌基因組DNA

第25頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月一、質(zhì)粒DNA的提取第26頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.GenomicDNA第27頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會分離，復(fù)性快；（1）原理1.堿裂解法提取質(zhì)粒DNADNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強堿中性第28頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。變性第29頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月堿變性法這種方法是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片段之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。

通過加熱，尤其是在pH值介于12.0～12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，連接DNA互補鏈之間的氫鍵會被斷裂，但由于cccDNA的雙螺旋主鏈骨架的彼此盤繞作用，互補的兩條鏈仍然會緊密地結(jié)合在一起。通過致冷或恢復(fù)中性pH值更會迅速地復(fù)性，復(fù)性迅速而準(zhǔn)確。

線性的染色體DNA分子，在此過程中彼此已經(jīng)分離開來的互補鏈之間的復(fù)性作用就不會那么迅速而準(zhǔn)確。它們聚集形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心分離便會與變性的蛋白質(zhì)及RNA一道沉淀下來。仍然滯留在上清液中的質(zhì)粒cccDNA則可用酒精沉淀法收集。第30頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）

所用的試劑作用①

溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的

-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。②

葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力（震蕩）的作用而降解。第31頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月③EDTAMg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：強堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。

SDS:溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白—SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。

第32頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月用冰醋酸將醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8。用來中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥

乙醇DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。⑤

NaAc-HAc緩沖液第33頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE緩沖液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。

Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。第34頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白變性劑，進一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會殘留在DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。⑨

酚-氯仿選用以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。第35頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的步驟

SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，

RNaseA（5-10mg/L）第36頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月溶液II

破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.4NNaOH，2.0%SDS3M醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至4.8）第37頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月最重要的是：2.影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素菌株的遺傳背景，質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。一般要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如DH5

、JM109、XL1-Blue等。（1）受體菌株endA基因編碼核酸內(nèi)切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可將雙鏈DNA消化成7bp的寡核苷酸片斷。第38頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月這是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。（3）質(zhì)粒大小分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。（2）質(zhì)粒拷貝數(shù)質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定。第39頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月pBR3224363連接加反應(yīng)液TetorAmpTet+AmpCK+2.質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹第40頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的存在形式：有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種。雙螺旋共價閉合環(huán)（超螺旋）covalentlyclosedcircularDNA,

簡稱cccDNA開環(huán)雙螺旋（一個裂口）opencircularDNA,簡稱ocDNA線狀雙螺旋（兩個裂口）linearDNA,簡稱L-DNA第41頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月三種形式的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳中的分離情況第42頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)基因克隆的載體引言（introduction）一質(zhì)粒載體（plasimidvectors）二噬菌體載體（phagevectors）三柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvectors）第43頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月二噬菌體載體（phagevectors）1、噬菌體的生物學(xué)特性2、噬菌體載體3、M13噬菌體的生物學(xué)特性4、M13噬菌體載體第44頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月1.

噬菌體的生物學(xué)特性

ThePhage

consistofalinearchromosomeenclosedinaproteincoat(capsid,衣殼).Whenthephageinfectingthehostcells,itinjectsitsDNAintothehostbacterium.第45頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月1.

噬菌體的生物學(xué)特性

噬菌體的生長周期可分為溶菌周期（Lyticcycle）和溶原周期（Lysogeniccycle）兩種類型。前者指噬菌體將DNA注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。在溶原周期中，注入寄主細(xì)胞的噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分裂而進行復(fù)制。只有溶菌生長周期的噬菌體被稱為烈性噬菌體。只有溶原周期的噬菌體被稱為溫和噬菌體。整合了一套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌被稱為溶原性細(xì)菌。在溶原性細(xì)菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體DNA被稱為原噬菌體。第46頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月溶原周期（Lysogeniccycle）溶菌周期（Lyticcycle）第47頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月1.

噬菌體的生物學(xué)特性

DNA為線狀雙鏈DNA分子，長度為48502bp，在分子兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端。當(dāng)其注入到寄主細(xì)胞中后，可以迅速通過這兩個粘性末端的互補作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。上述通過粘性末端互補形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點（cohesiveendsite）.DNA至少包括61個基因，其中一部分為噬菌體生命活動的必須基因，另一部分可以被外源基因取代而不會影響到噬菌體的正常功能。第48頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體的頭部外殼蛋白對DNA分子的包裝與DNA內(nèi)部的序列無關(guān)，只識別兩個cos位點，同時對包裝的DNA分子的大小有嚴(yán)格的要求：其包裝范圍為DNA總長的75%~105%，即36.4kb~50.9kb.第49頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月2.DNA載體的構(gòu)建（1）縮短野生型

DNA的長度，提高外源DNA的裝載量。即在不影響其體內(nèi)復(fù)制、裂解及包裝功能的前提下盡量縮小其分子長度；（2）刪除重復(fù)的酶切位點，引入單一的酶切位點；（3）滅活一些與裂解周期有關(guān)的基因，使DNA載體只能在特殊的條件下感染裂解宿主菌，以避免可能出現(xiàn)的生物污染；（4）引入合適的選擇標(biāo)記基因，便于重組噬菌體的檢測。第50頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）插入型載體（Insertionvectors

）

selectingrecombinantphageviainsertionalinactivationofthecIgenecI+cI-LysogeniccycleLyticcycleclearplaquescloudyplaques

噬菌體載體的分類及用途第51頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）InsertionvectorsLambdagt10Lambdagt10wasdesignedforthecloningofrelativelyshortDNAfragments,especiallycDNA.ThevectoracceptsEcoRIendedfragmentsupto7.6kb.InsertionoftheDNAinactivatesthelambdarepressor(genei434)resultinginclearplaques.b527isadeletionofpartoftheLambdagenome.A.....Jarestructuralgenes.第52頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）InsertionvectorsLambdagt11Lambdagt11canacceptfragmentsupto7.2kbinlengthinauniqueEcoRIsiteneartheendoftheE.coli

LacZgene.ThisallowsproductionoffusionproteinsfromtheLacpromoter.RecombinantphagecanthenbedistinguishedbydetectionoftheproductoftheclonedDNAusingantibodiesandalsobydetectingtheinactivationoftheLacZgeneonplatescontainingX-Gal/IPTG.nin5isadeletionoftheLambdagenome.第53頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）InsertionvectorsLambdaZAPThisvectorwasdesignedtoconstructcDNAlibraries.Itcanacceptupto10kbofforeignDNAinoneofsixuniquecloningsites.CloninginthesesitesresultsininsertionalinactivationofLacZallowingdetectiononX-Gal/IPTGplates.ItalsoallowsexpressionoftheproteinproductundercontroloftheLacpromoteranddetectionbyspecificantibodies.第54頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月(續(xù)上一頁)ThevectorcontainsthepBluescriptplasmid,allowingstrand-specifictranscriptionofinsertDNA.Amoreimportantfeature,however,isthatthepBluescriptplasmidinsertisflankedononesidebytheinitiatorregionofphagef1promoter,andontheothersidebytheterminatorregionofthef1promoter.ThismeansthatthepBluescriptplasmid,completewithinsert,canbeexcisedandpackagedbysuperinfection(雙重感染)withphagef1.ThiscanthenbetransferredtoasuitablehostE.colistrainwheretheplasmidismaintainedandcanbeusedforsequencing.This"automaticsubcloning"greatlyspeedsuptheacquisitionofasequencefromacloneinagenelibrary.第55頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）取代型載體（Replacementvectors）第56頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月2.

噬菌體載體（2）取代型載體（Replacementvectors）

AnotherapproachtotheconstructionofvectorsfromphageLambdaistocutoutaportionoftheDNAbyvirtueof

（依靠）apairofrestrictionsites.The49kbLambdagenomecanlose40%ofitscontentwhichcanbereplacedbyforeignDNA.Thismeansthatinsertsofupto20-25kbcanbecloned.Thesevectorsareparticularlyusefulformakinggenelibrariesfrommammaliansources.

第57頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月

Whensuchavectoriscutbyarestrictionendonuclease,a"stuffer"fragmentisremoved,leavingrightandleftarms.ThestufferisusuallyremovedbyalcoholprecipitationandthearmsattachedtoaforeignDNAinsertpreparedusingthesamerestrictionendonuclease.

LambdaDNAhascohesiveends.Thesecanattachtoeachothertoformthecossiteofaconcatomer.

Thispolymericmoleculecanthenbepackagedintophageusinganinvitropackagingsystem.Inordertobepackaged,thedistancebetweenthecossitesmustbegreaterthan40kbandlessthan52kb.續(xù)前一頁第58頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）（Replacementvectors）EMBL3and4LambdaEMBLvectorsareusefulforcloninginsertsfrom9to23kbinlength.Polylinkersarepresenteithersideofthestufferfragment.TheorderofthecloningsitesinthepolylinkerinEMBL3isreversedinEMBL4.Doubledigestionofthevectorwith,inthecaseofEMBL3,EcoRIandBamHIpreventsthere-associationofthestufferfragment(carryingEcoRIends)withthearms(carryingBamHIends).第59頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月二噬菌體載體（phagevectors）1、噬菌體的生物學(xué)特性2、噬菌體載體3、M13噬菌體的生物學(xué)特性4、M13噬菌體載體第60頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月3.M13噬菌體的生物學(xué)特性

M13是線狀的大腸桿菌噬菌體，顆粒內(nèi)含有6047個核苷酸的閉合環(huán)狀單鏈DNA基因組，其單鏈的基因組DNA經(jīng)改造后可作為單鏈的DNA載體。因為M13單鏈DNA的復(fù)制型（RF，replicativeform）是呈雙鏈環(huán)形，此時的DNA可以象質(zhì)粒DNA一樣進行提取和體外操作。不論是雙鏈還是單鏈的M13DNA均能感染寄主細(xì)胞。而且M13的顆粒不受包裝的限制，根據(jù)DNA的多寡其噬菌體的顆?？纱罂尚?。

M13噬菌體將DNA正鏈注入寄主細(xì)胞后與單鏈DN A結(jié)合蛋白結(jié)合，隨后以小RNA鏈為引物合成負(fù)鏈而轉(zhuǎn)變成RF。第61頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月

正鏈和負(fù)鏈出現(xiàn)不對稱性積累：當(dāng)RF積累到100-200個拷貝后，噬菌體DNA編碼的正鏈特異結(jié)合蛋白很快就阻止了負(fù)鏈的進一步生成，但以負(fù)鏈為模板的正鏈合成并未受到影響。大量游離的正鏈DNA很快參入到外殼蛋白中形成大量新的噬菌體顆粒。新組裝的噬菌體顆粒并不會發(fā)生溶菌現(xiàn)象，只是從寄主細(xì)胞中擠壓出去。但噬菌體的大量繁殖也干擾了寄主細(xì)菌的正常生長，所以仍可產(chǎn)生模糊的噬菌斑。在M13基因組中有一段507bp的基因間隔區(qū)，該區(qū)可以接受外源DNA的插入而不會影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用于單鏈DNA載體的重要前提。3.M13噬菌體的生物學(xué)特性第62頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月3.M13噬菌體的生物學(xué)特性＋－SSRF1-1′RFRF1-20′RFSS～20′以上ThetypicallifecycleofM13第63頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月二噬菌體載體（phagevectors）1、噬菌體的生物學(xué)特性2、噬菌體載體3、M13噬菌體的生物學(xué)特性4、M13噬菌體載體第64頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月4.M13噬菌體載體

后表現(xiàn)不穩(wěn)定，在噬菌體增殖過程中容易發(fā)生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之內(nèi)，克隆300-400bp的片段十分穩(wěn)定。載體中含有LacZ基因及位于其中的多克隆位點，所以能通過互補在X-Gal/IPTG平板上識別重組體。這類載體包括了

M13mp8、9和M13mp18、19等。

這類載體的突出優(yōu)點在于其既可以提供單鏈DNA，也可以提供雙鏈的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段第65頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)基因克隆的載體引言（introduction）一質(zhì)粒載體（plasimidvectors）二噬菌體載體（phagevectors）三柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvectors）

第66頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月三柯斯質(zhì)粒載