紫外-可見分光光度法培訓(xùn)

紫外-可見分光廣度法第一節(jié)紫外-可見分光廣度法概述紫外-可見分光廣度法：是通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)的特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。236光譜：光被色散后形成的景象，如彩虹。每一種顏色為單色光。光有互補(bǔ)性：紅—綠；黃--藍(lán)；如高錳酸鉀、硫酸銅的顏色。物質(zhì)的顏色:即物質(zhì)的顏色是它所吸收光的互補(bǔ)色。第一節(jié)光的幾個(gè)物理常數(shù)237波長：指從一個(gè)波峰頂?shù)较乱粋€(gè)波峰頂?shù)木嚯x。1nm=10-9m。頻率：每秒鐘發(fā)出的波的數(shù)目。光速：光在真空中的傳播速度2.9979*10-10cm秒。光的純度：?jiǎn)紊?，指某單色光的波長區(qū)間的范圍。寬度越窄越好。第一節(jié)紫外-可見分光廣度法特點(diǎn)448常用波長的范圍：紫外區(qū)：200-400nm；可見區(qū)：400-760nm紅外區(qū)：2.5-25um涉及儀器；紫外分光光度計(jì)、可見分光光度計(jì)、紅外分光光度計(jì)或原子吸收分光光度計(jì)。特點(diǎn)：靈敏度較高，一般可達(dá)10－4～10－6g/ml,最低可測(cè)濃度一些情況下10－7g/ml。準(zhǔn)確度一般為0.5％，好儀器可達(dá)0.2％。第一節(jié)紫外-可見分光廣度法基本原理4481、原理：紫外可見吸收光譜由分子中價(jià)電子在不同分子軌道之間躍遷而產(chǎn)生的。有單鍵σ電子、雙鍵π電子和非成鍵n電子。軌道不同，電子所具有能量不同。2、有機(jī)化合物吸收光譜：σ→σ*躍遷、n→σ*躍遷、π→π*躍遷、n→π*躍遷和電荷遷移躍遷產(chǎn)生。3、無機(jī)化合物吸收光譜：電荷遷移躍遷及配位場(chǎng)躍遷?；靖拍睿?）生色團(tuán)（chromophore）：能在紫外-可見光范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收的原子團(tuán)。例：—CH＝、CH—；—C＝O；—N＝N—

2）助色團(tuán)（auxochrome)：是指含有非鍵電子的雜原子的飽和基團(tuán)，當(dāng)它們與生色團(tuán)飽和烴相連時(shí)，能使吸收峰位置向長波方向的移動(dòng)，并使吸收強(qiáng)度增大。例：—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X（3）吸收帶（absorptionband）：說明吸收峰在紫外－可見光譜中的位置。吸收位置取決于分子中生色團(tuán)和助色團(tuán)位置。以及共軛情況。并受溶劑效應(yīng)和PH影響。吸收帶可推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)。第一節(jié)Lamber-Beer定律449

（一）吸收光譜法基本定律描述物質(zhì)對(duì)單色光吸收強(qiáng)弱與吸光物質(zhì)液層厚度和濃度的關(guān)系假設(shè)一束平行單色光通過一個(gè)吸光物體

續(xù)前吸收度與濃度成簡(jiǎn)單正比關(guān)系透光率與濃度成指數(shù)函數(shù)關(guān)系濃度增大一倍，吸收度增大一倍，透光率從T降至T22．吸光系數(shù)兩種表示法：4501）摩爾吸光系數(shù)ε：在一定λ下，C=1mol/L，L=1cm時(shí)的吸光度2）百分吸光系數(shù)/比吸光系數(shù)：在一定λ下，C=1g/100ml，L=1cm時(shí)的吸光度3）兩者關(guān)系在同一波長下，各組分吸光度具有加和性第二節(jié)紫外－可見分光光度計(jì)451紫外-可見分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)是由五個(gè)部分組成：即光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和顯示器信號(hào)指示系統(tǒng)。一、主要部件1．光源：2．單色器：包括狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件棱鏡——對(duì)不同波長的光折射率不同色散元件分出光波長不等距（長波長密）光柵——衍射和干涉分出光波長等距鎢燈或鹵鎢燈——可見光源350~1000nm氫燈或氘燈——紫外光源150~400nm單色器是能從光源輻射的復(fù)合光中分出單色光的光學(xué)裝置，其主要功能：產(chǎn)生光譜純度高的波長且波長在紫外可見區(qū)域內(nèi)任意可調(diào)。續(xù)前3．吸收池：為減少光的損失，吸收池的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向。光學(xué)玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)熔融石英——不能吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)要求：匹配性（T0.3%（對(duì)光的吸收和反射應(yīng)一致）4．檢測(cè)器：將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)的裝置5．記錄裝置：訊號(hào)處理和顯示系統(tǒng)光電池光電管光電倍增管二極管陣列檢測(cè)器光源

對(duì)光源的基本要求是應(yīng)在儀器操作所需的光譜區(qū)域內(nèi)能夠發(fā)射連續(xù)輻射，有足夠的輻射強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性，而且輻射能量隨波長的變化應(yīng)盡可能小。分光光度計(jì)中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢絲燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。鎢燈和鹵鎢燈可使用的范圍在350~2500nm。這類光源的輻射能量與施加的外加電壓有關(guān)，在近紫外區(qū)測(cè)定時(shí)常用氫燈和氘燈。它們可在200~400nm范圍內(nèi)產(chǎn)生連續(xù)光源。氘燈的燈管內(nèi)充有氫的同位素氘，它是紫外光區(qū)應(yīng)用最廣泛的一種光源，其光譜分布與氫燈類似，但光強(qiáng)度比相同功率的氫燈要大3~5倍。圖示光柵是利用光的衍射與干涉作用制成的，它可用于紫外、可見及紅外光域，而且在整個(gè)波長區(qū)具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。它具有色散波長范圍寬、分辨本領(lǐng)高、成本低、便于保存和易于制備等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是各級(jí)光譜會(huì)重疊而產(chǎn)生干擾。

二、分光光度儀的類型：

1．單光束分光光度計(jì)：

特點(diǎn)：使用時(shí)來回拉動(dòng)吸收池

→移動(dòng)誤差對(duì)光源要求高比色池配對(duì)在測(cè)量樣品前，利用機(jī)械裝置分別將樣品池置入光路，利用電路的補(bǔ)償裝置將吸收度調(diào)零；然后將樣品溶液置入光路，讀出樣品溶液的吸收度。具有較高的信噪比，光學(xué)、機(jī)械及電子線路結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜。續(xù)前2．雙光束分光光度計(jì)：

特點(diǎn)：不用拉動(dòng)吸收池，可以減小移動(dòng)誤差對(duì)光源要求不高可以自動(dòng)掃描吸收光譜

缺點(diǎn)：儀器光路設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格，價(jià)格較貴（三）儀器的校正1.波長的準(zhǔn)確度

通常由于環(huán)境因素對(duì)機(jī)械部分的影響,儀器的波長會(huì)變化,使用過一段時(shí)間后都要校正測(cè)定波長(允差范圍:紫外區(qū):+1.0nm,500nm處+2.0nm,700nm處+4.8nm).建議采用下述的較為簡(jiǎn)便和實(shí)用的方法來進(jìn)行校正：低壓汞燈檢定//氘燈486.02nm及656.10nm譜線進(jìn)行檢定//氧化鈥玻璃檢定及高氯酸鈥溶液檢定。2.吸收度的校正：重鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)溶液來校正吸光度。3.雜散光檢查：截止法，用濾色片或一定濃度的溶液測(cè)定其透光率(碘化鉀和亞硝酸鈉)第三節(jié)應(yīng)用239一、定性分析二、定量分析

定性鑒別純度檢查和雜質(zhì)限量測(cè)定單組分的定量方法多組分的定量方法一、定性分析（一）定性鑒別定性鑒別的依據(jù)→吸收光譜的特征吸收光譜的形狀吸收峰的數(shù)目吸收峰的位置（波長）吸收峰的強(qiáng)度相應(yīng)的吸光系數(shù)吸收光譜（吸收曲線）：

以吸光度A為縱坐標(biāo)，波長λ為橫坐標(biāo)，繪制的λ~A曲線。特征：峰曲線上比左右相鄰處都高的一處；

max吸收程度最大所對(duì)應(yīng)的

（曲線最大峰處的

）谷曲線上比左右相鄰處都低的一處；

min最低谷所對(duì)應(yīng)的

；肩峰sh介于峰與谷之間，形狀像肩的弱吸收峰；

末端吸收在吸收光譜短波長端所呈現(xiàn)的強(qiáng)吸收而不呈峰形的部分。續(xù)前1．對(duì)比吸收光譜的一致性239同一測(cè)定條件下，波長和濃度一樣,與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物譜圖或標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對(duì)照比較2．對(duì)比吸收光譜的特征值：比較最大吸收及吸收系數(shù)的一致性。續(xù)前3．對(duì)比吸光度或吸光系數(shù)的比值的一致性：例：藥典中采用此法鑒別不同的化合物：化合物中不只一個(gè)吸收峰，可在不同吸收峰處（或峰與谷）測(cè)得吸收度的比值。不受濃度和厚度的影響，所比較的是物質(zhì)的特性。續(xù)前（二）純度檢查和雜質(zhì)限量測(cè)定1．純度檢查（雜質(zhì)檢查）1）峰位不重疊：

找λ→使主成分無吸收，雜質(zhì)有吸收→直接考察雜質(zhì)含量如乙醇和環(huán)己烷中含少量苯，苯在256nm處有吸收，而乙醇和環(huán)己烷在此波長無吸收。（0.001％）2）峰位重疊：

主成分強(qiáng)吸收，雜質(zhì)無吸收/弱吸收→與純品比較，E↓雜質(zhì)強(qiáng)吸收>>主成分吸收→與純品比較，E↑，光譜變形續(xù)前2．雜質(zhì)限量的測(cè)定：例：腎上腺素中微量雜質(zhì)——腎上腺酮含量計(jì)算

2mg/mL-0.05mol/L的HCL溶液，λ＝310nm下測(cè)定規(guī)定A310≤0.05(在310nm處的百分吸光系數(shù)為435)

即符合要求的雜質(zhì)限量≤0.06%例子：用峰谷吸收度比值控制雜質(zhì)的限量碘解磷定雜質(zhì)有：順式異構(gòu)體、中間體等，在碘解磷定最大吸收波長294nm處無吸收，但在其吸收谷262nm處有吸收,利用峰谷吸收度比值作為雜志的限量檢查。純品碘解磷定A294/A262=3.39如有雜質(zhì)，其值小于3.39，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定吸收度比值應(yīng)在3.31～3.39范圍內(nèi)。二、定量分析（一）單組分的定量方法1．吸光系數(shù)法2．標(biāo)準(zhǔn)曲線法3．對(duì)照法：外標(biāo)一點(diǎn)法續(xù)前1．吸光系數(shù)法:在規(guī)定波長處測(cè)定吸光度,再用吸收系數(shù)進(jìn)行計(jì)算.(通常大于100)練習(xí)例：維生素B12

的水溶液在361nm處的百分吸光系數(shù)為207，用1cm比色池測(cè)得某維生素B12溶液的吸光度是0.414，求該溶液的濃度（見書P209例1）解：練習(xí)例2：精密稱取B12樣品25.0mg，用水