體外試驗(yàn)與生物新技術(shù)

第十二章體外試驗(yàn)與生物新技術(shù)在毒理學(xué)中的應(yīng)用體外試驗(yàn)毒性試驗(yàn)的目的在于獲取一定的數(shù)據(jù)，為社會(huì)需要的外源化學(xué)物的安全使用做出判斷。過去利用整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型或稱體內(nèi)試驗(yàn)(invivotest)模型所提供的資料，判斷外源化學(xué)物及其制品和混合物等對(duì)人類健康是否具有損害作用。體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?invitrotest)在上述過程中也起著重要的作用，尤其是機(jī)理研究方面。但是，在毒理學(xué)研究中整體試驗(yàn)研究的觀點(diǎn)仍占主導(dǎo)地位。目前，此種觀點(diǎn)已發(fā)生變化，因?yàn)椋孩偃澜缑磕昙s有千種以上的新化合物作為商品進(jìn)入人類的環(huán)境。而且在現(xiàn)有的化合物中，還有相當(dāng)數(shù)量沒有進(jìn)行必要的毒理學(xué)評(píng)價(jià)。在此種情況下，利用經(jīng)典的整體動(dòng)物試驗(yàn)取得完整的毒理學(xué)資料極為困難。解決此種問題的重要方向是體外試驗(yàn)。②現(xiàn)有的整體動(dòng)物毒性試驗(yàn)方法需消耗大量的時(shí)間和昂貴的經(jīng)費(fèi)，而體外試驗(yàn)則可節(jié)省時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。③動(dòng)物保護(hù)主義運(yùn)動(dòng)的興起，要求盡量減少動(dòng)物的使用，而且應(yīng)當(dāng)盡量減少痛苦地處理動(dòng)物。④更重要的是由于生物技術(shù)的巨大進(jìn)步，不僅表現(xiàn)在細(xì)胞組織及器官培養(yǎng)領(lǐng)域，而且在生物分子技術(shù)方面，也為毒性試驗(yàn)和研究提供了新的方法和工具。所以體外試驗(yàn)在毒理學(xué)研究中所占的地位日趨重要，甚至有占主導(dǎo)地位的趨勢(shì)。但也需指出，體外試驗(yàn)的發(fā)展，并不排斥體內(nèi)試驗(yàn)本身的重要性，兩者必須相互補(bǔ)充、相互驗(yàn)證才能為毒理學(xué)研究提供堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)。一、概述(一)分類毒性試驗(yàn)的目的是提供一些適當(dāng)?shù)馁Y料，以便確定有關(guān)化學(xué)物的毒理學(xué)性質(zhì)。在有些情況下，是要決定一種化學(xué)物在所預(yù)期的條件下使用是否安全，如新藥物開發(fā)即需要這一評(píng)價(jià)。在有些情況下，例如新工業(yè)品或日用化學(xué)品的開發(fā)，必須決定一種新化學(xué)物的接觸安全限量。了解體外毒性試驗(yàn)在上述毒理學(xué)決策過程中有何意義，對(duì)于評(píng)價(jià)體外毒性試驗(yàn)在毒理學(xué)中的地位極有幫助。可依據(jù)體外試驗(yàn)在決策過程中所起的作用將其分為3類：①篩選試驗(yàn)。它僅提供決策過程的最初的資料，還需要進(jìn)行更權(quán)威的試驗(yàn)，無論是整體還是體外試驗(yàn)。②附加試驗(yàn)。它可為協(xié)作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料，如機(jī)理的研究，但僅有它是不夠充分的。③替代試驗(yàn)。它是在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使體外毒性試驗(yàn)?zāi)芴娲w動(dòng)物試驗(yàn)，以提供更多的信息。(二)基本原理體外試驗(yàn)的基本原理是所觀察到的毒理學(xué)效應(yīng)均是毒物和／或反應(yīng)活性代謝產(chǎn)物在敏感性細(xì)胞上或敏感細(xì)胞內(nèi)某一分子靶部位作用的結(jié)果。如將敏感細(xì)胞或某分子靶部位例如酶，在體外條件下，維持其正常的生理功能，并觀察外源化學(xué)物對(duì)其的影響，即將毒理學(xué)中毒物中毒的啟動(dòng)階段，在體外條件下，觀察其對(duì)外源化合物的反應(yīng)和外源化學(xué)物對(duì)它的作用?；谏鲜鲈恚w外試驗(yàn)?zāi)Ｐ腿〔姆秶軐?，可取哺乳?dòng)物的離體臟器灌流、臟器切片溫育、細(xì)胞培養(yǎng)、亞細(xì)胞器組份以及提純的某些酶分子或DNA分子等等。(三)體外試驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)體外毒性試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)可歸納在表12—1。表12-1體外毒性試驗(yàn)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)能控制環(huán)境因素可排除相互作用的系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細(xì)胞，細(xì)胞器等(七)酶外源化學(xué)物對(duì)機(jī)體的毒性效應(yīng)，往往表現(xiàn)某種或某些酶的活性變化上，即可以利用標(biāo)志酶活性的變化反映化學(xué)物所損傷的靶器官。在體外毒理學(xué)中則主要是定量研究外源化學(xué)物對(duì)靶酶作用的特征、性質(zhì)和機(jī)理。此類研究的基礎(chǔ)工作是純化酶，如獲得純化酶，可在體外精確地控制各種因素，對(duì)純化酶作用的體征、性質(zhì)和機(jī)理進(jìn)行研究，如細(xì)胞色素P-450重組系統(tǒng)。由于酶的提純技術(shù)復(fù)雜，故而在一般毒理學(xué)研究中多用臟器勻漿和亞細(xì)胞組分作為酶源。雖然這些酶源標(biāo)本含有多酶成分，但是只要測(cè)定酶活性的條件適宜，完全可以得到良好的結(jié)果。有報(bào)道金屬離子Cd2+、Hg2+、Pb2+對(duì)一些鈣調(diào)素依賴酶就具有雙向效應(yīng)，即在低濃度時(shí)可以激活這些酶，而高濃度時(shí)又可抑制酶的活性。文獻(xiàn)中早已證明有機(jī)磷化合物的主要靶酶是AChE。經(jīng)酶動(dòng)力學(xué)分析，有機(jī)磷化合物與AChE底物ACh呈競(jìng)爭(zhēng)性；即有機(jī)磷化合物對(duì)AChE為競(jìng)爭(zhēng)性的不可逆性抑制物。但是不同結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷化合物對(duì)AChE的親合力可有很大差別。哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備和培養(yǎng)一、概述到目前為止，分離的細(xì)胞是毒理學(xué)中使用最廣泛和最深入的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。體外系統(tǒng)分離的細(xì)胞包括懸浮液中的新鮮游離細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞株、細(xì)胞系及復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞。在毒理學(xué)中以哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的替代系統(tǒng)日漸廣泛，造成這種趨勢(shì)的原因有三：一是來自公眾要求減少實(shí)驗(yàn)中使用動(dòng)物數(shù)量的壓力；二是非整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可顯著地減少常規(guī)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需的高額費(fèi)用；三是人們?cè)絹碓讲粷M意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體結(jié)果之間相關(guān)性的缺乏。利用細(xì)胞，可更嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，有效地研究毒性作用的生化機(jī)理。表12-2詳細(xì)列出細(xì)胞在毒理學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)缺點(diǎn)。表12-2體外系統(tǒng)——細(xì)胞在毒理學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)、缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)改善效率，減少費(fèi)用使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較少僅需少量的受試物較大程度控制細(xì)胞族的性狀直接控制胞外基質(zhì)、化學(xué)物濃度及接觸時(shí)間排除可能的混淆因素如激素；神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的影響可從同一實(shí)驗(yàn)體系重復(fù)取樣缺點(diǎn)缺少整個(gè)器官的形態(tài)學(xué)觀察選擇性喪失整體器官特異性功能，如毒性代謝酶的喪失缺乏可能的調(diào)節(jié)影響因素如激素，神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)，一般為靜態(tài)系統(tǒng)，將導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少和代謝終產(chǎn)物的逐漸累積。多為短期試驗(yàn)，對(duì)亞慢性或慢性毒性的評(píng)估價(jià)值不大表12-3毒理學(xué)研究中常用細(xì)胞各種物種的成纖維細(xì)胞淋巴母細(xì)胞腹水瘤細(xì)胞淋巴細(xì)胞角質(zhì)細(xì)胞肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞腎臟髓質(zhì)和皮質(zhì)細(xì)胞肺的各種類型細(xì)胞培養(yǎng)的背根膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的睪丸細(xì)胞膀胱細(xì)胞心臟細(xì)胞脊髓微血管細(xì)胞脂肪細(xì)胞由于哺乳細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的優(yōu)越性，在毒理學(xué)中，已有許多不同類型細(xì)胞應(yīng)用于毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。表12-3為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的細(xì)胞類型，其中有些細(xì)胞可來源于人體組織。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行毒理學(xué)體外實(shí)驗(yàn)有兩種方法：一是建立正在迅速生長的細(xì)胞株，用以觀察受試物對(duì)整體細(xì)胞的一般毒作用和正在分裂組織的毒作用；二是利用已高度分化的細(xì)胞，無論是原代培養(yǎng)或是特定的細(xì)胞株，研究受試物對(duì)已分化成熟的細(xì)胞或其功能的特殊毒作用；二、基本技術(shù)儀器與設(shè)備1.培養(yǎng)箱一般來說，在5％CO2，95％空氣和99％的相對(duì)濕度的條件下，許多細(xì)胞可存活。故細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵設(shè)備是CO2培養(yǎng)箱。其基本要求：①精確地溫度控制調(diào)節(jié)，一般在土0.5℃，箱內(nèi)溫度的均衡可依賴風(fēng)扇；②CO2濃度調(diào)節(jié)，利用CO2傳感器監(jiān)測(cè)箱內(nèi)CO2濃度；使箱內(nèi)大氣為5％CO2，95％空氣；③箱內(nèi)濕度，可用水盤來維持。有的細(xì)胞培養(yǎng)可以不控制CO2分壓。例如，原代肝細(xì)胞培養(yǎng)，可用LeibovitzL-5介質(zhì)，不需CO2，而要求敞開培養(yǎng)瓶，以供給較高的O22.冰箱和冷柜冰箱(4℃)用于存放培養(yǎng)介質(zhì)，冷柜(—203.顯微鏡最基本的配置是一臺(tái)簡單的倒置顯微鏡，用作日常觀察培養(yǎng)中的細(xì)胞，以便依據(jù)細(xì)胞生長狀況，進(jìn)行調(diào)整或?qū)ξ廴具M(jìn)行補(bǔ)救或處理。進(jìn)行進(jìn)一步的研究，則需要更高級(jí)的顯微鏡，例如，相差顯微鏡或熒光顯微鏡，并附有照相裝置或攝影裝置。4.超凈工作臺(tái)在沒有無菌操作室的條件下；可用超凈工作臺(tái)。它是一無菌操作裝置，主要是利用鼓風(fēng)機(jī)，驅(qū)動(dòng)空氣通過高效濾膜凈化后，緩緩?fù)ㄟ^工作臺(tái)面，使工作部位構(gòu)成無菌環(huán)境。它具有占地面積小，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但它尚難絕對(duì)除去病毒類微生物，而且灰塵過多對(duì)凈化作用不利，故超凈工作臺(tái)最好安置在清潔無塵的房間。5.清洗和消毒設(shè)置：培養(yǎng)中所用玻璃器皿可用電熱干燥箱消毒，要求溫度160℃以上，最好使用較大規(guī)格的干燥箱，如650×500×500mm器皿的清洗可用超聲波洗滌器。吸管的清洗采用虹吸原理制成的沖洗裝置。金屬器械如解剖刀、虹膜剪、鑷子、尖鑷、止血鉗等可用高壓蒸汽消毒。6.培養(yǎng)器皿為了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。特制的塑料瓶皿具有透明、平滑、無毒性、有利于細(xì)胞生長的優(yōu)點(diǎn)。主要的塑料瓶皿有；①多孔培養(yǎng)板，其規(guī)格有4孔、6孔、24孔及96孔，它體積小，適于少量細(xì)胞或單個(gè)細(xì)胞克隆的生長；②培養(yǎng)皿，規(guī)格有直徑30mm、60mm及l(fā)00mm，與玻璃培養(yǎng)皿相同，尤其有利于集落形成和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)；③培養(yǎng)瓶，帶有螺旋蓋塞，規(guī)格有30ml、50ml、l00ml及500ml，適于在CO2培養(yǎng)箱中使用；④其它：凍存細(xì)胞的塑料安瓿及微量加樣器頭，后者的規(guī)格有200~1000μ1和1μl~100μl二種。玻璃器皿在實(shí)驗(yàn)室仍不能完全被塑料制品取代，除培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶外，主要還有：①吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規(guī)格有l(wèi)0ml，5ml和lml；②玻璃瓶，用于配制各種培養(yǎng)液的儲(chǔ)貯存液和血清等，可用生理鹽水瓶或血漿瓶代替，規(guī)格有500ml、250ml和l00ml；③離心管，規(guī)格有50ml、l0ml和5ml，用于細(xì)胞洗滌。7.液氮貯存器貯存細(xì)胞多用液氮，液氮溫度在-196℃，具有經(jīng)濟(jì)、省力和能較好保持細(xì)胞生物學(xué)特性的優(yōu)點(diǎn)。液氮貯存器有25L和50L8.水純化裝置細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水的要求較高，通常要求使用三次蒸餾水配制各種培養(yǎng)液。對(duì)玻璃器皿也應(yīng)用純水清洗。但是，在細(xì)胞培養(yǎng)中，不宜使用去離子純水，因其不能有效地去除有機(jī)物。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備自動(dòng)加水石英玻璃管加熱的蒸餾器，具有蒸餾速度快，使用安全等優(yōu)點(diǎn)。外購蒸餾水或去離子，應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)室重蒸后使用。對(duì)水質(zhì)量應(yīng)經(jīng)常檢測(cè)，如pH和電導(dǎo)系數(shù)。同一實(shí)驗(yàn)盡量使用同一水源，避免水質(zhì)量造成結(jié)果的差異。9.濾過消毒裝置培養(yǎng)介質(zhì)不能經(jīng)高壓蒸汽消毒，而需通過孔徑為0.22μl的濾膜過濾消毒。濾過消毒裝置由抽氣泵(水流玻璃抽氣泵或真空泵)、安全瓶、抽濾瓶和濾器組成。10.一般設(shè)備離心機(jī)，用于對(duì)細(xì)胞懸液離心處理，以達(dá)到細(xì)胞洗滌、調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度等。天平，包括普通臺(tái)秤、扭力天平和分析天平，用于配制各種培養(yǎng)液、酶消化液及生理鹽水等。酸度計(jì)，用于準(zhǔn)確調(diào)整各種介質(zhì)及生理鹽水的pH。電磁攪拌器，微量加樣器等。(二)培養(yǎng)用液指細(xì)胞培養(yǎng)中所使用的溶液，如培養(yǎng)液、消化液、pH調(diào)整液、染液及細(xì)胞洗滌液等。培養(yǎng)液的選擇取決于細(xì)胞生長的要求，故它是維持細(xì)胞生存和生長所需的基本溶液，它的主要成分為平衡鹽溶液和適應(yīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)的各種溶液。培養(yǎng)液在制備過程中應(yīng)嚴(yán)格操作，避免混入雜質(zhì)。應(yīng)特別注意下列問題：①容器，應(yīng)仔細(xì)認(rèn)真清洗，必要時(shí)須消毒；②水，三次重蒸蒸餾水；③嚴(yán)格選擇品質(zhì)優(yōu)良的藥品；④制備好的培養(yǎng)介質(zhì)要標(biāo)明名稱、配制日期及配制者；⑤貯存與消毒。1.平衡鹽溶液常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸鹽緩沖液(PBS)等。它具有維持滲透壓、控制酸堿度平衡的作用及供給細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)鹽的成分。它是配制各種培養(yǎng)介質(zhì)的基礎(chǔ)溶液，也是洗滌細(xì)胞的溶液。2.小牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的天然培養(yǎng)基，它具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞附著和保護(hù)也有明顯的作用。但它有成分較為復(fù)雜、個(gè)體差異較大、來源也有一定的限制等不足。彌補(bǔ)個(gè)體差異的辦法是對(duì)血清進(jìn)行無菌檢測(cè)和支持生長能力測(cè)定后，混合使用。天然培養(yǎng)基除小牛血清外，還有雞血漿、雞胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾膠原等。3.合成培養(yǎng)基系依據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成的。如最簡單的MEMEagle培養(yǎng)液，包括12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素。根據(jù)需要可添加某些成分，如碳水化合物(葡萄糖、核糖、脫氧核糖及丙酮酸鈉等)、核酸的前體物(嘌呤和嘧啶類化合物)及氧化還原劑，抗壞血酸、谷胱甘肽等。如進(jìn)行無血清培養(yǎng)，除上述營養(yǎng)成分外，還應(yīng)加入纖維連結(jié)素、多聚賴氨酸和膠原等成分以促進(jìn)細(xì)胞貼壁。有時(shí)，還需要加入酶的抑制劑，如大豆胰酶抑制劑。為了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。常用抗生素有青霉素、鏈霉素及慶大霉素等。4.消化液進(jìn)行傳代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，為了使細(xì)胞脫離生長表面和細(xì)胞離散成單個(gè)細(xì)胞，通常使用消化液。常用的消化液有胰蛋白溶液(0.25％或0.125％)和乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA)溶液(0.02％)。5.其它pH調(diào)整液，為了營養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長貯存時(shí)間，配制生理鹽溶液，和培養(yǎng)液時(shí)，均在臨用前加入NaHCO3溶液。常用濃度有3.7％、5.6％和7.4%。此外，還有HEPES溶液，是一種氫離子緩沖劑，能較長時(shí)間保持恒定的pH值范圍。使用終濃度為10～15mmol／L。染色液：常用的有①蘇木精-伊紅染色液或稱H.E染色；②Giemsa染色液。固定液：常用的有①中性緩沖福爾馬林，相當(dāng)于10％的福爾馬林；②Bouin氏固定液；③醋酸甲醇，臨用前配制，結(jié)合Giemsa染色效果較好；④FAA固定液，由福爾馬林、冰醋酸及80％酒精組成，用于蓋片單層培養(yǎng)的固定。(三)消毒技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)中，消毒是最基本的一項(xiàng)工作，它直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。消毒措施應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格執(zhí)行。細(xì)胞培養(yǎng)的微生物污染，包括細(xì)菌、真菌及病毒，它們主要來源于：操作者的粗心；操作表面或周圍的環(huán)境；培養(yǎng)液及培養(yǎng)器皿的滅菌不徹底或存放時(shí)間過久等。對(duì)不同的細(xì)胞培養(yǎng)所用物品，可采用不同的消毒滅菌的方法。一般有兩類：一是物理滅菌法，即利用紫外線、干熱及微孔過濾等；二是化學(xué)滅菌法，即利用化學(xué)消毒劑。主要消毒方面法介紹如下：1.紫外線適于消毒空氣、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培養(yǎng)板等，使用方便，效果較好。應(yīng)注意其可產(chǎn)生臭氧，影響健康。2.高壓蒸氣消毒它適于金屬器械、膠塞、布類及某些培養(yǎng)液。一般要求15磅壓力下20min?；蛘吒唵蔚?，煮沸消毒，其不足是濕度大，不易久存。3.干熱消毒適于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用貯存。加溫應(yīng)到160℃4.濾過消毒適于大多數(shù)培養(yǎng)用液。選擇孔徑為0.22μm的微孔濾膜，過濾除菌效果較佳。5.消毒劑適于操作者的皮膚、操作表面和臺(tái)面、桌椅及墻壁等，常用的消毒劑有來蘇兒、新潔爾滅、過氧乙酸及70％酒精。三、培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定有兩個(gè)目的：一是觀察培養(yǎng)有無變化，以決定是否終止培養(yǎng)，并從冷凍貯存的樣品重新建立新的培養(yǎng)細(xì)胞；二是培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)液)變化，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響。因?yàn)榕囵B(yǎng)條件的一致性，對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性有極為重要的影響。對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定包括污染鑒定、生存指標(biāo)及細(xì)胞性質(zhì)(如細(xì)胞形態(tài)、生長特性、染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)等)。(一)污染鑒定細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染有真菌、細(xì)菌和支原體等，此外有化學(xué)物和非同一種細(xì)胞的污染。受到污染的細(xì)胞培養(yǎng)可明顯地改變生長特性，引起pH變化和生長遲緩。污染常常表現(xiàn)為pH變化，培養(yǎng)液表面起泡或起膜，培養(yǎng)液中的絮狀物及細(xì)胞生長表面的斑點(diǎn)，搖動(dòng)培養(yǎng)器皿可消失。肉眼見不到的污染可影響細(xì)胞的代謝。1.鑒定方法真菌或細(xì)菌的污染可用肉眼或低倍光學(xué)顯微鏡觀察，支原體僅能用特別的熒光染料如Hoechst33258染色后在光學(xué)顯微鏡下，或用掃描電子顯微鏡觀察。由于用肉眼無法發(fā)現(xiàn)支原體的污染，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中應(yīng)經(jīng)常定期檢查，例如每三個(gè)月。最簡便和最可靠的檢測(cè)支原體的方法是用熒光染料染色在顯微鏡下觀察。2.處理基本的良好消毒技術(shù)并不一定能防止污染，還應(yīng)注意下列方面：消毒步驟(如高壓鍋和干熱消毒柜)的效果；多層流防護(hù)罩的消毒效果；經(jīng)常檢查培養(yǎng)器皿；每個(gè)工作者有自己配制的培養(yǎng)用液，處理受污染的培養(yǎng)用具和環(huán)境。對(duì)于已污染或懷疑污染的培養(yǎng)用具均可用2.5％高氯酸處理。用抗生素對(duì)預(yù)防或去除細(xì)菌污染較為有效。對(duì)支原體污染，消除方法較多，如抗生素、加溫及動(dòng)物體內(nèi)接種等，但都較為繁瑣，且效果不甚滿意，最好的辦法是棄去，再重新培養(yǎng)。(二)生存指標(biāo)1.臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)是判定細(xì)胞損傷的快速試驗(yàn)，它還可很方便進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。具體方法如下：①取少量細(xì)胞混懸液，加人等量的0.5％臺(tái)盼藍(lán)溶液。②放置1-5min后，將混合液滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池內(nèi)。③顯微鏡下，細(xì)胞顯藍(lán)色的為死亡細(xì)胞，尤其是核深染，而未染的細(xì)胞為存活細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)出細(xì)胞總數(shù)后，可計(jì)算出細(xì)胞存活率。2.酶漏出的檢測(cè)胞漿酶如乳酸脫氫酶(LDH)的漏出檢測(cè)也與染料排斥試驗(yàn)有同樣的靈敏度，同時(shí)，可更精確地進(jìn)行定量，但操作時(shí)間較長。(1)儀器：分光光度計(jì)，最好配有溫育(37℃(2)試劑：溶液0.9％NaCl，0.1％TritorX-100和0.1％牛血清白蛋白。底物3.5gK2HPO4，0.45gkH2PO4和31.0mg丙酮酸鈉溶于450ml的蒸餾水。配好后，可貯存于-20℃NADH，稱42mg，溶于4.5ml的1％NaHCO3，臨用前配制。(3)操作步驟：離心，以適當(dāng)速度使所有細(xì)胞沉淀而不引起細(xì)胞損傷。例如肝細(xì)胞用50g×2min。取出上清，放人干凈試管，并保持0℃以下備用，加入等量的溶液至細(xì)胞沉淀，用漩渦混合器混合。保持在0取一比色杯，加3ml底物，50μl的NADH和25~200μl的樣品(取決于培養(yǎng)細(xì)胞的種類)，迅速混合后，在340nm處進(jìn)行比色。整個(gè)過程應(yīng)在37℃3.其它方法鉻的釋放，利用51Cr3+可被活細(xì)胞吸收，并還原成51Cr3+，留在胞內(nèi)，而死亡細(xì)胞則釋放51Cr3+。用r-計(jì)數(shù)器檢測(cè)無細(xì)胞上清液中51Cr3+的量，即可判斷培養(yǎng)細(xì)胞的存活情況。還有貼壁效率和ATP含量等指標(biāo)可鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的存活情況。(三)細(xì)胞特性鑒定在連續(xù)培養(yǎng)期間，細(xì)胞可能發(fā)生某些變化，如細(xì)胞與原始細(xì)胞的差異逐漸加大。但每一細(xì)胞株具有一系列細(xì)胞特性“正?！钡膮?shù)，可供鑒定評(píng)價(jià)。例如，形態(tài)學(xué)參數(shù)、生長特性及染色體分析等皆為細(xì)胞特性鑒定的指標(biāo)，其中形態(tài)學(xué)與生長特性的測(cè)定相對(duì)容易進(jìn)行。1.形態(tài)學(xué)檢查評(píng)價(jià)細(xì)胞正常與否的最簡單方法是形態(tài)學(xué)檢查；應(yīng)在每次傳代時(shí)用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，最好拍照記錄細(xì)胞的形態(tài)。要詳細(xì)地描述每一細(xì)胞系的形態(tài)。若因限于篇幅，不能詳述，可掌握兩個(gè)述語，即“成纖維樣”和“上皮樣”細(xì)胞，即可描述所觀察的細(xì)胞。成纖維樣細(xì)胞系指在單層細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的長度要大于其寬度的兩倍的細(xì)胞，而上皮樣細(xì)胞系指呈多角形的細(xì)胞。2.生長特性的檢查在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，其生長特性的檢查較易進(jìn)行，主要通過測(cè)定更換培養(yǎng)液的時(shí)間和傳代的時(shí)間來完成。雖然不同的細(xì)胞其傳代時(shí)間和更換培養(yǎng)液的時(shí)間不同，但對(duì)于每一細(xì)胞系應(yīng)該較為固定，因?yàn)橹饕Q于細(xì)胞生長速率。每個(gè)細(xì)胞系均有其自己的生長循環(huán)周期，這取決于接種進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目。一般認(rèn)為，在培養(yǎng)中的細(xì)胞，是處于不同的生長階段。進(jìn)行生長分析，應(yīng)觀察單個(gè)細(xì)胞的生長速率。在實(shí)際工作中，是測(cè)定克隆效率或者接種效率?？寺⌒适菧y(cè)定由單個(gè)細(xì)胞生長的克隆。接種效率是測(cè)定植入小量細(xì)胞(2~50個(gè)／cm2)后，等生長至可分辨的小克隆時(shí)，經(jīng)用生理鹽水洗滌，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml／25cm2)和清水沖洗后，計(jì)算克隆數(shù)。接種效率=一般認(rèn)為，傳代效率小于30表示生長不正常。此項(xiàng)指標(biāo)可用于正常細(xì)胞生長的監(jiān)測(cè)，貯存細(xì)胞的復(fù)蘇及鑒定每一批血清等。在細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中，一般監(jiān)測(cè)指標(biāo)可采用形態(tài)學(xué)、生長模式及接種效率即可。3.其它檢查除上述指標(biāo)外，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可進(jìn)行染色體分析，包括染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量測(cè)定，來判斷培養(yǎng)細(xì)胞的特性。七、細(xì)胞培養(yǎng)在食品毒理學(xué)中應(yīng)用利用培養(yǎng)的細(xì)胞，可進(jìn)行多方面的毒理學(xué)研究，如表12-4中所列。表12-4培養(yǎng)細(xì)胞用于毒理學(xué)體外實(shí)驗(yàn)的實(shí)例一般毒性：主要為急性細(xì)胞毒性器官特異性毒性：利用有代表性細(xì)胞類型如肝細(xì)胞、腎近曲小管細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及心肌細(xì)胞等：毒作用機(jī)理生物轉(zhuǎn)化、毒性代謝產(chǎn)物的形成遺傳毒性，如程序外DNA合成測(cè)定繁殖毒性聯(lián)合毒性不同物種間的比較毒性光敏毒性以下重點(diǎn)討論毒理學(xué)中應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題。1.細(xì)胞類型的選擇細(xì)胞類型的選擇取決于實(shí)驗(yàn)的目的。一般性篩選系列化合物的一般毒性時(shí)，應(yīng)選擇生長迅速且易于處理的細(xì)胞系。機(jī)理研究多不用細(xì)胞系，因?yàn)榕囵B(yǎng)的細(xì)胞會(huì)逐漸喪失許多功能，如細(xì)胞色素P-450的活性。細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)之一是可選擇來源于人體的組織細(xì)胞，可減少試驗(yàn)結(jié)果的物種差異。成纖維樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞均可選用。常用的細(xì)胞系有CHO、V79、Hela、BHR及L929等。2.代謝活化細(xì)胞經(jīng)8-24h培養(yǎng)后，細(xì)胞色素P-450活性將迅速下降。而在CHO細(xì)胞系中，涉及代謝活化的酶活性下降。所以，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)需代謝活化的化學(xué)物不能夠敏感。解決這個(gè)問題有兩個(gè)方法，一是加S9，二是與原代肝細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)。S9需要NADPH才具有代謝活化作用，故在培養(yǎng)液中應(yīng)加有NADPH生成系統(tǒng)(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸和NADP)。與原代肝細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)時(shí)也可采用其它不同的細(xì)胞系，如V79、中國地鼠肺成纖維細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞。3.受試物的給予許多受試物由于水溶性較低，在加入培養(yǎng)液前，常需溶于有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞有損害作用，故應(yīng)限制有機(jī)溶劑濃度在1％以下。在試驗(yàn)中可設(shè)立適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑對(duì)照和培養(yǎng)液對(duì)照。例如，需用S9混合液；有機(jī)溶劑的濃度應(yīng)限制在0.1％，因?yàn)樵S多有機(jī)溶劑可抑制酶的活性。不溶性的受試物如，顆粒和油劑在給予培養(yǎng)液時(shí)仍存在問題。一般是混懸于培養(yǎng)液或者先溶于溶劑，再加人培養(yǎng)液，但有時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的毒性結(jié)果。例如，黃樟醚和降脂乙醚等油性受試物，假如使用高劑量時(shí)將有某些塑料培養(yǎng)皿成分的溶出，則所觀察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。4.設(shè)立陽性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重現(xiàn)性應(yīng)該用陽性對(duì)照物來檢查。陽性對(duì)照物指采用經(jīng)過研究或公認(rèn)有特定作用的化學(xué)物。例如在代謝活化研究中常選擇環(huán)磷酰胺為陽性對(duì)照物，在細(xì)胞毒性篩檢時(shí)可選二甲基環(huán)己基烴乙基戊二酰亞胺和二硝基苯酚為陽性對(duì)照物。5.毒性指標(biāo)的選擇依據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)康暮驮囼?yàn)條件，可選擇不同的觀察指標(biāo)。下列指標(biāo)在毒理學(xué)中經(jīng)常采用：(1)IC50：即經(jīng)3天培養(yǎng)后，引起生長速率減至對(duì)照組一半時(shí)所需受試物的濃度生長速率可用蛋白總濃度來表示，可用于細(xì)胞毒性的常規(guī)篩檢。此外，前述評(píng)價(jià)細(xì)胞特性的指標(biāo)，如形態(tài)學(xué)和接種效率等，均可采用。(2)細(xì)胞膜損傷：可選擇臺(tái)盼藍(lán)攝取、胞漿酶漏出、Ca2+的釋放以及鈣泵的變化等指標(biāo)來評(píng)價(jià)細(xì)胞膜的損傷。(3)大分子物質(zhì)合成與降解的改變：可選用[14C]亮氨酸蛋白試驗(yàn)和[3(4)代謝能力：除可選擇ATP濃度、NADP／NADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指標(biāo)外，還有毒物代謝酶的活性、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用及[14C]-葡萄糖氧化代謝成14CO2(5)形態(tài)學(xué)觀察：通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，可了解受試物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)改變情況。亞細(xì)胞組分制備及其檢測(cè)方法細(xì)胞由許多亞細(xì)胞組分組成，如核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體及高爾基氏體等，它們?cè)诰S持細(xì)胞正常生理功能方面起著重要的作用。故許多外源化學(xué)物引起機(jī)體的損害作用，有可能與亞細(xì)胞組分的結(jié)構(gòu)與功能損傷有關(guān)。在毒理學(xué)中，亞細(xì)胞組分作為遺傳毒性測(cè)定中的代謝活化系統(tǒng)，如S9已普遍運(yùn)用。此外，亞細(xì)胞組分主要用于中毒機(jī)理的分子水平研究，因它們是從整體細(xì)胞上在自然環(huán)境下分離出來的，使毒理學(xué)家在體外條件下，有可能更深入了解外源化學(xué)物在毒作用部位的作用機(jī)理。但它離開子整體細(xì)胞，也有其局限性；即它僅提供有關(guān)一些特殊作用能力的特定信息。對(duì)外源化學(xué)物毒作用機(jī)理研究，還應(yīng)結(jié)合其它研究如整體試驗(yàn)、細(xì)胞試驗(yàn)等，綜合作出評(píng)價(jià)。現(xiàn)就微粒體和線粒體的制備及其檢測(cè)方法加以介紹。一、基本技術(shù)(一)設(shè)備1.勻漿器(homogenizer)常用勻漿器為Potter型，由一聚四氟乙烯杵和玻璃套管組成。它是利用兩者的間隙將細(xì)胞破碎，其間隙一般在0.15~0.25nm。杵是由馬達(dá)傳動(dòng)，其速度在2000rpm以內(nèi)，且可調(diào)節(jié)。它較適合肝細(xì)胞、腎細(xì)胞及腦細(xì)胞的破碎，而對(duì)肺、甲狀腺等結(jié)締組織較多的組織效果不佳。勻漿器可從5ml至50ml大小不等，依實(shí)驗(yàn)需要加以選擇。使用本法破碎細(xì)胞應(yīng)注意：①在低溫下操作避免勻漿磨擦生熱和室溫影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；②馬達(dá)速度不宜過快，慢速可獲更大的扭力矩；③勻漿上下次數(shù)，即杵由玻璃套管上部下到底部，再回到上部，一般肝細(xì)胞勻漿上下8~10次即可達(dá)到破碎目的。2.離心機(jī)是亞細(xì)胞組分制備的關(guān)鍵設(shè)備，一般需要低溫高速離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為18000～24000rpm，和超速離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為50000～75000rpm。離心機(jī)應(yīng)配備各種類型的轉(zhuǎn)頭，以供亞細(xì)胞組分制備時(shí)差速離心選用。離心管最好為聚丙烯的，因其透明性較好。(二)勻漿介質(zhì)和緩沖液最常用的勻漿介質(zhì)為等滲的蔗糖(0.25mol／L)和氯化鉀(0.154mol／L)。蔗糖為經(jīng)典亞細(xì)胞組分分離研究所選用，而氯化鉀更適合外源化學(xué)物代謝酶的研究，如它可更有效除去微粒體制備物中的血紅蛋白，減少光譜測(cè)定的干擾。勻漿介質(zhì)在使用前應(yīng)將pH調(diào)至7.4左右。勻漿緩沖液可含有5~50mmol／L的Tris或Hepes。大多數(shù)研究中常用的勻漿緩沖液為含0.154mol／LKCl的50mmol／LTris·HCI緩沖液，pH7.4。此緩沖液在4℃(三)生物樣品實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如大鼠、小鼠、金黃地鼠應(yīng)迅速處死，常用的方法是斷頭處死。應(yīng)避免使用麻醉劑，如乙醚、巴比妥類藥物，它們將影響毒物代謝酶的活力。對(duì)于大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如狗等，應(yīng)在適當(dāng)?shù)穆樽項(xiàng)l件下，放血處死。盡快取出所需臟器，如肝、腎、肺及腦等，置人冰的勻漿介質(zhì)中。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)參考動(dòng)物的年齡、性別、品系、健康狀況、飲食類型和飼養(yǎng)環(huán)境等因素。此外，為避免晝夜節(jié)律影響，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)在相同時(shí)間處死動(dòng)物。為避免肝糖原影響，大鼠應(yīng)禁食過夜。(四)微粒體酶的誘導(dǎo)方法1.苯巴比妥鈉它是常用的誘導(dǎo)劑之一。其方法是以小鼠80mg／(kg·d)，大鼠100mg／(kg·d)，經(jīng)腹腔注射或與生理鹽水混合灌胃，連續(xù)3~5天即可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P-450的活力。還可以將藥溶于飲水，1ng／ml，大約7天后，可達(dá)到誘導(dǎo)效果。主要誘導(dǎo)細(xì)胞色素P-450。2.p-萘黃酮(β-naphthoflavone)它是多環(huán)芳烴類的誘導(dǎo)物，可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P448，同類誘導(dǎo)物還有3-甲基膽葸(3-methylcholanthrene)。β-萘黃酮的使用方法是小鼠40mg／(kg·d)，大鼠80mg／(kg·d)，經(jīng)腹腔注射，連續(xù)3～4天，即可達(dá)到誘導(dǎo)作用。主要誘導(dǎo)細(xì)胞色素P448。3.多氯聯(lián)苯常用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)物是Arochlorl254，它是混合型的誘導(dǎo)物，即同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞色素P-450和細(xì)胞色素P-448，劑量依多氯聯(lián)苯種類不同而異，需做預(yù)試驗(yàn)來確定。二、微粒體的制備微粒體(microsome)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞勻漿過程中形成的碎片，并非獨(dú)立的細(xì)胞器。由于微粒體含有混合功能氧化酶，其在毒理學(xué)研究中有著重要地位，故微粒體是毒理學(xué)中較常用的體外系統(tǒng)。(一)肝微粒體制備1.以斷頭方法處死動(dòng)物，迅速取出肝臟，用預(yù)冷生理鹽水或勻漿介質(zhì)洗凈血污，剪去粘連的組織，用濾紙輕輕吸干表面水分，稱重。2.將肝轉(zhuǎn)入小燒杯，用剪刀剪碎肝臟，加入適當(dāng)勻漿介質(zhì)，一般為3ml／g肝臟。放人Potter勻漿器中，上、下8次，制成肝勻漿。3.按示意圖操作離心。肝勻槳離心，10000g20min上清液沉淀離心，10500g1h沉淀（微粒體）上清液棄去在第一次離心去除線粒體、核等物質(zhì)時(shí)，離心管上層漂浮有脂質(zhì)層，應(yīng)用吸管將其除去，再收集上清液。在第二次超速離心后，如為了減少血紅蛋白的影響，可加勻漿介質(zhì)將沉淀重新懸浮，將所制備的微粒體再洗滌一次。沉淀即微粒體，懸浮于10mmol／LHepes·HCl緩沖液，pH7.6，內(nèi)含0.154mol／LKCl，lmmol／LEDTA和20％甘油，貯存于-20～70℃或是液氮中。應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是貯存方式和時(shí)間對(duì)微粒體酶的活性或特征會(huì)有不同程度的影響。4.其它方法除超速離心法制備微粒體外，還有凝膠過濾、鈣沉淀法和等電點(diǎn)沉淀法也可以制得微粒體。凝膠過濾法不適于做多個(gè)樣品。鈣沉淀法適于沒有超速離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)室使用。其方法是在去線粒體的上清液中加入鈣離子，使其終濃度為8mmol／LCaCl2，此時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分產(chǎn)生鈣依賴性聚集，在較低的離心條件，2000~25000g，20min即可將其沉淀。不足之處是鈣離子可影響某些酶的活性以及造成核糖體的丟失。等電點(diǎn)沉淀法是利用pH改變，使微粒體沉淀出來，棄去線粒體的上清液用醋酸緩沖液把pH調(diào)至5.5時(shí)，在較低離心條件下，10000gl0min，即可制得微粒體。其優(yōu)點(diǎn)也是不需超速離心機(jī)，不足之處是酸性條件下，可使某些酶和CytP-450失活。(二)肝外組織微粒體的制備肝外組織的細(xì)胞色素P-450的含量和有關(guān)酶活性遠(yuǎn)較肝組織低。應(yīng)注意所有操作應(yīng)在0~4℃三、混合功能氧化酶系的測(cè)定方法MFO催化的反應(yīng)類型繁多，且底物特異性不強(qiáng)，故有多種方法用于MFO測(cè)定，可分為直接法和代謝法。直接法是直接測(cè)定MFO的各組成成分，如細(xì)胞色素P-450含量等。代謝法是通過測(cè)定MFO催化反應(yīng)中的底物消耗量或產(chǎn)物生成量，間接了解MFO活力。由于MFO作用的復(fù)雜性以及成分的多樣性，通常認(rèn)為使用單一方法進(jìn)行MFO的評(píng)價(jià)不夠全面和可靠，因此，在毒理學(xué)中是采用多種檢測(cè)分析方法，從不同角度進(jìn)行MFO作用的評(píng)定。(一)直接法1.細(xì)胞色素P-450含量測(cè)定細(xì)胞色素P-450是MFO的主要成分，起到終末氧化酶的作用。其最大特點(diǎn)是還原型CytP-450與一氧化碳結(jié)合后，在450nm處有最大吸收光譜，因此被稱為CytP-450。利用其在450nm的最大吸收光譜，可測(cè)得樣品中CytP-450的含量。(1)儀器：雙光束可記錄的分光光度計(jì)。因?yàn)槲⒘ｓw樣品是濁狀樣品，需雙光束分光光度計(jì)，在450nm和490nm處進(jìn)行差示光譜分析。(2)試劑：0.2mol／L磷酸緩沖液pH7.4；一氧化碳(氣體)；連二亞硫酸鈉(3)步驟：①將微粒體制備物用0.2mol／L磷酸緩沖液pH7.4適當(dāng)稀釋；②加小量固體的連二亞硫酸鈉，(sodiumdithionite，Na2S2O4)迅速混勻；③分裝人兩個(gè)比色杯中，用一氧化碳?xì)怏w向比色杯輕輕吹泡lmin，開始在450nm和490nm波長處測(cè)定其光密度值。(4)計(jì)算：CytP-450含量(nmol／mgPr)=式中：ΔA為450nm處光密度值與490nm光密應(yīng)值之差91為CytP450的消光系數(shù)，單位：cm2／mmolr為比色杯光徑長度，單位：cmC為微粒體制備物的蛋白濃度，單位：mg／ml本法測(cè)定。2.NADHP-細(xì)胞色素P-450還原酶測(cè)定NADHP-細(xì)胞色素P-450還原酶在MFO作用中起提供電子的作用。在實(shí)驗(yàn)工作中，它的活力較難測(cè)定，且需要特殊儀器。因此，通用細(xì)胞色素C作為人工電子受體，來測(cè)定這種微粒體黃素蛋白酶。其原理是氧化型細(xì)胞色素C被轉(zhuǎn)變成還原型細(xì)胞色素C時(shí)，在550nm處有典型的最大吸收峰。如上所述，直接法可判斷外源化學(xué)物對(duì)MFO催化是否具有誘導(dǎo)作用或抑制作用。它能評(píng)定CytP-450總含量，但不能確定某一CytP-450亞型的改變，也就是說不能測(cè)定MFO催化某一特定反應(yīng)活動(dòng)的影響。(二)代謝法代謝法可分為NADPH消耗量測(cè)定、氧耗測(cè)定和MFO催化代謝產(chǎn)物生成量測(cè)定。1.NADPH消耗量測(cè)定NADPH參與MFO的催化作用過程，故通過測(cè)定NADPH的氧化，即NADPH消耗量，可間接了解MFO活力。本法是利用雙光束分光光度計(jì)測(cè)定340nm處光密度的變化量。其反應(yīng)體系多為0.05mol／LTris·HCI緩沖液，其中含0.15mol／LKCl和10mmol／LMgCl2，pH為7.4；微粒體蛋白含量為0.2~0.5mg/ml;NADPH含量為0.12～0.16mmol／L。本法是測(cè)定反應(yīng)體系中NADPH總消耗量，但在微粒體制備物中，不僅MFO催化反應(yīng)需要消耗NADPH;而且它不可能區(qū)分細(xì)胞色素P-450各種同工酶的作用，所以用該法來評(píng)價(jià)MFO活力，在準(zhǔn)確性和專一性等方面均有不足。但在重組酶系中，即由各種純化的MFO組分在體外條件下組成的反應(yīng)體系，例如，由細(xì)胞色素P450的某亞型、NADPH—細(xì)胞色素P-450還原酶和磷脂組成的細(xì)胞色素P-450重組系統(tǒng)，可避免準(zhǔn)確性和專一性不足的缺點(diǎn)。本法測(cè)定簡便易行，不失為MFO重組體系中較好的測(cè)定方法。2.氧耗測(cè)定法采用氧電極法測(cè)定反應(yīng)體系中的氧耗量，通過化學(xué)計(jì)量法間接了解MFO活力的反應(yīng)體系中，NADPH需要保持恒定的水平，故常用NADPH生成系統(tǒng)，如葡萄糖-6-磷酸／葡萄糖-6-磷酸脫氫酶或異檸檬酸／異檸檬酸脫氫酶等來滿足需要。本法也有與NADPH消耗量測(cè)定類似的缺點(diǎn)，即微粒體制備物中有較多的酶系在催化過程中均有氧的消耗。例如，在微粒體制備過程中，難免有觸酶(catalase)的污染，觸酶催化過氧化氫產(chǎn)生水和氧。此外，也可能有脂質(zhì)過氧化作用發(fā)生，所以，氧耗測(cè)定法對(duì)評(píng)價(jià)微粒體制備物MFO活力的應(yīng)用受到一定的限制。3.MFO催化代謝產(chǎn)物的測(cè)定通過直接測(cè)定特定底物的消耗進(jìn)行MFO活力評(píng)定存在一定的困難，因?yàn)槠浯蠖鄶?shù)底物的米氏常數(shù)(km)為0.5～5.0mmol／L，而MFO的比活性僅與測(cè)量方法本身的誤差相近，難于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。故評(píng)定MFO活力時(shí)，多改用其代謝產(chǎn)物生成量的測(cè)定。由于其底物特異性不強(qiáng)，催化反應(yīng)類型較多，目前已建立多種產(chǎn)物的檢測(cè)方法。依據(jù)測(cè)定技術(shù)，代謝產(chǎn)物測(cè)定方法又可分為可見紫外分光光度法、熒光分光光度法、氚標(biāo)記放射測(cè)定和色譜分析等。(1)可見紫外分光光度法：利用分光光度法評(píng)定MFO活力，應(yīng)用最廣泛的方法之一是甲醛生成量的測(cè)定，原理是依據(jù)MFO所催化的N-和O-脫烷基反應(yīng)，許多底物如芐甲苯丙胺與氨基比林(N-脫甲基)和可待因(N-脫甲基和O-脫甲基)等經(jīng)過脫甲基作用后，皆有甲醛生成。故可用甲醛的生成量表示MFO活力。甲醛的測(cè)定是利用Hantzsch反應(yīng)，用乙酰丙酮和銨離子捕捉甲醛，形成有色的衍生物。本法簡便，易于掌握，是測(cè)定MFO的N-和O-脫烷基作用常用的方法之一，廣泛用于肝臟微粒體制備物MFO的活力評(píng)定。對(duì)于肝外組織，因甲醛生成速率為2~3nmol·min-l·m1-1，即肝外組織MFO活力較低，其靈敏度有限。但可加入氨基脲(1mmol／L)，增加對(duì)甲醛的捕捉能力，以提高其靈敏度，擴(kuò)大本法的應(yīng)用范圍。此外，放射測(cè)定法可使甲醛測(cè)定的靈敏度提高，但需要N-甲基-14C標(biāo)記的底物。由于14C利用可見紫外光光度法，還可測(cè)定MFO催化代謝的其他反應(yīng)。例如，通過苯胺和環(huán)己巴比妥測(cè)定羥化作用；偶氮化合物和硝基化合物測(cè)定還原作用；對(duì)硝基茴香醚測(cè)定O-脫烷化作用等。這些方法簡便易行，適合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室，但靈敏度不高，對(duì)于MFO活力較低的肝外組織不宜采用。(2)熒光分光光度法：原理是利用MFO催化反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，測(cè)定MFO的活力。本法比較靈敏，一般高于可見紫外分光光度法2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，可測(cè)出1～30pmol產(chǎn)物生成量／(min·mg蛋白)，適用于肝外組織和培養(yǎng)細(xì)胞的MFO活力的評(píng)定。直接熒光法常用的底物有7—二氧基香豆素(7-ethoxycoumarin)和7-二氧基試鹵靈(7-ethoxyresomfin)。經(jīng)過O—脫烷基作用，生成具有高強(qiáng)度熒光的酚類產(chǎn)物7-羥基香豆素和7-羥基試鹵靈。測(cè)定隨時(shí)間增強(qiáng)的熒光，可反映MFO的活力。測(cè)定7-二氧基香豆素的激發(fā)(excitation)和發(fā)射(emission)波長分別為380nm和452nm，而7-二氧基試鹵靈的分別為525nm和582nm。由于本法靈敏度較高，將出現(xiàn)較高的對(duì)照值，即本底較高。解決方法是加抽提步驟，即有0.5m14mol／LHCl終止反應(yīng)后，用6ml氯仿抽提，測(cè)定4ml氯仿與4ml甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中的7-羥基香豆素。芳烴羧化酶活力測(cè)定也是用熒光法，其原理是以苯并(a)芘為底物，與待測(cè)微粒體溫育一定的時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，用己烷抽提熒光產(chǎn)物3.9—羥基苯并(a)芘和剩余底物，然后將氫強(qiáng)度。(3)氚標(biāo)記放射性測(cè)定：利用氚標(biāo)記的有機(jī)化合物在MFO催化的羥化過程中，由碳-氫鍵上脫落的質(zhì)子(proton)來評(píng)定MFO活力。本法常用于甾體和芳香族化合物羥化反應(yīng)的測(cè)定。本法靈敏度較高，但由于需要高比活的氚標(biāo)記底物、昂貴的液體閃爍計(jì)數(shù)儀和受過訓(xùn)練的專業(yè)人員等，限制了推廣使用。(4)色譜分析法：利用層析技術(shù)分離MFO催化反應(yīng)中的各種產(chǎn)物，然后進(jìn)行定性或定量測(cè)定。紙層析、薄層層析、氣相色譜及高效液相色譜等層析技術(shù)均可采用，其中以氣相色譜和高效液相色譜應(yīng)用最廣。例如，多環(huán)芳烴、甾體化合物和芐丙酮香豆素(warfarin)等代謝產(chǎn)物，可用氣相色譜或高效液相色譜分離，再用標(biāo)準(zhǔn)品或比色等方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，以產(chǎn)物生成量的多少評(píng)定MFO的活力。色譜分析法雖然較前述其他方法需要較長的時(shí)間和更多的費(fèi)用，但可對(duì)某些外源化學(xué)物經(jīng)MFO催化的整個(gè)生物轉(zhuǎn)化過程及其關(guān)鍵產(chǎn)物有全面了解。例如，利用高效液相色譜闡明苯并(a)芘的全部代謝過程和終致癌物。四、線粒體的制備(一)大鼠肝臟線粒體的制備所有操作應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行。全部器械如勻漿器、燒杯、離心管等，以及緩沖液應(yīng)放4℃冰箱內(nèi)預(yù)冷。將大鼠(體重200-250g)斷頭處死，放盡血液。迅速取出肝臟(約10g重)，剪去結(jié)締組織和血管，放人燒杯內(nèi)，用預(yù)冷的緩沖液清洗2～3次，盡可能洗去血液。肝臟用濾紙擦干后，稱重。將肝臟轉(zhuǎn)入50ml燒杯內(nèi)，有剪刀剪成小的組織塊，再用預(yù)冷的緩沖液洗2～3次，轉(zhuǎn)入勻漿器內(nèi)。勻漿速度為1100rpm，用連續(xù)較長的時(shí)間依次逐漸將杵伸到玻管的底部。當(dāng)杵沒有額外阻力能進(jìn)入玻管底物(大約需6次上下)時(shí)，再做4次上下即完成勻漿步驟。此步驟應(yīng)注意溫度在0-4進(jìn)行差速離心，按下列步驟進(jìn)行：肝勻槳離心，460g10min上清液沉淀(包括細(xì)胞核，紅細(xì)胞離心，12500g10min及大的細(xì)胞碎片)沉淀（含有線粒體）上清液棄去經(jīng)12500g離心的沉淀，從外觀上可分為三個(gè)不同區(qū)帶：底層為白色或紅色，內(nèi)有殘留的細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞；中層為深棕色，是大量完整的線粒體和一些溶酶體；上層為絨毛狀，有光澤，帶粉紅色，為一些破的線粒體和微粒體。小心去除上層沉淀，收集含有線粒體的中層沉淀；加適量的緩沖液，再離心12500g10min，收集沉淀。加2—3ml緩沖液重新懸浮，即為線粒體的制備物，其蛋白濃度約為30mg／ml。操作要點(diǎn)是熟練，整個(gè)制備過程應(yīng)在1h內(nèi)完成。(二)亞線粒體顆粒的制備其原理是利用超聲波作用，破壞線粒體外膜，再經(jīng)超速離心獲得僅有內(nèi)膜的亞線粒顆粒。它含有全部氧化磷酸化的酶類，對(duì)于觀察呼吸鏈氧化反應(yīng)、ATPase活性及其它部分的反應(yīng)是十分有用的。1.緩沖液為0.25mol／L蔗糖，含有1mmol／LEDTA，10mmol／LTris·HCl緩沖液，pH7.5。2.操作步驟①用10000g×l0min，離心沉淀線粒體。②用緩沖液重新懸浮沉淀，其濃度約為20mg／ml，用超聲波處理15s，間隙15s，共lmin，超聲源為一臺(tái)60W功率的超聲發(fā)生器。③經(jīng)超聲處理的線粒體制備物，用緩沖液稀釋2倍，以29000g×l5min，以沉降完整的線粒體和較大部分的線粒體。④將上清移至另一離心管內(nèi)，以100000g×30min離心，沉降亞線粒體顆粒，其沉淀為紅色，外觀與松香類似。用等體積的緩沖液再洗一次。用緩沖液重新懸浮沉淀，使終濃度為20mg蛋白／ml，即為亞線粒體制備物。⑤注意事項(xiàng)：在超聲處理過程中，保持線粒體制備物溫度不要升高，維持在4℃五、線粒體功能的測(cè)定制備線粒體的質(zhì)量將受可能的其它亞細(xì)胞器如溶酶體和過氧化體的污染和／或線粒體功能完整性的影響。后者是主要因素，它僅能通過測(cè)定各種代謝的功能來評(píng)定。線粒體所執(zhí)行的各種功能取決于氧化磷酸化過程。(一)線粒體呼吸功能的測(cè)定線粒體的氧化磷酸化系統(tǒng)由兩個(gè)不同但又緊密聯(lián)系的多酶系統(tǒng)組成，即呼吸鏈和ATP酶／合成酶的兩個(gè)系統(tǒng)。呼吸功能通常是利用氧電極測(cè)定反應(yīng)體系的氧分壓變化來了解線粒體的呼吸狀況。1.試劑(1)KCl，5mmol／LFeCl2溶于10mmol／LTris·HCl緩沖液，pH7.4。(2)底物：所有三羧酸循環(huán)(TEA)的中間產(chǎn)物，如3—羥基丁酸、谷氨酸、脯氨酸和脂肪酸均可以。推薦丙酮酸+蘋果酸，谷氨酸+蘋果酸以及3—羥基丁酸+琥珀酸，其加入量為10~20μl，終濃度高達(dá)5~l0mmol／L。2.電極調(diào)試(1)打開電極、磁力攪拌器、紙記錄儀和恒溫水浴器的開關(guān)，使它們平衡至少30min。(2)按使用說明安裝氧電極，檢查銀和鉑電極應(yīng)有光澤，以及聚四氟乙烯膜完好無損。(3)取2ml呼吸緩沖液，在30℃始攪拌并記錄，速度為1cm／min。(4)穩(wěn)定1~2min后，將記錄儀調(diào)至95％位置。此為“空氣線”，即是用空氣完全飽和的緩沖液。再過5min，記錄儀不應(yīng)漂移，如還在漂移，說明電極有問題。(5)關(guān)掉攪拌器，記錄筆瞬間向下偏移，再打開攪拌器，筆應(yīng)回到“空氣線”。說明電極有污染，可用浸水棉簽清洗。(6)在確定電極反應(yīng)正常后，加入少量連二亞硫酸鈉固體，使記錄筆迅速下移。數(shù)分鐘后，記錄筆穩(wěn)定在較低的位置。此時(shí)，緩沖液為無氧狀態(tài)，筆處的位置為“氮?dú)饩€”。通常，氮?dú)饩€是位于記錄儀調(diào)試時(shí)的記錄零點(diǎn)，此時(shí)電極電壓為零“氮?dú)饩€”與“空氣線”位置之差表示緩沖液的氧濃度。3.線粒體呼吸的測(cè)定(1)加1.9ml呼吸緩沖液的0.1ml線粒體制備物，約含蛋白4mg，進(jìn)入電極室，注意排除空氣，調(diào)正電極位置。封閉電極室后，使線粒體唯一的氧源是呼吸緩沖液中的溶解氣體。(2)在不改變緩沖液氧濃度的情況下，向電極室加人不同的試劑，其理想辦法是用微量注射器，并且每次加入量不超過20μl。加試劑時(shí)，應(yīng)小心緩慢，不要引起記錄筆的“跳動(dòng)”。(3)加入不同代謝物后，線粒體的代謝狀況見表12-5。表中所示，加人代謝物濃度不一，會(huì)引起呼吸速率的改變，其速率限制因素也不一。實(shí)驗(yàn)中主要觀察狀態(tài)3、狀態(tài)4，以計(jì)算呼吸調(diào)控比(respiratorycontrolratio，RCR)。(4)RCR的計(jì)算：記錄內(nèi)源性呼吸2min，即狀態(tài)1;加底物S或P+M，激發(fā)呼吸，使線粒體進(jìn)入狀態(tài)4；記錄2-3min后，加入已知量的ADP，激發(fā)線粒體呼吸進(jìn)入狀態(tài)3。當(dāng)ADP消耗完后，呼吸又回到狀態(tài)4。計(jì)算RCR的狀態(tài)4應(yīng)是加ADP后出現(xiàn)的狀態(tài)4，因?yàn)槠鹗嫉臓顟B(tài)4總是要比加ADP后出現(xiàn)的狀態(tài)4慢。狀態(tài)3或4的呼吸速率計(jì)算：已知呼吸緩沖液的氧濃度為420ngatomO／min，總氧含量為840ngatom，記錄范圍即空氣線至氮?dú)饩€為95％，故將總氧含量垂直分為95等分，每一垂直等分為8.8ngatomO。通過記錄筆的移動(dòng)，縱軸為氧耗，橫軸為時(shí)間，可求出呼吸速率。一般琥珀酸為底物，狀態(tài)3的呼吸速率為94ngatomO／(mg蛋白·min)，狀態(tài)4為23ngatomO／(mg蛋白·min)；而丙酮酸加蘋果酸為底物，狀態(tài)3的呼吸速率為5lngatomO／(mg蛋白·min)，狀態(tài)4為l0ngatomO／(mg蛋白·min)。故琥珀酸的PCR為4，丙酮酸加蘋果酸約為RCR為5。如果RCR<3，可認(rèn)為制備的線粒體失敗。4.ADP／O比值測(cè)定在生物化學(xué)上，P／O比指磷酸化與呼吸之間的化學(xué)計(jì)算關(guān)系，常用Warburg壓力計(jì)來測(cè)定。此外，依據(jù)P／O比也等于ADP／O比，利用線粒體呼吸測(cè)定試驗(yàn)可求出ADP／O比。ADP的加入量是已知，加入后線粒體的氧耗量，可通過圖W-X中的X求得。故可計(jì)算出ADP／O比。ADP／O比值取決于線粒體的制備情況，ADP加入量及O2濃度測(cè)定的精確性，它是判斷線粒體功能是否完好的指標(biāo)之一。(二)線粒體呼吸的抑制作用研究研究線粒體呼吸的抑制作用，在了解線粒體氧化磷酸化作用中起著重要的作用。外源化學(xué)物抑制線粒體的氧化磷酸化過程，將它們的抑制作用研究與已知抑制劑作用比較，可探討外源化學(xué)物作用線粒體氧化磷酸化的機(jī)理。分類常見線粒體抑制劑的分類見表12-6。表12-5線粒體的代謝狀況代謝物濃度狀態(tài)呼吸速率速率限制因素O2ADP底物1高低低慢ADP水平2高高無慢底物水平3高高高快呼吸鏈4高低高慢ADP水平5無高高無氧水平表12-6線粒體抑制劑的分類類型代表性抑制劑呼吸鏈抑制部位I魚藤酮部位Ⅱ抗霉素A部位Ⅲ氟化鉀解偶聯(lián)劑CCCP或DNPATP酶／合成酶抑制寡霉素底物轉(zhuǎn)運(yùn)丁基丙二酸(二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn))離子轉(zhuǎn)運(yùn)鈣紅(Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn))表12-7ATP合成測(cè)定的加樣方案測(cè)定項(xiàng)目緩沖液糖激酶線粒體制備物H2O底物空白1ml20μl50μl30μl—對(duì)照1ml20μl50μl30μl10μl測(cè)定1ml20μl50μl2.經(jīng)典抑制作用經(jīng)典抑制作用見圖12-6。對(duì)A-E模式的解釋如下：(A)魚藤酮(Rot)可抑制NADH連接底物的線粒體呼吸。加入底物琥珀酸(S)可刺激呼吸，是因?yàn)殓晁峥衫@過魚藤酮的抑制阻礙進(jìn)入呼吸鏈。再加抗霉素A(Anti—A)可阻斷琥珀酸以后的呼吸鏈。加入四甲基—對(duì)苯胺二胺／抗壞血酸(TMPD／ascorb-)，它們是人工的電子供體，故可將電子輸入抗霉素A，刺激線粒體呼吸，如加氰化鉀(CN-)可阻斷由TMPD／ascorb刺激的呼吸。(B)曲線的上半部分是典型的狀態(tài)3向狀態(tài)4過渡的軌跡。當(dāng)加入蒼術(shù)苷(AF4)，不影響狀態(tài)4。ADP作為阻斷ADP／ATP易位子的抑制劑也無作用。然而，加人一解偶聯(lián)劑，仍可像正常一樣，刺激線粒體呼吸，表明假如有抑制劑已經(jīng)作用于呼吸鏈，則解偶聯(lián)劑不可能刺激線粒體的呼吸。(C)用寡霉素(Oligo)可出現(xiàn)同B一樣的軌跡，它的作用機(jī)理可能是對(duì)ATP酶／合成酶復(fù)合物起抑制作用，表明兩種不同類型的抑制劑可產(chǎn)生對(duì)呼吸的相同作用。需用其它實(shí)驗(yàn)加以區(qū)別。(O／E)這兩種曲線，均表現(xiàn)Ca2+可刺激線粒體的呼吸，而鈣組(R．R)可抑制Ca2+刺激的呼吸。因?yàn)樗且环NCa2+轉(zhuǎn)運(yùn)的特殊抑制劑。由前述可知，用氧電極研究可獲得許多有關(guān)外源化學(xué)物對(duì)線粒體作用的資料。本研究應(yīng)注意的是：①加人多種抑制劑，應(yīng)保證兩次實(shí)驗(yàn)之間，徹底清洗電極室；②對(duì)于不溶于水的受試物，應(yīng)設(shè)立溶劑對(duì)照，觀察溶劑是否對(duì)線粒體有作用。在每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束，均應(yīng)用乙醇洗去受試物的任何軌跡，再進(jìn)行下次實(shí)驗(yàn)。(三)ATP合成的測(cè)定測(cè)定線粒體氧化磷酸化除氧化電極外，還有另一種方法，即測(cè)定ATP合成量。常用的方法是用葡萄糖／己糖激酶捕捉系統(tǒng)，其中由ATP不斷產(chǎn)生ADP，使線粒體維持狀態(tài)，通過Pi的消失測(cè)定ATP的形成。本法簡便易行，又不需特殊的儀器。此外，由于線粒體制備物可保持良好的偶聯(lián)狀態(tài)，一般為2～3h，可進(jìn)行許多測(cè)定，尤其是抑制作用的研究。再者，ATP合成的測(cè)定，不同于偶聯(lián)的氧消耗，受線粒體制備的質(zhì)量影響較小。1.試劑(1)ATP合成緩沖液：l0mmol／LTris·HCl緩沖液，pH7.5，內(nèi)含0.25mol／L蔗糖，22mmol／L葡萄糖，5mmol／L磷酸二氫鉀，2mmol／LMgCl2，2mmol／LADP等。(2)己糖激酶，用0.25mol／L蔗糖，10mmol／LTris·HCI緩沖液，pH7.5配成20單位／20μl的溶液。(3)磷酸測(cè)定：10％三氯醋酸(TCA)，Pi儲(chǔ)備液，3mmol／LKH2PO4，用0.1mol／LH2SO4為溶劑；ANSA試劑，10.5g氨基萘磺酸和30gNaHSO3·7H20溶于250ml蒸餾水。避光，冷藏保存。2.方法關(guān)鍵是反應(yīng)混合物要不斷充氣。一般用恒溫水浴搖床即可滿足要求，其速度為90轉(zhuǎn)／min。用閃爍瓶或小的細(xì)頸瓶作反應(yīng)容具。(1)如表所示步驟加入各試劑后，在30℃表12-8AW合成測(cè)定的加樣方案測(cè)定項(xiàng)目緩沖液糖激酶線粒體制備物H2O底物空白1ml20μl50μl30μl—對(duì)照1ml20μl50μl30μl10μl測(cè)定1ml20μl50μl(2)10min后終止反應(yīng)，取20μl進(jìn)一小塑料管，再加200μl10％TCA，混勻，離心5min．(3)取100μl上清液加人一試管中，再加3ml蒸餾水，0.3ml鉬酸銨，充分混勻，加0.2mlANSA試劑，混勻，10min后，在750nm處測(cè)定其光密度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線(0～0.8μmol／LPi)，計(jì)算出Pi的含量。在對(duì)照或測(cè)定管與空白管中Pi含量的差值，即為Pi轉(zhuǎn)變或ATP的量。結(jié)果表示:nmolATP／(mg蛋白·min)。對(duì)于肝臟線粒體底物琥珀酸或丙酮酸加蘋果酸的正常值分別為300和100nmolATP／(mg蛋白·min)。生物膜的制備與其性質(zhì)的研究方法一、大鼠肝細(xì)胞膜的制備其基本原理是將肝組織在含有Ca2+離子的低滲碳酸氫鈉緩沖液中溫和勻漿，使細(xì)胞膜保持較大的膜片；其次，應(yīng)用低速離心使細(xì)胞膜片與細(xì)胞核一起從勻漿中分離，再利用細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間的密度差異，用密度梯度離心將細(xì)胞膜從低速離心獲得的粗核部分中分離出來。(一)試劑含有1．0mmol／LNaHCO3的緩沖液，pH7.5；0.5mmol／LCaCl2的1.0mmoL／LNaHCO3緩沖液；蔗糖溶液濃度分別為70％，45％，41％和37％，0.85％NaCl溶液。(二)儀器設(shè)備制備型超速離心機(jī)，Potter勻漿器(三)操作步驟將大鼠禁食12-24h后，斷頭處死，盡量放干凈血液，迅速取出肝臟，隨即用預(yù)冷的生理鹽水洗滌數(shù)次，盡量除去殘留的血液。稱重、剪碎，于1.0mmol／L碳酸氫鈉緩沖液pH7.5，內(nèi)含0.5mmol／LCaCl2(簡稱緩沖液A)內(nèi)進(jìn)行勻漿，肝勻漿濃度為10％。然后，用緩沖液A將勻漿稀釋10倍，攪拌、靜置。經(jīng)雙層尼龍布過濾后，按圖所示操作(0-4℃在差速離心分離所得的沉淀中，加入70％(W／W)的蔗糖溶液，把比重調(diào)至1.22，轉(zhuǎn)移至超速離心管中。在其上依次鋪加45％(W／W)、41％(W／W)和37％(W／W)的蔗糖溶液，形成不連續(xù)的蔗糖密度梯度。在超速離心100000g，120min。超速離心結(jié)束后，收集41％與37％蔗糖溶液界面的致密沉淀。用1.0mmol／L碳酸氫鈉緩沖液，pH7.5，洗滌，以除去蔗糖，即獲得肝細(xì)胞膜制備物。(四)鑒定應(yīng)用最廣泛的是利用膜上酶的活力，作為標(biāo)志來鑒定膜的分離情況。肝細(xì)胞膜的標(biāo)志酶有5’-核苷酶、Na+、K+—二、紅細(xì)胞膜的制備紅細(xì)胞取材方便，結(jié)構(gòu)簡單，均一性好。人紅細(xì)胞去除血紅蛋白后即得血影，即紅細(xì)胞膜。研究紅細(xì)胞膜時(shí)有三種模式系統(tǒng)可供選擇：洗滌過的完整紅細(xì)胞膜再封血影(resealedghost)及封閉的紅細(xì)胞膜囊泡。(一)紅細(xì)胞膜常用的制備方法是在低滲條件下脹破紅細(xì)胞，離心20000g。洗滌去除血紅蛋白，即獲紅細(xì)胞膜。此種膜最接近整體系統(tǒng)(invivo)，但它不能控制細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的環(huán)境；在應(yīng)用上有一定的局限性。此外，低滲制備的紅細(xì)胞膜雖然去除了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)，但膜的封閉性差；有許多泄漏的空穴。(二)再封血影近年來發(fā)現(xiàn)在一定條件下，脹破了的紅細(xì)胞可以重新封閉，對(duì)K+等離子不通透，給研究紅細(xì)胞膜提供了一模式。其制備的方法有：1.血影的低滲液中加入濃鹽溶液，成為等滲溶液，置于37％溫育20min，期間可緩慢地?cái)嚢?次，可得一定比例的再封血影。2.將低滲脹破的紅細(xì)胞在0℃條件下，過Bio-gdA柱，柱上的1／3pH為7.6，以利膜與血紅蛋白分離，下2／3pH為6.0，有利于隨后紅細(xì)胞空泡的重新封閉，當(dāng)膜從柱上流出后即用3Mol／LKCl。調(diào)節(jié)為等滲液，即150mmol／LKCI濃度。在37(三)封閉的紅細(xì)胞膜囊泡有時(shí)為了深入研究，將膜的內(nèi)、外層翻過來。1.正常定向囊泡的制備在制備好的血彰液混懸內(nèi)加入0.1mmol／LMgSO4溶液，使細(xì)胞產(chǎn)生胞吐作用(exocytosris)，用滴管輕輕吹打，即獲正常定向的囊泡，即與紅細(xì)胞膜內(nèi)外側(cè)相同的囊泡。2.內(nèi)翻泡(inside-outvesicles)在制備好的血影液混懸內(nèi)，加入0.5nmol／L磷酸鈉緩沖液，pH8.0，在低溫條件下1h。細(xì)胞在此條件下，產(chǎn)生吞服作用(endoeytosis)，膜上出現(xiàn)許多小囊泡，用滴管吸或用注射器上下吸打，即獲內(nèi)翻泡。它是雙分子層結(jié)構(gòu)；其內(nèi)、外層正好與血影膜相反。三、脂質(zhì)體的制備脂質(zhì)體(1iposome)是雙層脂質(zhì)包圍一些水溶液的小滴，呈球形。它是最常用的人工膜之一?，F(xiàn)在有條件將脂質(zhì)體制備成單層，直徑為25-30nm左右，它是較為理想的生物膜模擬系統(tǒng)。(一)大脂質(zhì)體制備將適量的磷脂溶于氯仿等有機(jī)溶劑，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至干，使玻璃壁上附有一層極薄的磷脂膜，然后加水溶液，并振搖，即可形成直徑lnm左右的多層大脂質(zhì)體。(二)單層脂質(zhì)體的制備1.最簡單的方法是將上述大脂質(zhì)體用超聲波處理，可獲直徑為20-50nm的脂質(zhì)體。其不足之處是超聲波可影響有些分子的結(jié)構(gòu)與功能。2.微量注射法將磷脂的乙醇溶液在一定壓力下經(jīng)小號(hào)注射器針頭，注入緩沖液中，得到各種大小的脂質(zhì)體，此法簡單、容易重復(fù)和大量制備。3.去垢劑法卵磷脂經(jīng)膽酸鈉溶解后，過SephadexG-50柱，除去膽酸，可獲直徑為30nm的脂質(zhì)體。如需獲得大小均—的脂質(zhì)體，可用超速離心或Sepharose2B凝膠過濾來處理，超速離心法比較節(jié)省時(shí)間，且可獲濃度較高的脂質(zhì)體溶液。凝膠過濾法較為簡單，但會(huì)被稀釋或因吸附而丟失。四、大鼠腦突觸體膜的制備其基本原理是將腦組織在預(yù)冷的0.32mol／L蔗糖溶液中進(jìn)行勻漿，再利用腦突觸體膜的蛋白質(zhì)與脂的比例、電荷性質(zhì)、顆粒大小、形狀等不同于其它的細(xì)胞器膜進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，將其分離出來。(一)試劑與儀器不同濃度的蔗糖溶液，0.32mol／L、0.8mol／L及1.2mol／L等；50moL／LTris醋酸緩沖緩液，pH7.2。制備型超速離心機(jī)、低溫高速離心機(jī)和Potter勻漿器。(二)操作步驟選用健康成年大鼠，體重200~250g，斷頭放血處死動(dòng)物，迅速取出大腦，并立即在冰盤上剝離大腦皮層部分，投入冰冷的0.32mol／L蔗糖溶液中，冰浴中用Potter勻漿器制備勻漿(1000rpm，上下15個(gè)沖程)，所得勻漿按示意圖操作。經(jīng)上述操作，可獲完整的突觸體膜結(jié)構(gòu)。此法需要超速離心機(jī)，有時(shí)需克服滲透壓梯度的影響，常用葡聚糖作為替代蔗糖的離心介質(zhì)。五、對(duì)生物膜的生物化學(xué)性質(zhì)的研究方法(一)生物膜上結(jié)合酶的測(cè)定方法膜結(jié)合酶是膜蛋白質(zhì)重要組成部分之一，研究較為深入的是Na+,K+—ATPase。本節(jié)僅介紹此酶的測(cè)定方法。1.比色法其基本原理是三磷酸腺苷(ATP)經(jīng)ATPase的催化水解，成為二磷酸腺苷(ADP)和無機(jī)磷酸。通過測(cè)定所生成的無機(jī)磷酸的量，可間接測(cè)定ATPase的活性。Na+,K+-ATPase可被G-毒毛旋花苷(ouabain)抑制，先測(cè)出總ATPase活性，再測(cè)出用毒毛旋花苷-G抑制的ATPase活性，兩者之差即為Na+,K+—ATPase活性。此法一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行，其靈敏度有時(shí)難以滿足研究的需要。因?yàn)?，無機(jī)磷酸是在酸性條件下，與鉬酸試劑生成磷鉬酸，磷鉬酸經(jīng)還原后可形成鉬蘭，按顏色有深淺，在660nm處比色測(cè)定，計(jì)算無機(jī)磷酸的量。2.生物發(fā)光法其原理是利用ATP、蟲熒光素和蟲熒光素酶形成腺苷酸—蟲熒光素酶復(fù)合物而發(fā)光，其生物發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度成正比。當(dāng)反應(yīng)液中，ATPase與ATP作用—定時(shí)間，測(cè)定ATP的消耗量，即測(cè)出ATPase活性。同時(shí)測(cè)定經(jīng)C—毒毛旋花苷抑制Na+,K+-ATPase后的剩余ATPase活性，兩者之差即是Na+,K+-ATPase的活性。生物發(fā)光法的靈敏性和準(zhǔn)確性均高于比色法，它可測(cè)出ATP的nmol／L級(jí)濃度，但需要一定的儀器設(shè)備，如生物發(fā)光計(jì)或液體閃爍計(jì)數(shù)儀。(二)膜脂質(zhì)過氧化的檢測(cè)方法膜脂質(zhì)過氧化是指膜成分中多不飽和脂肪酸的過氧化，是機(jī)體損傷的形式之一。從膜脂質(zhì)過氧化角度探討外源化學(xué)物的毒性作用，是目前毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。檢測(cè)膜脂質(zhì)過氧化的方法可分為三類：氧耗的測(cè)定；羥基過氧化物的檢測(cè)；脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的檢測(cè)。本節(jié)僅對(duì)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的檢測(cè)方法加以敘述。1.硫代巴比妥酸(TBA)法TBA法的原理是脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物之一一丙二醛(MDA)，可以與硫代巴比妥酸成色。在520nm處進(jìn)行比色測(cè)定，可檢測(cè)丙二醛相對(duì)含量的變化，以了解生物膜質(zhì)過氧化的情況。TBA法是一非常簡便的方法，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。此法與熒光法、化學(xué)發(fā)光法等有較好的相關(guān)性，但不足之處是靈敏度較差，某些因素應(yīng)加以控制，如線粒體污染，樣品中的鐵離子等。2.熒光法原理是脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物丙二醛可與體內(nèi)蛋白質(zhì)、氨基酸發(fā)生反應(yīng)，形成Schiff堿。它因有N—C=C—C=N結(jié)構(gòu)面具有熒光，利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光的相對(duì)強(qiáng)度，可間接反映生物膜的脂質(zhì)過氧化水平。此法靈敏度高，約比TBA靈敏10-100倍，且可反映脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛與體內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用，其不足之處在于熒光沒有適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品，一般測(cè)定的是相對(duì)水平，應(yīng)設(shè)立對(duì)照組。3.其他整體水平上進(jìn)行脂質(zhì)過氧化研究的方法，即從動(dòng)物的呼出氣中檢出不飽和脂質(zhì)過氧化形成的揮發(fā)性烴類或乙烷或戊烷的濃度，計(jì)算出脂質(zhì)過氧化的水平。此法的優(yōu)點(diǎn)是非創(chuàng)傷性檢測(cè)。較為靈敏的檢測(cè)方法是化學(xué)發(fā)光法，它是測(cè)定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的自由基，尤其是鏈鎖反應(yīng)終止階段產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)羰基，其靈敏度高。不足之處是需較特殊儀器的化學(xué)發(fā)光儀或液體閃爍計(jì)數(shù)儀。六、對(duì)膜的生物物理性質(zhì)研究方法(一)膜流動(dòng)性膜流動(dòng)性指膜中脂質(zhì)分子和蛋白分子的運(yùn)動(dòng)。生物膜的流動(dòng)性是膜的生物學(xué)功能所必須的，膜流動(dòng)性與細(xì)胞功能如細(xì)胞生長、分化、受體功能和酶功能、膜融合等有著一定的關(guān)系。許多外源化學(xué)物可通過改變膜的正常流動(dòng)性而引起細(xì)胞損傷。1.膜脂流動(dòng)性(1)熒光偏振法：原理是用熒光標(biāo)記分子l,6-二苯基-1,3,5-己三烯(1,6-diphenyl-1,3,5-hexatrie,DPH)或8-苯氨基-1-萘磺酸鹽(8-anili-1-naphthalenesulfonate，ANS)先將膜標(biāo)記。DPN是測(cè)定膜疏水區(qū)流動(dòng)性的標(biāo)記分子。ANS有流動(dòng)性，也能和蛋白質(zhì)成非共價(jià)結(jié)合，它是反映膜表面性質(zhì)變化的標(biāo)記分子。DPH是一種扁平長形分子，在膜脂質(zhì)雙層中，因疏水環(huán)境，其熒光強(qiáng)度明