高效液相色譜課件

高效液相色譜highperformanceliquidchromatographHPLC2023/9/20高效液相色譜highperformanceliquid1內(nèi)容摘要概述特點(diǎn)工作流程主要部件主要分離類型及原理制備型液相色譜2023/9/20內(nèi)容摘要概述2023/8/62概述

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。2023/9/20概述高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年3特點(diǎn)高壓：150-350*105Pa高效：大于30000塔板/米高靈敏度：10-9g（紫外檢測）、10-11g（熒光檢測）高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。高效液相色譜采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備如下特點(diǎn)：2023/9/20特點(diǎn)高壓：150-350*105Pa高效液相色譜4工作流程2023/9/20工作流程2023/8/65主要部件高壓輸液泵壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性。2023/9/20主要部件高壓輸液泵2023/8/66梯度淋洗（洗脫）裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2023/9/20梯度淋洗（洗脫）裝置外梯度:內(nèi)梯度:2023/87進(jìn)樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2023/9/20進(jìn)樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，2023/88高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2023/9/20高效分離柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～69液相色譜檢測器

a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容積8μL）；

對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

2023/9/20液相色譜檢測器a.紫外檢測器2023/8/610b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2023/9/20b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要11c.示差折光檢測器

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；2023/9/20c.示差折光檢測器除紫外檢測器之外應(yīng)用12d.熒光檢測器

高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；2023/9/20d.熒光檢測器高靈敏度、高選擇性；202313液-固吸附色譜液-液分配色譜離子交換色譜離子色譜離子對(duì)色譜排阻色譜親和色譜(AC)主要分離類型及基本原理2023/9/20液-固吸附色譜主要分離類型及基本原理2023/8/614液-固吸附色譜

固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；2023/9/20液-固吸附色譜固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧15

液-液分配色譜

固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；

基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；

流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。2023/9/20液-液分配色譜固定相與流動(dòng)相均為液體（互16離子交換色譜

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；

流動(dòng)相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。2023/9/20離子交換色譜固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離17離子色譜

離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一種技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。2023/9/20離子色譜離子色譜是在20世紀(jì)70年代18離子對(duì)色譜

原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；

陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子；

陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子；

反相離子對(duì)色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對(duì)離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)Y+

X-后；在兩相間分配。2023/9/20離子對(duì)色譜原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電19

排阻色譜

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離2023/9/20排阻色譜固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)20親和色譜(AC)

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。2023/9/20親和色譜(AC)原理：利用生物大分子和固定相21HPLC的應(yīng)用HPLC適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定易分解的、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物；生物活性物質(zhì)和多種天然產(chǎn)物；合成的和天然的高分子化合物等。它們涉及石油化工產(chǎn)品、食品、合成藥物、生物化工產(chǎn)品及環(huán)境污染物等，約占全部有機(jī)化合物的80%。其余20%的有機(jī)化合物，包括永久性氣體，易揮發(fā)低沸點(diǎn)及中等分子量的化合物，只能用氣相色譜法進(jìn)行分析。2023/9/20HPLC的應(yīng)用HPLC適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定易22

環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動(dòng)相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測器：差示折光檢測器

可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。2023/9/20環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析可對(duì)水果、23稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動(dòng)相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器2023/9/20稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。固定相：十24制備型液相色譜