DNA全長(zhǎng)測(cè)序?qū)嶒?yàn)報(bào)告

cDNA全長(zhǎng)測(cè)序RNA提取實(shí)驗(yàn)用品Trizol、氯仿、異丙醇、乙醇（75%，現(xiàn)用現(xiàn)配）、RNase—free水、大量酒精、冷凍離心機(jī)、1ml、200微升、10微升槍及槍頭、EP管、研缽、剪刀、藥匙、衛(wèi)生紙、冰盒、口罩、手套、工作服、棉手套、計(jì)時(shí)器實(shí)驗(yàn)步驟選活力良好的貽貝，迅速剪入研缽中（盡量剪碎），加入液氮，迅速研磨成粉末狀（研缽中可以事先加入液氮預(yù)冷）。粉末狀后迅速加入1mlTrizol，研磨均勻呈液體狀，0℃向1mlTrizol中加入0.2ml氯仿，用力振蕩15s（渦旋），室溫放置3min，4℃12000g將上層水相（約500微升）移至一干凈的EP管中，加入等體積（約600微升）異丙醇，混勻，輕輕顛倒幾下，-20℃放置10min。4℃小心棄上清（直接倒，然后反扣到干凈的衛(wèi)生紙上），加入1ml75%乙醇，并混合樣品（要使樣品懸浮起來(lái)），4℃12000g重復(fù)步驟5，最后空轉(zhuǎn)一下，用槍盡量吸去剩余的酒精（在超凈工作臺(tái)上操作）。通風(fēng)廚（工作臺(tái)）中干燥，聞不到酒精味即可（2-10min），加30-50微升（50微升）DEPC水，室溫20min，使RNA徹底溶解。0.1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)（膠槽，膠板用酒精擦干凈，換新鮮電泳液），140V電泳10min檢測(cè)。（99V，33min）。紫外檢測(cè)，RNA溶液立即-70℃（動(dòng)作要迅速，冰上操作，試驗(yàn)前準(zhǔn)備要充分）以下｛｝中的可以不操作｛組織樣品中總RNA中DNA的消除：（1）無(wú)RNA酶活性的DNase1（5u/uL）2uLRNaseInhibitor（40u/uL）0.5uL10×DNasebuffer5uL總RNA20-50uLDEPC水補(bǔ)充到50uL（2）37℃（3）加入50uLDEPC水（4）加入100uL（等量）的苯酚\氯仿\異戊醇25：24：1充分混勻（5）離心，取上層（水層）移至另一微量離心管中（6）加入10uL（1/10量）的3MNaOAC（PH=5.2）（7）加入250uL的冷無(wú)水乙醇，-20℃（8）離心回收沉淀，用70%的冷無(wú)水乙醇清洗沉淀，真空干燥（9）用適量的DEPC水溶解，電泳確認(rèn)DNase1消化總RNA1-6uLBuffer1uL（RQ/RNase-Free10×ReactionBuffer）DNase2uL（RQ/RNase-FreeDNase）RNaseE抑制劑0.5uLor1uLNuclease-Free水調(diào)至10uL37℃每個(gè)體系中加入1uLstopsolution65℃反轉(zhuǎn)錄變性0.2mlPCR管中依次加入總RNA（處理過(guò)的）1-2ugoligo(dT)2uL70℃反轉(zhuǎn)錄在已完成變性反應(yīng)的PCR管中依次加入5×M-MLV反應(yīng)緩沖液5uL無(wú)RNase的dNTP（2.5mM）5uL最后加RNaseE抑制劑1uL（2.5u）M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1uL（200u）無(wú)RNase水調(diào)節(jié)總體積至25uL輕彈管壁稍離心42℃反轉(zhuǎn)錄1h95actin檢驗(yàn)cDNA內(nèi)參引物—actionR（反）ActionF（正）體系：10×Buffer（promega）2.5uL——事先4Mgcl2（25mMpromega）1.5uL——事先4dNTP（2.5mMeach）2.0uL正向引物（10mMF）1.0uL反向引物（10mMR）1.0uLTaqDNApolymerase(5u/uLTakara)0.2uLPCR水15.8uLcDNA1.0uLn管cDNA檢測(cè)：準(zhǔn)備n個(gè)新小EP管，分別從反轉(zhuǎn)錄完的n個(gè)小離心管中吸取1uL到新EP管中，并把剩余的cDNA-20℃條件：94℃20×94℃60℃72℃72℃4℃四、3’—RACE一擴(kuò)體系：10×Buffer2.5uLMgcl2（25mM）1.2uLdNTP(2.5mM)2.0uLU0.5水17.05cDNA(模板)1Taq0.25F(F1)（引物）0.5uL/管條件：94℃10×94℃60-56℃72℃20×94℃56℃72℃72℃16℃二擴(kuò)體系：（5uL一擴(kuò)產(chǎn)物稀釋100倍，即加495uL水，到500uL）10×Buffer2.5uLMgcl2（25mM）1.2uLdNTP(2.5mM)2.0uLU0.5水17.05Taq0.25F(F1)0.5uL/管稀釋后的模板1uL/管條件：94℃30×94℃56℃72℃72℃10min16五、電泳檢測(cè)（一）制膠一般，0.5g瓊脂糖+50mL配電溶液微波爐溶解冷卻后加10uLgenefinder混勻點(diǎn)樣一般，5uL樣品ormarker加到1uL預(yù)染液上預(yù)染液的配制：genefinder/loadingBuffer=1/9條件90-110V25-30min——？六、切膠純化1.計(jì)算膠體積0.1g—0.1ml×P250℃溶解7min至完全溶解（一般加200uL×P22.搖晃2-3min3.溶解膠加入吸附柱中（700uL以?xún)?nèi)）（吸附柱和EP管搭配使用）10000g離心1min棄液體4.加300uL×P210000g離心1min棄液體5.加700uLspw洗液10000g離心1min棄液體6.重復(fù)57.空轉(zhuǎn)13000g2min晾干酒精8.吸附柱放入干凈的EP管中，加30-50uLElutionBuffer（EB）室溫放置1min,13000g1min（注：加到白色區(qū)域，不能加到不壁上）9.洗脫下來(lái)的EB重新加入吸附柱內(nèi)，重復(fù)8（最后要的是EP管中的）七、連接（一）DNA2uL載體0.5uLSolution12.5uL（二）—常用DNA4uL（PCR純化的產(chǎn)物）載體0.5uL（PMD18—Tsimple載體最后加且加到液面以下）Solution12.5uL（連接液1）16℃2h16℃pause（八、轉(zhuǎn)化（開(kāi)水浴鍋）1.感受態(tài)細(xì)胞冰上化開(kāi)（100uL）2.10uL連接產(chǎn)物加到感受態(tài)細(xì)胞中（加在液面以下），彈勻不要?jiǎng)×覔u晃3.冰上放置30min4.42℃5.加入600uLLB培養(yǎng)基（無(wú)Amp）（100uL感受態(tài)—600uLLB）6.37℃搖床45min220rpm(先慢后快170rpm約10min)7.涂布平臺(tái)紫外滅菌開(kāi)照明吹風(fēng)點(diǎn)酒精燈涂布棒95%酒精酒精燈上消毒平板蓋上冷卻直到燙不化培養(yǎng)基為止先將菌液滴在LB固體培養(yǎng)基上，涂布棒涂均勻8.37℃9.4℃10.挑菌（飽滿(mǎn)單個(gè)白斑）一個(gè)基因挑8個(gè)克隆分別加在1ml含Amp的LB液體培養(yǎng)基中11.培養(yǎng)3-4hor1h3