基因工程-DNA重組

1第一節(jié)DNA重組的基本原理第二節(jié)工具酶第三節(jié)DNA分子的片段化第四節(jié)DNA片段的體外連接第二章DNA重組2生物技術(shù)工程:基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程與發(fā)酵工程等。目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA；②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）?；蚬こ?geneticengineering)

——實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。第一節(jié)DNA重組的基本原理3應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)。

DNA重組原理4DNA重組：不同的DNA分子間發(fā)生共價(jià)連接形成重組DNA分子。重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段5發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。同源重組6限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶

DNA修飾酶

DNA連接酶核酸外切酶單鏈DNA內(nèi)切酶第二節(jié)工具酶7重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無(wú)53

外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基8一、限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4—8bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。（Restrictionendonuclease）（一）限制性內(nèi)切酶的定義GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ9一把特殊的剪刀

——限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。10DNA限制性內(nèi)切酶112.性質(zhì)內(nèi)切酶。原核生物。即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。自我保護(hù)作用。3.功能細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1.來(lái)源12限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制（Restriction）13細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。（2）修飾（Modification）①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二個(gè)C上C5位置上引入甲基1415I型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。（二）限制性內(nèi)切酶的類型II型限制性內(nèi)切酶III型限制性內(nèi)切酶16首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌B株和K株分離的。（1）識(shí)別位點(diǎn)序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性內(nèi)切酶如EcoB和EcoK。未甲基化修飾的特異序列。17需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用機(jī)理在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約1000—1500bp處隨機(jī)切開一條單鏈。Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位點(diǎn)18首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來(lái)。（1）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。與DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)。2.II型限制性內(nèi)切酶分離的第一個(gè)酶是HindⅡ。19Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

形成末端：平齊末端、粘性末端GGATCCCCTAGG20EcoRI5ˊ-G

AATTC-3ˊ

3ˊ-CTTAA

G-5ˊPstI5ˊ-CTGCA

G-3ˊ

3ˊ-G

ACGTC-5ˊ

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5ˊ-GAT

ATC-3ˊ3ˊ-CTA

TAG-5ˊ

產(chǎn)生平齊末端（2）切割位點(diǎn)切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識(shí)別位點(diǎn)處。21（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5ˊ端凸出（如EcoRI切點(diǎn)）G

AATTC

CTTAA

GGAATTCCTTAA

G5ˊ

--3ˊ3ˊ

--5ˊ5ˊ

--3ˊ3ˊ

--5ˊ22CTGCA

G

②3ˊ端凸出（如PstI切點(diǎn)）G

ACGTC5ˊ

--3ˊ3ˊ

--5ˊ5ˊ

--3ˊ3ˊ

--5ˊCTGCAG

GACGTC23

①連接便利（4）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。2425③補(bǔ)平成平齊末端凸出的3ˊ端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5ˊ末端標(biāo)記凸出的5ˊ末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。26識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。（5）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5ˊ

-A

AGCTT-3ˊ

3ˊ

-TTCGA

A-5ˊHsuI5ˊ

-A

AGCTT-3ˊ

3ˊ

-TTCGA

A-5ˊ27GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ2829XmaI5ˊ

-C

CCGGG-3ˊ

3ˊ

-GGGCC

C-5ˊSmaI5ˊ

-CCC

GGG-3ˊ3ˊ

-GGG

CCC-5ˊ識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：30識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（6）同尾酶(Isocaudamers）5ˊ

-G

GATCC-3ˊ

3ˊ

-CCTAG

G-5ˊBamHIBclI5ˊ

-T

GATCA-3ˊ

3ˊ

-ACTAG

T-5ˊ

5ˊ

-A

GATCT-3ˊ

3ˊ

-TCTAG

A-5ˊBglⅡ5ˊ

-U

GATCY-3ˊ

3ˊ

-YCTAG

U-5ˊ

XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。315ˊ

-

GATC----3ˊ

3ˊ

----CTAG

-5ˊ

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來(lái)的酶識(shí)別。？5ˊ

-G3ˊ

-CCTAGGATCT-3ˊ

A-5ˊBamHIBglⅡ5ˊ

-GGATCT-3ˊ

3ˊ

-CCTAGA-5ˊBamHIBglⅡSau3A3233限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。（7）限制酶的酶活性如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專一性和切割效率，稱為星號(hào)（*）活性。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。①星號(hào)（*）活性34EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時(shí)可識(shí)別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時(shí)候要特別注意！353.Ⅲ型限制性內(nèi)切酶在完全肯定的位點(diǎn)切割DNA，但反應(yīng)需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG36核酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性特性I型內(nèi)切酶II型內(nèi)切酶III型內(nèi)切酶限制和修飾活性單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特異性位點(diǎn)識(shí)別序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG37切割位點(diǎn)在距離識(shí)別位點(diǎn)至少1000bp處隨機(jī)切開一條單鏈。位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近距寄主特異性位點(diǎn)3‘端24—26bp處酶催轉(zhuǎn)換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)識(shí)別未甲基化的序列進(jìn)行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無(wú)用十分有用381973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：（三）限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。394.

限制酶前面要帶上R（Restriction)，修飾酶前面要帶上M（Modification）。（現(xiàn)已省略）。2.

用一個(gè)右下標(biāo)的大寫字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。3.

如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬數(shù)字表示。如EcoRI，EcoRV。40第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。Hin

dⅢ屬

系

株序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶41DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。1.DNA的純度（四）影響限制性內(nèi)切酶活性的因素①純化DNA②加大酶的用量③延長(zhǎng)保溫時(shí)間④擴(kuò)大反應(yīng)體積（>20

l）一般采取42大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCATGG的C）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木?。43不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求25-65oC。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.溫度44是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)緩沖液的化學(xué)組成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。45（五）限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化1.內(nèi)切酶與識(shí)別序列的結(jié)合模式1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。GAATTCCTTAAG46內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開。2.完全消化1234123447只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開。通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。3.局部消化12341448大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活?；蛴靡掖汲恋鞤NA。4.限制酶酶切反應(yīng)的終止5.幾種常用限制酶識(shí)別位點(diǎn)4950（一）基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶7.TaqDNA聚合酶二、DNA聚合酶511.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加上千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來(lái)。有幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來(lái)。（二）常用的DNA聚合酶的特點(diǎn)持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。52DNA聚合酶3’

5’外切酶活性5’

3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無(wú)中低T4DNA聚合酶高無(wú)中低T7DNA聚合酶高無(wú)快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無(wú)快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無(wú)無(wú)快高逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)無(wú)低中TaqDNA聚合酶無(wú)有快高3.常用DNA聚合酶的特性比較53（三）DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I主要用來(lái)制備帶放射性標(biāo)記的DNA探針。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的性質(zhì)①一條單鏈多肽。②5ˊ

3ˊ外切酶活性位于N端。③用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5ˊ

3ˊ外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。54①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③帶有3’—OH游離端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反應(yīng)條件-OH5ˊ3ˊdNTPs55標(biāo)記①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標(biāo)記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制備探針已知序列的核酸片斷顯示位置與互補(bǔ)的待測(cè)序列雜交56標(biāo)記已知序列的核酸片斷②探針的標(biāo)記方式標(biāo)記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5ˊ3ˊ57③DNA聚合酶I對(duì)探針序列的標(biāo)記切口轉(zhuǎn)移法(nicktranslation)：放射性同位素標(biāo)記：DNA聚合酶I同時(shí)具備5ˊ

3ˊ外切酶活性和5ˊ

3ˊ的聚合酶活性（以及3ˊ

5ˊ外切酶活性）。585ˊ

3ˊ外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5ˊ端除去一個(gè)核苷酸后，聚合酶活性就會(huì)在切口的上一段DNA的3ˊ一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。切口切口5ˊ5ˊ3ˊ3ˊ5ˊ3ˊ5ˊ3ˊ59純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈切口DNAPolI進(jìn)行切口轉(zhuǎn)移一種

-32P-dNTP5ˊ5ˊ5ˊ5ˊ5ˊ5ˊ5ˊ5ˊ3ˊ3ˊ3ˊ3ˊ3ˊ3ˊ3ˊ3ˊ32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標(biāo)記602.Klenowfragment具有5’

3’聚合酶活性和3’

5’外切酶活性。（失去了5’

3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質(zhì)DNAPolI

Klenowfragment(76KD）枯草桿菌蛋白酶61①3’端補(bǔ)平5’5’klenow②DNA3’末端標(biāo)記補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。klenow（2）主要用途623’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種

-32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA限制性內(nèi)切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI

-32P-dATP

-32P-dGTP25oC1h63③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物64（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)3.T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。有5’

3’聚合酶活性和3’

5’外切酶活性（降解單鏈更快）。①來(lái)源②酶活性65③特點(diǎn)當(dāng)沒有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶行使3’

5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。665’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無(wú)dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’67（2）T4DNA聚合酶的用途標(biāo)記末端（取代合成法）用3’

5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’

3’聚合酶活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記的dNTP。①補(bǔ)平隱蔽末端②DNA3’末端標(biāo)記68酶切中間產(chǎn)生兩個(gè)末端標(biāo)記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’

5’外切）DNA酶切片斷T4DNA聚合酶（5’

3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’內(nèi)切酶切無(wú)dNTPs694.T7DNA聚合酶（1）來(lái)源從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來(lái)的，由兩個(gè)亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基：有5’

3’聚合酶和3’

5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：增加大亞基對(duì)模板的親和性。70（2）T7DNA聚合酶的特點(diǎn)①持續(xù)合成能力強(qiáng)一旦與模板結(jié)合就會(huì)不間斷地合成互補(bǔ)鏈。②3’

5’外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙。71②進(jìn)行末端標(biāo)記①以大分子量DNA為模板的合成如M13③補(bǔ)平隱蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法標(biāo)記3’末端。與T4DNA聚合酶相同。合成補(bǔ)平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。725.修飾后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾去除3’

5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7DNA聚合酶的用途①DNA測(cè)序：雙脫氧法；②標(biāo)記DNA3’隱蔽末端；③更有效地補(bǔ)平末端。736.逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來(lái)源于鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。（1）來(lái)源RNA腫瘤病毒。（2）AMV的性質(zhì)由

和

兩條多肽鏈組成。74①

鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和RNaseH活性。RNaseH：

鏈經(jīng)過蛋白酶水解后產(chǎn)生的一條多肽。以5’

3’或3’

5’方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA75（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途②

鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5’

3’DNA外切酶活性。①合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA76②合成DNA探針用隨機(jī)引物（randomprimer）或oligodT做引物。隨機(jī)引物：隨機(jī)順序形成的寡聚DNA片斷。7.TaqDNA聚合酶77（一）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1.來(lái)源小牛胸腺。2.組成大小兩個(gè)亞基。3.特性（1）5’

3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）三、DNA修飾酶78②不需要模板?、傩枰?’—OH、二甲砷酸緩沖液。③底物可以是單鏈DNA、是3’—OH突出的雙鏈DNA。④隨機(jī)添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP，末端轉(zhuǎn)移酶79（2）再生酶切位點(diǎn)便于回收克隆片斷。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow補(bǔ)平80AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGAAGCTTTTTTCGAA末端轉(zhuǎn)移酶dTTPAAAAAA外源DNA81（3）非放射性標(biāo)記DNA片斷的3’端AAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位點(diǎn)HindⅢ位點(diǎn)連接催化非放射性標(biāo)記物參入DNA片斷的3’端。82（二）T4多核苷酸激酶1.來(lái)源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來(lái)。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2.功能催化

磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。835’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的

磷酸帶有32P標(biāo)記，就會(huì)被轉(zhuǎn)移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。843.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標(biāo)記DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(

-32P)ATP多核苷酸激酶3’P--OH5’3’HO--P5’堿性磷酸酶（1）正向反應(yīng)（forwardreaction）85（2）交換反應(yīng)標(biāo)記法反應(yīng)混合物中具有超量(

-32P)ATP和ADP時(shí)，多核苷酸激酶能催化(

-32P)ATP的

-32P與DNA5’端的磷酸交換。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(

-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反應(yīng)效果不理想。86（三）堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來(lái)。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）細(xì)菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來(lái)。具有抗熱性。SDS中加熱68oC可完全失活。872.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH堿性磷酸酶3.堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體分子自我連接88單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A堿性磷酸酶5’5’5’89A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能與脫磷酸的載體OH連接。9091ATTCGAAGCTTAAGCTTAATTCGA連接酶-OH與-OH連不住其中每條鏈上都有一個(gè)nick，但轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會(huì)被修復(fù)。3’P-AGCTTA-OH5’3’HO-ATTCGA-P5’外源DNA92從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。（一）DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷口。四、DNA連接酶93（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。（二）DNAligase的特點(diǎn)（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。94（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量動(dòng)物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件951.ATP（NAD+)提供激活的AMP。（三）連接反應(yīng)的機(jī)理2.ATP與連接酶形成共價(jià)“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。3.AMP與連接酶的賴氨酸

-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi964.AMP隨后從連接酶的賴氨酸

-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP975.3’-OH對(duì)磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，釋放出AMP。98連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37

C。（四）連接反應(yīng)的溫度1.最佳溫度但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。2.實(shí)用溫度所以一般采用4~16

C。99增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。1.插入片段與載體的濃度比例2.反應(yīng)溫度4℃。（五）影響連接反應(yīng)的因素10~20倍。100101102是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化降解核苷酸的酶。（一）單鏈DNA外切酶1.大腸桿菌核酸外切酶I（exoI）5’

3’外切識(shí)別5’-OH2.大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’

3’、3’

5’外切識(shí)別3’-OH、5’-P五、核酸外切酶（Exonucleases）103（二）雙鏈DNA外切酶1.核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’

5’外切識(shí)別3’-OH主要用途：在DNA雙鏈的末端產(chǎn)生出單鏈區(qū)域。5’5’5’5’exoⅢ與klenow配合進(jìn)行3’端標(biāo)記-OHHO-1042.

核酸外切酶（

exo）5’

3’外切。主要用途：使DNA雙鏈變成單鏈（短）。5’P--P5’5’5’

exo成為測(cè)序模板。識(shí)別5’-P（但不能降解5’-OH）105（一）S1核酸酶1.來(lái)源稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）。2.特性（1）高度單鏈特異性（2）反應(yīng)條件①低水平Zn2+②pH4.0~4.3六、單鏈DNA內(nèi)切酶1063.S1核酸內(nèi)切酶的功能（1）催化單鏈RNA或DNA降解。（2）切掉雙鏈核酸中的單鏈區(qū)。S1S1發(fā)卡或有缺口的部位。107ATGCATGCATGCTACGTACGTACGT甚至能識(shí)別單個(gè)核苷酸的單鏈區(qū)！（3）降解限制酶切形成的單鏈突出端。1084.S1核酸酶的用途（1）定位RNADNARNAS1S1200bp400bp某限制酶切后再與RNA雜交某限制酶位點(diǎn)（參照物）內(nèi)切酶位點(diǎn)不能位于內(nèi)含子序列中！RNA109RNA位于某限制酶位點(diǎn)左200bp和右400bp。RNA位置不能配對(duì)的內(nèi)含子區(qū)域形成的單鏈環(huán)被S1切掉。mRNADNA（2）用mRNA測(cè)定基因中的外顯子序列110一、DNA分子的酶切

1.單酶切法；2.雙酶切法；3.部分酶切二、DNA分子的限制性圖譜

1.雙酶切法；2.部分酶切法第三節(jié)DNA分子的片段化111單酶切法是DNA片段化最常用的方法，用一種限制性內(nèi)切酶切割D