生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43的研究進(jìn)展

生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43的研究進(jìn)展

相關(guān)蛋白質(zhì)43（growingasykot43，簽名-43）是與神經(jīng)發(fā)育、突變形成和可塑性密切相關(guān)的磷酸細(xì)胞蛋白。周圍神經(jīng)損傷后,其含量可增加20~100倍。因其是神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的標(biāo)志性蛋白質(zhì),并在神經(jīng)損傷后修復(fù)及再生過程中作用關(guān)鍵,對(duì)其研究日漸增加,本文就GAP-43的研究進(jìn)展及其與周圍神經(jīng)再生的關(guān)系作一綜述。1與軸突生長(zhǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)的描述荷蘭科學(xué)家A.B.Oestreicher等在研究腦內(nèi)磷酸肌醇代謝時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種蛋白激酶C(PKC)的底物蛋白,命名為B-50;美國(guó)的1個(gè)實(shí)驗(yàn)室用GAP-43描述1種與軸突生長(zhǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì);另有許多學(xué)者在不同研究中分別用不同的代號(hào)表示1種新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白質(zhì),如F1為海馬神經(jīng)元持久突觸后電位相關(guān)的磷蛋白、PP46為一種神經(jīng)元生長(zhǎng)錐膜的主要磷酸化蛋白質(zhì)、P57為神經(jīng)元特異性的鈣調(diào)素蛋白,而L.I.Benowitz等通過對(duì)這些蛋白質(zhì)氨基酸順序及其生化及免疫特性的分析,證明這些命名不同的蛋白質(zhì)實(shí)際上是同一種物質(zhì),即神經(jīng)系統(tǒng)特有的膜磷酸蛋白———GAP-43,后來被統(tǒng)一稱為GAP-43或B-50。2分子質(zhì)量酶根據(jù)已經(jīng)克隆到的幾種動(dòng)物(如大鼠、小鼠、牛)和人的cDNA序列,不同物種間GAP-43的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有高度的同源性。大鼠的GAP-43由226個(gè)氨基酸殘基組成,而人的GAP-43由238個(gè)氨基酸殘基組成,其中酸性氨基酸殘基占32%,等電點(diǎn)為4.3~4.5,相對(duì)分子量為43000。它只含有1個(gè)芳香族氨基酸殘基,而Ala、Glu、Lys和Pro的含量極其豐富,二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主,整個(gè)分子呈棒狀,具有很強(qiáng)的柔韌性。氨基酸序列極富親水性,而疏水性氨基酸極少,且缺乏膜結(jié)合位點(diǎn),然而它卻以可溶性和膜結(jié)合的形態(tài)存在。從細(xì)胞水平看,它在軸突生長(zhǎng)錐的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)中含量極高,而在胞漿中含量較低。GAP-43依靠其分子氮末端的1個(gè)疏水基與質(zhì)膜上的脂肪鏈形成共價(jià)鍵而結(jié)合在質(zhì)膜的內(nèi)表面疏水端。它是蛋白激酶C的主要作用底物,經(jīng)其作用后被磷酸化,其第41位氨基酸殘基是整個(gè)分子中唯一的蛋白磷酸化酶作用位點(diǎn);其第42位的苯丙氨酸殘基與鈣調(diào)蛋白(鈣調(diào)素)有高度的親和力(以共價(jià)鍵結(jié)合)。在缺少鈣的情況下,可優(yōu)先與鈣調(diào)素結(jié)合。另外,GAP-43的磷酸化使其與鈣調(diào)素解聚,并且它還是磷酸肌醇代謝的調(diào)節(jié)物。3神經(jīng)纖維在腦或髓劍化的表達(dá)GAP-43是一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白質(zhì),廣泛分布于大腦、小腦、海馬以及脊髓、背根神經(jīng)節(jié)和自主神經(jīng)系統(tǒng)。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞均能表達(dá)GAP-43。發(fā)育中的脊髓和神經(jīng)節(jié)GAP-43的分布及其含量可較成熟神經(jīng)元高10~20倍,且主要位于生長(zhǎng)錐膜。人早期受孕6周胚胎所有發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)均有GAP-43mRNA的表達(dá),最高表達(dá)存在于分化神經(jīng)元的區(qū)域,如皮層板內(nèi);出生后1周內(nèi)達(dá)到高峰,隨后在大部分腦區(qū)內(nèi)迅速下降到成年的低水平。成年時(shí)只有少數(shù)“活躍”腦區(qū)仍保持較高的表達(dá),這些區(qū)域有:大腦皮層、海馬CA3區(qū)、嗅球、藍(lán)斑、中縫核、迷走神經(jīng)背核等,其中海馬CA3區(qū)、嗅球終身都在分化。另外,在腦或脊髓,GAP-43的分布有與神經(jīng)纖維髓鞘化呈反比的趨勢(shì)。在無髓或低髓鞘化的區(qū)域,GAP-43的表達(dá)水平高,而在髓鞘化水平高的區(qū)域如脊髓白質(zhì)及神經(jīng)纖維則不表達(dá)。此外,從發(fā)育過程中也可見GAP-43的表達(dá),如新生第5天的大鼠,脊髓髓鞘化剛開始在脊髓白質(zhì)內(nèi)可見有強(qiáng)烈而均勻的GAP-43mRNA信號(hào);在出生后第12天,髓鞘化接近成年?duì)顟B(tài),表達(dá)就明顯降低;在出生后第28天,髓鞘化已完成時(shí),則降至成年水平。4q基序?qū)a2+和鈣調(diào)素的調(diào)節(jié)作用GAP-43與膜骨架的關(guān)系及膜連接的作用。GAP-43最初在高爾基器內(nèi)與神經(jīng)元膜成分結(jié)合,以膜泡形式沿軸突以400mm·d-1的速度快速轉(zhuǎn)運(yùn),最后多聚集于軸突突觸前終末,然后通過其N端的疏水性片段緊密連接在神經(jīng)終末質(zhì)膜胞質(zhì)面,其中第3、4位的半胱氨酸與生長(zhǎng)錐膜進(jìn)行的可逆性結(jié)合可能起了重要的作用,作為一種高度親水性蛋白,GAP-43與膜結(jié)合的假想模型是其在與胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白相互作用及與膜結(jié)合這2種形式間相互轉(zhuǎn)換。質(zhì)膜內(nèi)表面的蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可決定軸突終末的形狀、活動(dòng)性和通路引導(dǎo)。在生長(zhǎng)錐,GAP-43通過與組成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膜骨架蛋白如肌動(dòng)蛋白、胞影蛋白等結(jié)合而影響突觸前終末的生長(zhǎng)狀態(tài)。另外,它可促進(jìn)F-肌動(dòng)蛋白在生長(zhǎng)錐的聚集,使生長(zhǎng)錐在形態(tài)上更具活力,并抵抗其回縮。GAP-43與鈣調(diào)素的關(guān)系。GAP-43是鈣激活蛋白家族的一員,這類分子與鈣調(diào)素的結(jié)合域是同源的,含有一“IQ”基序,可調(diào)節(jié)Ca2+流量及鈣調(diào)素的效力。鈣調(diào)素與GAP-43的“IQ”區(qū)相結(jié)合,而GAP-43的PKC磷酸化位點(diǎn)Ser41也在該區(qū)內(nèi),因此磷酸化GAP-43將破壞其與鈣調(diào)素的結(jié)合。相反,GAP-43與鈣調(diào)素結(jié)合時(shí)將抑制PKC在該位點(diǎn)的磷酸化。GAP-43與鈣調(diào)素的親和性是非Ca2+濃度依賴的:當(dāng)Ca2+低水平時(shí),GAP-43與鈣調(diào)素緊密結(jié)合;當(dāng)Ca2+進(jìn)入細(xì)胞后水平增高時(shí)便釋放鈣調(diào)素。GAP-43作為鈣調(diào)素的貯存庫(kù),在第二信使作用下釋放鈣調(diào)素,同時(shí)GAP-43磷酸化。鈣調(diào)素的釋放引起神經(jīng)末端局部位點(diǎn)鈣調(diào)素依賴的級(jí)聯(lián)蛋白的快速激活,如激活鈣調(diào)素激酶引起突觸素等蛋白的磷酸化,激活鈣調(diào)磷酸酶可引起GAP-43的去磷酸化和與鈣調(diào)素的重新結(jié)合,從而形成1個(gè)反饋環(huán)?；罨腉AP-43進(jìn)一步與細(xì)胞骨架成分相互作用,調(diào)節(jié)神經(jīng)末端的活力,進(jìn)而改變細(xì)胞形態(tài)。GAP-43與磷酸化和去磷酸化的關(guān)系。盡管早已知道GAP-43是PKC在神經(jīng)元內(nèi)的一種重要底物,但GAP-43磷酸化與神經(jīng)生長(zhǎng)的作用到近年才漸趨明了。轉(zhuǎn)基因鼠過表達(dá)假磷酸化蛋白能誘導(dǎo)偽足生長(zhǎng)、細(xì)胞黏附和肌動(dòng)蛋白重組,使海馬中產(chǎn)生大量投射纖維;反之,過表達(dá)去磷酸化GAP-43的轉(zhuǎn)基因鼠的細(xì)胞出芽就大為減少,表明PKC引起的GAP-43在Ser41的磷酸化促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和出芽。另外,磷酸化的Ser41能被連接于膜上的非Ca2+依賴性磷酸激酶,可溶性Ca2+/鈣調(diào)素依賴性磷酸激酶和鈣調(diào)磷酸酶去磷酸化,GAP-43磷酸化和去磷酸化共同參與對(duì)GAP-43活性的調(diào)節(jié)。此外,磷脂代謝與膜受體介導(dǎo)的跨膜信號(hào)傳遞等過程有關(guān),GAP-43的磷酸化和去磷酸化可能對(duì)這些過程有重要的調(diào)節(jié)作用。有學(xué)者認(rèn)為,NGF可能促使GAP-43在生長(zhǎng)錐中磷酸化,轉(zhuǎn)染人GAP-43cDNA的PC12細(xì)胞對(duì)NGF的敏感性增加10倍,突起再生作用顯著提高。GAP-43在信號(hào)傳遞中的作用。鈣調(diào)素和PKC均參與了第二信使過程,GAP-43在磷脂代謝和Ca2+信號(hào)傳遞中也起了重要的作用。在第二信使系統(tǒng)中,受體介導(dǎo)PIP2水解,產(chǎn)生DAG和IP3。DAG的主要作用是激活PKC,而IP3能誘發(fā)Ca2+由胞內(nèi)Ca2+自鈣儲(chǔ)池釋放,提高胞漿中游離Ca2+的濃度。磷酸GAP-43能抑制純化PIP-PIP2激酶的活性,從而抑制PIP2產(chǎn)生,成為PKC和Ca2+代謝的反饋抑制劑。另外,PKC可由非PIP2途徑激活,并使GAP-43磷酸化而抑制IP3依賴的Ca2+代謝,使胞內(nèi)Ca2+處于低濃度水平,這對(duì)Ca2+起第二信使作用至關(guān)重要。此外,G蛋白三聚體Go和Gi在生長(zhǎng)錐膜濃聚,并受神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞-細(xì)胞連接和藥物的激活而影響生長(zhǎng)錐的活性。體外實(shí)驗(yàn)證明:GAP-43通過N末端的氨基酸作用于Go和Gi蛋白的α亞基而刺激GDP-GTP轉(zhuǎn)換。5病理組織學(xué)檢測(cè)GAP-43可促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、神經(jīng)再生及突觸重建。在生長(zhǎng)錐,GAP-43可促進(jìn)F-肌動(dòng)蛋白的聚集,使生長(zhǎng)錐在形態(tài)上更具活力,并抵抗其回縮。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,發(fā)育初期GAP-43分布于胞體,隨著突起的延長(zhǎng),其分布也趨向于突起,最后濃縮于生長(zhǎng)錐,胞體內(nèi)GAP-43水平較低。當(dāng)生長(zhǎng)錐延長(zhǎng)相互接觸時(shí),GAP-43表達(dá)受到抑制,GAP-43的表達(dá)與軸突的生長(zhǎng)變化一致;在胚胎時(shí)期,GAP-43的作用是促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化;在成年則能促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生及觸突重建。另外,在生長(zhǎng)中的神經(jīng)軸突末端,特別是生長(zhǎng)錐質(zhì)膜處,GAP-43分布極為豐富,可占質(zhì)膜總蛋白的1%,是含量最高的蛋白質(zhì)之一,并在生長(zhǎng)錐內(nèi)一直保持高水平。運(yùn)用反義寡核苷酸探針阻斷GAP-43的表達(dá),或運(yùn)用抗體抑制GAP-43,均可阻礙軸突生長(zhǎng)。敲除GAP-43基因的小鼠,軸突定向生長(zhǎng)出現(xiàn)障礙,而GAP-43過度表達(dá)則促進(jìn)軸突迅速生長(zhǎng)、分化,且GAP-43可迅速隨著神經(jīng)纖維與靶器官的聯(lián)系建立而逆轉(zhuǎn),即表達(dá)增加。單純用藥物阻斷軸漿流動(dòng)也可以造成GAP-43表達(dá)增加,提示GAP-43的表達(dá)升高不單可由損傷引起,推測(cè)GAP-43的表達(dá)受某種逆行信號(hào)的調(diào)控,對(duì)完整的成熟神經(jīng)元逆行信號(hào)的作用是抑制其表達(dá),而對(duì)發(fā)育中和受損的神經(jīng)元來說,另一種逆行信號(hào)可誘導(dǎo)其表達(dá),顯然逆行信號(hào)的本質(zhì)、組織來源和作用方式都是不同的。前者的信號(hào)可能是由效應(yīng)器產(chǎn)生,通過逆行軸漿流動(dòng)至胞體,而后者是在發(fā)育中的軸突或損傷斷裂的軸突尚未與靶器官建立聯(lián)系前,由損傷局部產(chǎn)生或由胞體產(chǎn)生后又返回胞體的信號(hào)刺激GAP-43的表達(dá)。哺乳動(dòng)物周圍神經(jīng)成熟神經(jīng)元的軸突受損后,軸突的延長(zhǎng)和重建可被重新誘導(dǎo),表現(xiàn)出與發(fā)育過程類似的反應(yīng),即軸突的再生與神經(jīng)的修復(fù)。起初GAP-43仍位于胞體,隨著細(xì)胞突起的延長(zhǎng)而逐漸趨向外周,最后集中在生長(zhǎng)錐。當(dāng)神經(jīng)元突起相互接觸時(shí),GAP-43的表達(dá)抑制;當(dāng)周圍神經(jīng)受損后,神經(jīng)元蛋白合成的變化是軸突再生所必須的。軸突生長(zhǎng)所需的蛋白必須由胞體運(yùn)送至軸突,分為快速和慢速軸運(yùn)蛋白,而快速轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中有一種在神經(jīng)受損后,其含量呈直線增加,即GAP-43。壓榨大鼠坐骨神經(jīng)后24h即能測(cè)出標(biāo)記的GAP-43,14d后GAP-43的水平比正常高60倍,114d恢復(fù)到正常水平,而GAP-43mRNA于傷后16h便開始升高,24h升高2.5倍,48h升高10倍,37d降至正常。相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)在受損后40h開始增加,6~20d達(dá)高峰,60d時(shí)仍維持在較高水平,以后逐步下降,10個(gè)月后恢復(fù)至正常水平。神經(jīng)損傷后,背根節(jié)中GAP-43與mRNA的變化不一致。從量上看,蛋白低,mRNA高;從持續(xù)時(shí)間看,蛋白持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),mRNA持續(xù)時(shí)間短。前者是因mRNA存在于胞體,蛋白在胞體合成后很快被轉(zhuǎn)運(yùn)到軸突所致;后者說明GAP-43mRNA的表達(dá)不僅受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),而且受蛋白質(zhì)半衰期因素的影響。