毒毛旋花子苷原對正常和心衰心肌鈣瞬變和收縮力的影響

毒毛旋花子苷原對正常和心衰心肌鈣瞬變和收縮力的影響

強心劑一直是治療慢性充血性心力衰竭（chf）的首選藥物，但它可以增強人們的心肌收縮能力。一般認為:強心苷抑制衰竭心臟心肌細胞膜上的Na+,K+-ATP酶,使細胞內(nèi)鈉離子濃度([Na+]i)增加,通過Na+/Ca2+交換,引起Ca2+的凈內(nèi)流,并促進肌漿網(wǎng)對Ca2+的攝取及隨后的鈣釋放,心肌收縮力隨之增加。然而,強心苷有效控制心衰的血清游離濃度約為1～10nmol·L-1,而強心苷抑制Na+,K+-ATP酶的濃度則遠遠大于10nmol·L-1(約為1～100μmol·L-1),故抑制Na+,K+-ATP酶的離子轉(zhuǎn)運功能理論不能解釋治療濃度強心苷的強心作用。此外,低濃度強心苷對心功能影響的報道也有很大差異,增強、抑制或無影響的結(jié)果均有報道。本室用不同濃度Str灌流離體豚鼠心臟,均使離體心臟的心功能增強。Str的nmol級可使心功能適度持續(xù)增加,而μmol級則使心功能出現(xiàn)先增加后降低并伴有不規(guī)則收縮。另外,采用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄L-型鈣電流和激光共聚焦技術(shù)記錄細胞內(nèi)鈣變化證實nmol的雙氫哇巴因可通過外鈣內(nèi)流(促進L-型鈣通道的開放及TTX-敏感性鈉通道的“slip-mode”鈣電導(dǎo))升高靜息心肌細胞內(nèi)鈣。迄今為止,Str對慢性衰竭心臟單個心肌細胞的作用,尤其是同步檢測其對心肌細胞收縮力和鈣瞬變的作用未見報道,因此,強心苷對心肌收縮力的影響及其機制值得進一步探討。由于豚鼠對強心苷類藥物敏感,且其在心室肌細胞興奮-收縮偶聯(lián)過程中調(diào)控[Ca2+]i的各種途徑所占比例與人相似等特點;又因通常認為細胞內(nèi)鈣離子濃度升高是心肌興奮—收縮偶聯(lián)始動的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是公認的強心苷增強心肌收縮力的機制。所以選用豚鼠做實驗動物,通過同步檢測Str對急性分離的正常和心衰豚鼠心肌細胞收縮、舒張功能及鈣瞬變的作用,在細胞水平分析了強心苷的正性肌力作用及其與鈣瞬變的關(guān)系,初步探討其正性肌力作用的可能機制。1材料和方法1.1實驗動物♂豚鼠,體質(zhì)量250～300g,由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。設(shè)對照組10只,慢性心衰組15只,兩組同室飼養(yǎng)。1.2動物的chf模型的制造按文獻方法制備。1.3單心肌細胞的急性分離取慢性心衰組和假手術(shù)組豚鼠心臟,急性分離制備單個心室肌細胞。1.4單帶擴散功能與鈣瞬變的同步檢測應(yīng)用可視化動緣探測系統(tǒng)(IonOptixCo,USA)動態(tài)跟蹤同步檢測Str(Sigma)對單細胞舒縮和鈣瞬變的作用。1.5外鈣作用對n、fc收縮和鈣瞬變的影響待灌流槽中的心肌細胞收縮正常后,灌流含不同濃度CaCl2的正常臺氏液,并同步檢測細胞收縮幅度及鈣瞬變變化,比較不同濃度外鈣作用對NC和FC收縮和鈣瞬變的影響,并與灌流不同濃度Str的結(jié)果進行比較,考察Str是否具有鈣增敏作用。1.6ph值、nh3、kh2p無鈣臺氏液(mol·L-1):NaCl135、KCl5.4、MgCl21、NaH2PO40.33、Glocose5.0、HEPES5.0。正常臺氏液:無鈣臺氏液加CaCl21.8mmol·L-1。充以100%O2,用NaOH調(diào)pH值為7.35。KB液(mol·L-1):L-glutamicacid50、KCl40、taurine20、KH2PO425、MgSO43、EGTA1、Glucose10、HEPES10。充以100%O2,用KOH調(diào)pH值為7.25。1.7統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS統(tǒng)計軟件,給藥前后收縮力和鈣瞬變變化采用配對t檢驗,組間比較用t檢驗。2結(jié)果2.1用量依賴關(guān)系若將給藥前細胞收縮幅度標準化為100%,則1、10、25μmol·L-1Str均使豚鼠NC收縮幅度分別增大至(135.72±7.44)%、(167.02±15.84)%和(265.80±32.65)%(P<0.01,n=30～32),且呈劑量依賴性變化(r=0.989,P<0.05),但1～100nmol·L-1Str對NC收縮幅度沒有明顯影響,而50μmol·L-1Str使NC很快出現(xiàn)毒性反應(yīng),表現(xiàn)為不規(guī)律收縮,甚至變?yōu)榍蛐巍?.1、1、10、25μmol·L-1Str可以使FC收縮力幅度分別增大為(137.83±9.78)%、(174.73±18.98)%、(226.18±29.74)%和(423.18±59.62)%(P<0.01,n=30～35),也呈劑量依賴關(guān)系(r=0.988,P<0.01)。且與同劑量相比,Str增加FC收縮幅度比NC更明顯(P<0.05,P<0.01)。但1～10nmol·L-1Str對FC收縮幅度沒有明顯影響,50μmol·L-1Str也使FC很快出現(xiàn)毒性反應(yīng)。同時,1,10,25μmol·L-1Str劑量依賴性增加NC收縮速度,分別增加為(121.70±5.79)%、(169.33±15.64)%和(229.26±29.00)%(P<0.05和P<0.01),r=0.997,P<0.05;0.1、1、10、25μmol·L-1Str劑量依賴性增加FC收縮速度,分別為(123.74±7.00)%、(156.32±11.15)%、(224.06±34.21)%和(290.43±46.37)%(P<0.01),r=0.973,P<0.05,也比同劑量Str對NC作用更明顯(P<0.05,P<0.01)。1、10、25μmol·L-1Str劑量依賴性增加NC舒張速度,分別增加為(142.48±13.43)%、(203.19±35.05)%和(308.22±50.94)%(P<0.01),r=1.000,P<0.01;0.1、1、10、25μmol·L-1的Str使FC舒張速度分別增加為(142.84±11.72)%、(196.44±27.34)%、(247.64±39.66)%和(537.53±82.22)%(P<0.01),呈劑量依賴性變化(r=0.979,P<0.05),也比同劑量Str對NC作用更明顯(P<0.05)。但給各種濃度Str后,NC和FC收縮達峰時程和舒張至初始值時程并無明顯差別(P>0.05,結(jié)果未顯示)。Fig1為Str對心衰心肌細胞正性肌力作用的原始記錄圖。2.2str對fc鈣瞬變的影響為探討Str對收縮力與細胞內(nèi)Ca2+作用的關(guān)系,采用可視化動緣探測系統(tǒng)檢測收縮力的同時,同步檢測Str對心肌細胞鈣瞬變的影響。不同濃度的Str(1、10、25μmol·L-1)可以使豚鼠NC鈣瞬變幅度分別增加為(113.04±2.17)%、(125.28±6.22)%和(137.13±7.31)%(P<0.01),且呈劑量依賴關(guān)系(r=0.988,P<0.05);Str(0.1、1、10、25μmol·L-1)使FC鈣瞬變幅度分別增加為(120.60±6.33)%、(117.60±3.64)%、(128.59±7.54)%和(162.30±12.60)%(P<0.01),也呈劑量依賴關(guān)系(r=0.980,P<0.01),且比同劑量Str對NC鈣瞬變幅度增加更大。Str并不影響NC和FC內(nèi)Ca2+達峰時程和恢復(fù)至初始值時程(P>0.05,結(jié)果未顯示),這與其對收縮的時程影響一樣。并且,與對收縮幅度的影響一樣,1～100nmol·L-1Str和1～10nmol·L-1Str分別對NC和FC鈣瞬變沒有影響。Fig2為Str對心衰心肌細胞鈣瞬變作用的原始記錄圖。2.3str功能性狀檢測,主要有以下幾種從Str對NC和FC收縮和鈣瞬變的作用來看,如Fig3所示,在相同濃度Str時,NC和FC收縮增加的幅度要比鈣瞬變的增加幅度更大,如10μmol·L-1時,NC收縮幅度增加(67.02±15.84)%,而鈣瞬變幅度僅增加(25.28±6.22)%。所以,需進一步考察這種現(xiàn)象是否系Str增加肌絲對鈣的敏感性所致。用不同濃度(3.0,4.2,5.4,7.2,9.0mmol·L-1)氯化鈣作用時的細胞內(nèi)Fura2熒光比率為橫坐標,以同步測得的收縮幅度為縱坐標,繪制收縮幅度與熒光比率關(guān)系曲線;再以不同濃度Str作用時細胞內(nèi)Fura2熒光比率為橫坐標,以同步測得的收縮幅度為縱坐標,繪制另一條關(guān)系曲線。結(jié)果顯示,在NC,Str的收縮幅度-熒光比率曲線左移(Fig4),說明Str具有鈣增敏作用;而在FC,Str這一曲線沒有變化(Fig5),說明Str對FC并無鈣增敏作用。3正性肌力作用一般認為,[Ca2+]i的變化,能直接反映心肌細胞的舒縮特性,[Ca2+]i上升,細胞縮短,[Ca2+]i下降,細胞復(fù)長。在CHF過程中,心肌細胞的鈣穩(wěn)態(tài)平衡遭到破壞,表現(xiàn)為胞內(nèi)鈣瞬變減小和衰減減慢。這種變化被認為是CHF心肌收縮能力減退的主要原因。而單個心室肌細胞的舒縮能力變化直接影響到整體心臟的收縮力。本實驗同步記錄并檢測Str對心肌細胞收縮、舒張功能和鈣瞬變的作用,結(jié)果表明,0.1～25μmol·L-1Str可劑量依賴性地增加NC和FC收縮力及鈣瞬變,且同劑量時,Str對FC的作用比NC更明顯。而1～100nmol·L-1Str和1～10nmol·L-1Str分別對NC和FC收縮張功能和鈣瞬變沒有影響;0.1μmol·L-1(即100nmol·L-1)Str僅影響FC收縮力及其鈣瞬變,而對NC無影響;50μmol·L-1Str則使NC和FC均發(fā)生毒性反應(yīng)。說明FC對Str更為敏感。這一結(jié)果與Str對人衰竭心臟的心肌條作用結(jié)果一致。但1～10nmol·L-1Str對急性分離的心肌細胞均沒有正性肌力作用,與本室用Str灌流離體豚鼠心臟的結(jié)果即Str的nmol級可使心功能適度持續(xù)增加,μmol級則使心功能出現(xiàn)毒性作用不一致。出現(xiàn)這種對離體心臟和對單個心肌細胞作用不一致的原因有待于進一步考察。已知有兩種主要的因素影響心肌細胞的收縮力:一是心肌細胞內(nèi)鈣瞬變幅值和持續(xù)時間的變化;另一個是肌絲對鈣敏感性的改變。因此,我們進一步考察造成FC比NC對Str更為敏感這一現(xiàn)象是否由于Str使FC的肌絲對鈣的敏感性增強所致。結(jié)果表明,Str對NC具有鈣增敏作用,而對FC并無鈣增敏作用。Str對NC具有鈣增敏作用,說明Str通過增加細胞內(nèi)鈣瞬變和增加肌絲對鈣的敏感性來增加心肌細胞的收縮力。而FC可能由于心肌細胞的重構(gòu),肌凝蛋白、肌鈣蛋白亞型的改變,ATP減少等多種復(fù)雜因素影響了肌絲對鈣的敏感性。但為什么衰竭心臟心肌細胞對Str更為敏感呢?我們的研究(待發(fā)表)結(jié)果表明,降主結(jié)扎致豚鼠心衰后Na+,K+-ATP酶的表達和活性并無明顯變化,提示心衰不損傷Na+,K+-ATP酶。在相同細胞內(nèi)鈣的情況下,心衰心肌細胞收縮力的變化更明顯,盡管Str對FC沒有鈣增敏作用,但Str增加FC的鈣瞬變強于NC的作用可解釋Str增加FC的收縮幅度比NC的幅度更大這一結(jié)果;但為什么Str增加FC的鈣瞬變幅度比NC更大呢?那么到底什么原因使衰竭心臟心肌細胞對Str更為敏感呢?Nishio等發(fā)現(xiàn),在急性分離的貓心室肌細胞,無Na+、無K+甚至阻斷Na+/Ca2+交換的情況下,哇巴因(Oua)仍能增加心肌細胞收縮力和鈣瞬變,表明強心苷的正性肌力作用并不完全依賴Na+,K+-ATP酶的抑制作用。所以,考慮Str的正性肌力作用,除了抑制Na+,K+-ATP酶的離子