薄層色譜和柱色譜色譜法是分離提純和鑒定有機化合物的重要方法

薄層色譜和柱色譜色譜法是分離、提純和鑒定有機化合物的重要方法，有著極其廣泛的用途。色譜法的基本原理是利用混合物中各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它親和作用性能的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該物質(zhì)時進行反復(fù)的吸附或分配等作用，從而將各組分分開。流動的混合物溶液稱為流動相；固定的物質(zhì)稱為固定相（可以是固體或液體）。根據(jù)組分在固定相中的作用原理不同，可分為吸附色譜、分配色譜等。吸附色譜常用氧化鋁和硅膠作固定相；分配色譜中以硅膠、硅藻土和纖維素作為支持劑，以吸收較大量的液體作固定相，而支持劑本身不起分離作用。根據(jù)操作條件不同，可分為柱色譜紙色譜、薄層色譜、氣相色譜及高效液相色譜等類型。一、薄層色譜薄層色譜（ThinLayerChromatography,TLC）屬于固-液吸附色譜，是一種微量的分離分析方法，具有設(shè)備簡單、速度快、分離效果好、靈敏度高以及能使用腐蝕性顯色劑等優(yōu)點。適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至0.01卩g）的分離。同時薄層色譜是一種非常有用的跟蹤反應(yīng)的手段，在進行化學(xué)反應(yīng)時，常利用薄層色譜觀察原料斑點的逐步消失來判斷反應(yīng)是否完成。也常用作柱色譜的先導(dǎo)，可用于柱色譜分離中展開劑的選擇，也可監(jiān)視柱色譜分離狀況和效果。最常用的薄層色譜屬于液-固吸附色譜，把吸附劑（如氧化鋁、硅膠）和粘合劑（如煅石膏CaSO4?H2O、羧甲基纖維素鈉等）均勻地鋪在一塊玻璃板上形成薄層，將分離樣品滴加在薄層的一端，當(dāng)利用毛細作用使流動相沿著吸附劑薄層（固定相）移動時，吸附劑借各種分子間力（包括范德華力和氫鍵）作用于混合物中各組分，各組分以不同的作用強度被吸附。被分離組分在固定相與流動相之間進行分配或吸附，經(jīng)過反復(fù)無數(shù)次的分配平衡或吸附平衡，不同組分的極性化合物就會在薄層板上移動不同的距離。極性強的化合物會“粘”在極性的吸附劑上，在薄板上移動的距離比較短。而非極性的物質(zhì)在薄層板上移動較大的距離?；衔镆苿拥木嚯x大小用Rf值表達，是介于0?1之間的數(shù)值，它的定義為：R=樣品原點中心到斑點中心的距離廠樣品原點中心到溶劑前沿的距離如圖1所示，d為點樣點到溶劑前沿的距離，d1為點樣點到斑點1的距離，d2為點樣點到斑點2的距離。薄層色譜常用的吸附劑或支持劑是硅膠或氧化鋁。薄層色譜用的硅膠分為硅膠H不含粘合劑；硅膠G含煅石膏做粘合劑；硅膠HF-254含熒光物質(zhì)，可在波長254nm紫外光下觀察熒光；硅膠GF-254含有煅石膏和熒光劑。薄層色譜用的氧化鋁也分為氧化鋁G、氧化

鋁GF254及氧化鋁HF254。薄層色譜技術(shù)包括制板、點樣、展開、顯色等。薄層板的制備薄層板的薄層應(yīng)盡可能的均勻而且厚度（0.25?lmm）要固定。否則展開時溶劑前沿不齊，色譜結(jié)果也不易重復(fù)。制備薄層板，首先將吸附劑調(diào)成糊狀：如稱取約3g硅膠G，加入到6?7mL0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液中，調(diào)成均勻的糊狀物（可鋪7?8張載玻片）。這一步一定要將吸附劑逐漸加入到溶劑中，邊加邊攪拌；如果把溶劑加到吸附劑中，容易產(chǎn)生結(jié)塊。然后采用簡單的平鋪法和傾斜法將糊狀物涂布在干凈的載玻片上，制成薄層板。（1） 平鋪法：可將自制涂布器（如圖2）,洗凈，把干凈的載玻片在涂布器中擺好，上下兩邊各夾一塊比載玻片厚0.25mm的玻璃板，在涂布器槽中倒人糊狀物，將徐布器自左向右推，即可將糊狀物均勻地涂在玻璃板上。圖2薄層板涂布器（2） 圖2薄層板涂布器吸附劑薄層涂布器玻璃夾板玻璃板涂好的薄層板室溫水平放置晾干后，放入烘箱內(nèi)加熱活化，活化條件根據(jù)需要而定。硅膠板一般在烘箱中漸漸升溫，維持105?110°C活化30min。氧化鋁板在200?220°C烘4h可得活性II級的薄板。150?160C烘4h可得活性III?W級的薄板。薄層板的活性與含水量有關(guān)，其活性隨含水量的增加而下降。注意硅膠板活化時溫度不能過高，否則硅醇基會相互脫水而失活。活化后的薄層應(yīng)放在干燥器內(nèi)保存。點樣將樣品溶于低沸點溶劑（丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、乙醚和四氯化碳）配成1%的溶液，用內(nèi)徑小于1mm管口平整的毛細管點樣：用毛細管取樣品溶液，在薄層板一端約1.0cm處，垂直地輕輕地接觸到薄層上的吸附劑，樣品溶液就可靠到薄層上。在薄層色譜中，樣品的用量對物質(zhì)的分離效果有很大影響，所需樣品的量與顯色劑的靈敏度、吸附劑的種類、薄層的厚度均有關(guān)系。樣品太少，斑點不清楚，難以觀察；樣品量太多，往往出現(xiàn)斑點太大或拖尾現(xiàn)象，以至不易分開。若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點樣，但應(yīng)待前次點樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點樣，樣點直徑一般以2?4mm為宜。同一薄層上的樣點直徑應(yīng)一致。另外點樣要輕，不可刺破薄層。展開薄層板的展開需要在密閉的色譜缸（也可用標本缸或廣口瓶等）中進行，如圖3。用來展開樣品中各組分的溶劑（流動相）稱為展開劑。先將一定量展開劑放在色譜缸中，蓋上缸蓋，

讓缸內(nèi)溶劑蒸氣飽和5?10min。再將點好試樣的薄層板樣點一端朝下放入缸內(nèi)（注意控制器皿中展開劑的量，切勿使樣點浸入展開劑中），蓋好缸蓋，展開劑因毛細管效應(yīng)而沿薄層上升，樣品中組分隨展開劑在薄層中以不同的速度自下而上移動而導(dǎo)致分離。當(dāng)展開劑前沿上升到樣點上方8?10cm時取出薄層板，放平，鉛筆標明溶劑前沿位置，冷風(fēng)吹干溶劑?；衔镌诒“迳弦苿泳嚯x的多少取決于所選取的溶劑不同。但凡溶劑的極性越大，對化合物的洗脫能力也越大，即Rf值也越大。在戊烷和環(huán)己烷等非極性溶劑中，大多數(shù)極性物質(zhì)不會移動，但是非極性1-層析缸;2-薄層板3-展開劑蒸氣;4-展開劑圖3直立式層析缸示意圖化合物會在薄板上移動一定距離。極性溶劑通常會將非極性的化合物推到溶劑的前段而將極性化合物推離基線。一個好的溶劑體系應(yīng)該使混合物中所有的化合物都離開基線，但并不使所有化合物都到達溶劑前端，R/直最好在0.15?0.85之間。最理想的Rf值為0.4?0.5，良好的分離Rf值為0.15?1-層析缸;2-薄層板3-展開劑蒸氣;4-展開劑圖3直立式層析缸示意圖選擇展開劑時，除參照表列溶劑極性來選擇外，更多地采用試驗的方法，在一塊薄層板上進行試驗：若所選展開劑使混合物中所有的組分點都移到了溶劑前沿，此溶劑的極性過強；若所選展開劑幾乎不能使混合物中的組分點移動，留在了原點上,此溶劑的極性過弱。當(dāng)一種溶劑不能很好地展開各組分時，常選擇用混合溶劑作為展開劑。先用一種極性較小的溶劑為基礎(chǔ)溶劑展開混合物，若展開不好，用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調(diào)整極性，再次試驗，直到選出合適的展開劑組合。合適的混合展開劑常需多次仔細選擇才能確定一些常用溶劑和它們的相對極性：甲醇〉乙醇〉異丙醇〉乙氰〉乙酸乙酯〉氯仿〉二氯甲烷〉乙醚〉甲苯〉正己烷、石油醚強極性溶劑I 中等極性溶劑 I非極性溶劑常用混合溶劑：乙酸乙酯/正己烷，常用比例1:10?1:3；乙醚/戊烷，常用比例1:10?1:2.5；乙醇/正己烷，對強極性化合物1:10?1:3比較合適；二氯甲烷/正己烷，常用1:10?1:3，當(dāng)其他混合溶劑失敗時可以考慮使用。顯色展開的薄層板上化合物斑點本身有顏色時，可直接觀察。若化合物本身無色，可在紫外燈下觀察熒光斑點，也可用顯色劑顯色。簡單常用的顯色劑是碘蒸氣，廣口瓶中放置少量碘晶體，使用時將薄層板放入，蓋上瓶蓋，密封瓶內(nèi)的碘蒸氣即可使大部分有機化合物顯色（飽和烴與鹵代烴除外）。二、柱色譜柱色譜（柱上層析）的原理與薄層色譜類似，常用的有吸附色譜和分配色譜兩類。吸附柱色譜通常在玻璃管中填入表面積很大的多孔性或粉狀固體吸附劑。當(dāng)待分離的混合物溶液流過吸附柱時，各種成分同時被吸附在柱的上端。當(dāng)洗脫劑流下時，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脫的速度也不同，于是形成了不同層次，即溶質(zhì)在柱中自上而下按對吸附劑的親和力大小分別形成若干色帶，如圖4所示。再用溶劑洗脫時，已經(jīng)分開的溶質(zhì)可以從柱上分別洗出收集；或?qū)⒅桑瑪D出后按色帶分割開，再用溶劑將各色帶中的溶質(zhì)萃取出來。實驗室常用氧化鋁、硅膠作吸附劑。吸附劑的選擇一般要根據(jù)待分離的化合物類型而定。例如硅膠的性能比較溫和，屬無定形多孔物質(zhì)，略具酸性，適合于極性較大的物質(zhì)分離；同時硅膠極性相對較小，適合于分離極性較大的化合物，如羧酸、醇、酯、酮、胺等。而氧化鋁極性較強，對于弱極性物質(zhì)具有較強的吸附作用，適合于分離極性較弱的化合物。酸性氧化鋁適合于分離羧酸或氨基酸等酸性化合物；堿性氧化鋁適合于分離胺；中性氧化鋁則可用于分離中性化合物。圖4柱色譜分離示意圖大多數(shù)吸附劑都能強烈地吸水，且水分易被其它化合物置換，因此吸附劑的活性降低。因此吸附劑使用前一般要經(jīng)過純化和活性處理，顆粒大小應(yīng)當(dāng)均勻。對于吸附劑而言，粒度愈小表面積愈大，吸附能力就愈高，但顆粒愈小時，溶劑的流速就太慢，因此應(yīng)根據(jù)實際分離需要而定。在吸附劑上，化合物的吸附性與它們的極性成正比，化合物分子中含有極性較大的基團時，吸附性也較強，各種化合物對氧化鋁的吸附性按以下次序遞減：酸和堿＞醇、胺、硫醇＞酯、醛、酮〉芳香族化合物〉鹵代物、醚〉烯〉飽和烴柱色譜分離中，洗脫劑的選擇是重要的一環(huán)，通常根據(jù)被分離物中各化合物的極性、溶解度和吸附劑的活性等來考慮。但是必須注意，選擇的洗脫劑極性不能大于樣品中各組分的極性。否則樣品組分在柱色譜中移動過快，不能建立吸附-洗脫平衡，影響分離效果。實際操作時，一般采用薄層色譜反復(fù)對比、選擇柱色譜的洗脫劑。能在薄層色譜上將樣品中各組分完全分開，即可作柱色譜洗脫劑。在有多種洗脫劑可選擇時，一般選擇目標組分Rf值較大的洗脫劑。一般來說，洗脫劑都需要采用混合溶劑，利用強極性和弱極性溶劑復(fù)配而成。硅膠和氧化鋁作吸附劑的柱色譜，洗脫劑的洗脫能力有如下順序：己烷和石油醚V環(huán)己烷V四氯化碳V三氯乙烯V二硫化碳V甲苯V苯V二氯甲烷V氯仿V乙醚V乙酸乙酯V丙酮V丙醇V乙醇V甲醇V水V吡啶V乙酸常用的柱色譜裝置包括色譜柱、滴液漏斗、接受瓶，如圖2-37所示。操作包括裝柱、裝樣、洗脫、收集等。1.裝柱實驗時選一合適色譜柱（長徑比應(yīng)不小于78:1，吸附劑填充量約柱容量的3/4，

預(yù)留1/4空間裝溶劑），洗凈干燥后垂直固定在鐵架臺上，柱子下端放置一錐形瓶。如果層析柱下端沒有砂芯橫隔，就應(yīng)取一小團脫脂棉或玻璃棉，用玻璃棒將其推至柱底，然后再鋪上一層約0.5cm厚的砂，然后采用濕法或干法裝柱。裝柱要求吸附劑填充均勻，無斷層、無縫隙、無氣泡，否則會影響洗脫和分離效果。（1）濕法裝柱將一定量的吸附劑（吸附劑用量應(yīng)是被分離混合物量的30?40倍）用溶劑（最好選用90?120°C石油醚）調(diào)成糊狀，向柱內(nèi)倒入溶劑至柱高的3/4處。再將調(diào)好的糊狀吸附劑從色譜柱上端倒入，同時打開色譜柱下端的活塞，使溶劑慢慢流入錐形瓶。在添加吸附劑的過程中，可用木質(zhì)試管夾或套有橡皮管的玻璃棒繞柱四周輕輕敲打，促使吸附劑均勻沉降并排出氣泡。注意敲打色譜柱時，不能只敲打某一部位，否則被敲打一側(cè)吸附劑沉降更緊實，致使洗脫時色譜帶跑偏，甚至交錯而導(dǎo)致分離失敗。另外還需掌握敲打時間，敲打不充分，吸附劑層降不緊實，各組分洗脫太快分離效果不好；敲打過度，吸附劑層降過于緊實，洗脫速度太慢而浪費實驗時間。一般以洗脫劑流出速度為每分鐘5?10滴）。吸附劑添加完畢，在吸附劑上面覆蓋約1cm厚的砂層。整個添加過程中，應(yīng)保持溶劑液面始終高出吸附劑層面（見圖5）。（2）干法裝柱將一定量的吸附劑用漏斗慢慢加入干燥的色譜柱中，邊加入邊敲擊柱身，務(wù)必使吸附劑裝填均勻，不能有空隙。加完后，在吸附劑上覆蓋少許石英砂，然后加洗脫劑洗柱趕走 圖2-5柱色譜裝置小氣泡。2.裝樣和洗脫：當(dāng)柱內(nèi)的溶劑液