金銀花葉中木犀草素的分離與鑒定

金銀花葉中木犀草素的分離與鑒定【摘要】目的建立一種可以從金銀花葉中分離出木犀草素的方法。方法采用超聲提取，石油醚回流脫色、大孔樹脂柱和聚酰胺柱分離相結(jié)合的方法，通過薄層色譜、紫外光譜、紅外光譜、高效液相色譜進(jìn)行鑒定，最終得到木犀草素產(chǎn)品。結(jié)果此產(chǎn)品純度最高可達(dá)81.6%，得率為28.9ug?g-1。結(jié)論建立了從金銀花葉中分離木犀草素的新工藝?！娟P(guān)鍵詞】金銀花葉；木犀草素；分離；鑒定金銀花是名貴中藥材，含有多種有效成分，木犀草素作為一種黃酮單體，具有抗炎、抗菌、抗癌、抑酶、抗氧化、利膽利尿等多種作用，金銀花葉作為金銀花的一種副產(chǎn)物，產(chǎn)量較大，而且常常被浪費(fèi)掉，研究表明，金銀花葉中木犀草素的含量平均是花中的2.8倍［1，2］，但目前對(duì)于金銀花葉中木犀草素的研究僅限于含量測定，對(duì)于木犀草素產(chǎn)品的分離、純化還未見報(bào)道。本文采用超聲提取，石油醚回流脫色、大孔樹脂柱和聚酰胺柱分離相結(jié)合的方法從金銀花葉中分離出了黃酮單體木犀草素，并結(jié)合聚酰胺薄層色譜、紅外光譜、紫外光譜、高效液相色譜等方法對(duì)分離后得到的木犀草素產(chǎn)品進(jìn)行定性鑒定和定量分析，其純度最高可達(dá)81.6%，得率為28.9ug?g-1。1儀器與材料紫外-可見分光光度計(jì)UV-2450（日本島津公司）；電子分析天平;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）；Agilent1100型高效液相色譜儀，紅外光譜儀FTIR-8400S（日本島津公司），紫外燈。聚酰胺粉（80-100目），木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品（購于北京豐斯特公司），工業(yè)酒精，其它試劑均為分析純。2方法2.1木犀草素含量測定精密吸取0.100mg/ml木犀草素對(duì)照品溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml于10ml容量瓶中，用流動(dòng)相（甲醇:0.02%磷酸=50:50）定容至刻度，選擇色譜柱為ZORBAXSB-C18柱（250mmX4.6mm，5um，Agilent公司）；以甲醇:0.02%磷酸=50：50為流動(dòng)相;在檢測波長350nm，柱溫30°C；流速為1.0ml/min的條件下進(jìn)樣20.0ul。記錄峰面積，得直線回歸方程為Y=33578.22C-11.807（Y代表峰面積，C代表木犀草素濃度mg/ml），R2=0.9997；木犀草素在0.02?0.1mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.2上柱樣品的制備用20倍量的50%乙醇超聲浸提黃酮后，將提取液濃縮，然后按照質(zhì)量比（金銀花葉和聚酰胺粉的質(zhì)量）為15：1的比例混入聚酰胺（80?100目）粉，使其保持松散，不結(jié)塊，將此固體粉末取出，放在索氏提取器中用石油醚回流脫色10次后，取出此固體粉末，揮干石油醚，即得黃酮粗品拌料，然后經(jīng)過物料比（黃酮粗品拌料與大孔樹脂質(zhì)量比）為1：6,柱徑與柱長比為1：6的HPD100型大孔樹脂柱進(jìn)一步分離富集，先用2倍柱體積的蒸餾水洗掉蛋白和糖類等大分子雜質(zhì)，再用70%的乙醇以最大流速洗脫，收集2?8倍柱體積的洗脫液，濃縮后得到樣品。2.3聚酰胺柱的裝填把一定量的聚酰胺用水浸泡24h，濕法裝柱，然后用甲醇以3BV/h的流速洗滌聚酰胺，至流出液澄清為至，再用蒸餾水洗至無甲醇。2.4木犀草素產(chǎn)品的分離純化樣品上柱后開始洗脫，先用水洗去糖、蛋白分子及其它水溶性雜質(zhì)，然后采用30%，50%，70%的醇溶液梯度洗脫，采用30%和50%的醇梯度洗脫時(shí)，柱中開始有淡粉色和黃色色帶出現(xiàn)，隨著洗脫的進(jìn)行，淡粉色色帶變得模糊，黃色色帶開始緩慢下移。當(dāng)兩個(gè)色帶拉開一段距離后，改用70%的醇洗脫，黃色色帶下移的速度加快，收集此色帶從開始到流完的洗脫液，每50ml一接，記為1?9瓶。以醋酸乙酯：乙酸：水=1：1：1為聚酰胺薄層色譜展開劑，對(duì)1?9瓶的洗脫液初步檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)薄層板上呈現(xiàn)單點(diǎn)，而且此點(diǎn)的Rf值和木犀草素標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的Rf值相同。然后每3瓶一合并，蒸干即可得到3個(gè)不同純度的木犀草素產(chǎn)品，記為1號(hào)，2號(hào)，3號(hào)。用甲醇對(duì)1號(hào)，2號(hào)，3號(hào)進(jìn)行重結(jié)晶，得到木犀草素產(chǎn)品1，2，3。3結(jié)果對(duì)1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)木犀草素產(chǎn)品進(jìn)行定性鑒定和定量分析。3.1定性分析3.1.1顏色反應(yīng)分別取3個(gè)等級(jí)的少量產(chǎn)品溶解在甲醇中，得到的溶液滴于濾紙上，在紫外燈下呈現(xiàn)深紫色，用氨水熏后，在紫外燈下觀察，呈現(xiàn)黃色，這和木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品的斑點(diǎn)顯色一致。3.1.2高效液相色譜法的鑒定把上述得到的木犀草素產(chǎn)品用“2.1”項(xiàng)的流動(dòng)相溶解，定容至25ml容量瓶中，對(duì)此溶液在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)行高效液相色譜分析（以產(chǎn)品2為例進(jìn)行說明），發(fā)現(xiàn)：①整個(gè)過程中，產(chǎn)品色譜圖呈現(xiàn)單峰，而且此峰的保留時(shí)間和木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，均為Rt=13.1min。②改變流動(dòng)相，產(chǎn)品色譜峰的保留時(shí)間提早或者推后，并沒有發(fā)生拆分;③改變檢測波長為255,267,350nm，產(chǎn)品色譜峰沒有被拆分；④加入標(biāo)準(zhǔn)品木犀草素于產(chǎn)品溶液中，產(chǎn)品中加標(biāo)前后的色譜圖如圖1?2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品加標(biāo)后的色譜峰保留時(shí)間不變（和標(biāo)準(zhǔn)品的一致），只是峰增強(qiáng)了。圖1產(chǎn)品色譜圖圖2產(chǎn)品加標(biāo)后色譜圖由以上色譜峰可見，此類產(chǎn)品中木犀草素的純度較高。3.1.3紫外圖譜法采用標(biāo)準(zhǔn)品木犀草素（結(jié)構(gòu)如圖3）和樣品對(duì)照的方法進(jìn)行紫外圖譜［3］鑒定。使用的移動(dòng)劑為無水醋酸鈉和無水粉狀硼酸（均為AR級(jí)），在醋酸鈉存在下，硼酸能和黃酮體母核上所有鄰位二羥基螯合，生成絡(luò)合物，使得紫外光譜發(fā)生紅移。在醋酸鈉/硼酸存在下，B環(huán)有鄰位二羥基的黃酮及黃酮醇的帶I向長波移動(dòng)12?30毫微米。移動(dòng)劑的使用程序如下。①將產(chǎn)品的甲醇溶液在190?550mn波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，得到其吸收光譜圖。測完之后，再進(jìn)行移動(dòng)劑光譜的測定。②將粉末狀NaOAc直接加入到吸收池內(nèi)新?lián)Q的產(chǎn)品的甲醇溶液中，直到池底出現(xiàn)2mm厚的NaOAc沉淀為止，搖勻測定液，測定。③測定完NaOAc圖譜后，直接往吸收池中加入H3BO3（加入量大約為NaOAc的一半），混合均勻后測定NaOAc/H3BO3圖譜。結(jié)果如圖4?7所示：圖3木犀草素結(jié)構(gòu)圖圖4產(chǎn)品加入移動(dòng)劑前后的UV圖譜由圖4所示，產(chǎn)品甲醇溶液的紫外圖譜中帶I的入max=346nm，帶II的入max=256nm，具有黃酮結(jié)構(gòu)的兩個(gè)特征譜帶，加入醋酸鈉后，產(chǎn)品的紫外光譜帶II紅移了18nm，說明此化合物含有游離的7羥基，在醋酸鈉/硼酸存在下，產(chǎn)品的紫外光譜帶I紅移了20nm，據(jù)此說明此化合物B環(huán)有鄰位二羥基，即3'，4'-二羥基存在，而且從圖5,6,7也發(fā)現(xiàn)，它和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰重合的相對(duì)較好，是純度較高的木犀草素產(chǎn)品。圖5標(biāo)品和產(chǎn)品的UV圖譜圖6標(biāo)品和產(chǎn)品中加入醋酸鈉后的UV圖譜3.1.4紅外圖譜法分別取產(chǎn)品2和標(biāo)準(zhǔn)品的固體粉末0.5?2mg，在瑪瑙研缽中研細(xì)，再加入100?200mg磨細(xì)干燥的KBr粉末，混合均勻后，加入壓膜內(nèi)，在壓力機(jī)中邊抽氣邊加壓，制成一定直徑及厚度的透明片，然后將此薄片放入儀器光束中測定，得到的譜圖如圖8所示。圖7標(biāo)品和產(chǎn)品中加入醋酸鈉和硼酸后的UV圖譜圖8樣品的IR圖譜通過比較標(biāo)品和產(chǎn)品的IR圖譜發(fā)現(xiàn)，它們吻合的較好，其中在3380，3294cm-1為羥基吸收峰，1671cm-1為羰基吸收峰，1613，1554，1521cm-1為苯環(huán)碳骨架吸收峰。3.2定量分析運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)3個(gè)產(chǎn)品1號(hào)，2號(hào)，3號(hào)進(jìn)行定量分析。分別稱取一定量的3種產(chǎn)品，用“2.1”中的流動(dòng)相（甲醇:0.02%磷酸=50:50）溶解定容后，在“2.1”色譜條件下測其峰面積，對(duì)照測定木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照外標(biāo)法測定其中木犀草素的量，然后分別計(jì)算產(chǎn)品中木犀草素純度和產(chǎn)品得率，公式如式①和②所示。結(jié)果見表1。產(chǎn)品中木犀草素純度（%）=產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)品中木犀草素質(zhì)量X100%式①產(chǎn)品得率二產(chǎn)品質(zhì)量金銀花針的質(zhì)量式②表1聚酰胺柱分離后的產(chǎn)品4討論本實(shí)驗(yàn)采用聚酰胺柱［4,5］進(jìn)一步分離，聚酰胺分子中含有極性酰胺基團(tuán)和非極性的脂肪鍵。作為一個(gè)相對(duì)弱極性的化合物，當(dāng)移動(dòng)相為強(qiáng)極性的溶劑（如水等）時(shí)，聚酰胺作為非極性固定相，其層析行為類似反相分配層析，極性較大的吸附物易被洗脫。隨著洗脫劑極性降低，極性較小的化合物相繼被洗脫下來。所以，利用聚酰胺作為層析柱填料，可使一定極性范圍的某類物質(zhì)得以分離精制。采用聚酰胺柱進(jìn)行分離，嘗試采用70%的乙醇等度洗脫，發(fā)現(xiàn)柱中沒有出現(xiàn)明顯的色帶，收集洗脫液，用聚酰胺薄層跟蹤分析，發(fā)現(xiàn)薄層板上呈自上而下的一系列點(diǎn)，無木犀草素的單點(diǎn)出現(xiàn)。洗脫劑選擇不合適，洗脫能力可能過強(qiáng)，把木犀草素和其它物質(zhì)一起沖下來，沒有達(dá)到分離的目的。接著使用洗脫能力稍微弱一些的50%的乙醇作為洗脫劑等度洗脫，洗脫時(shí)間加長，但是仍然不能把木犀草素和其它雜質(zhì)分離開來，由上可見，在聚酰胺柱上采用等度洗脫不適用。參考文獻(xiàn)楊敏麗，王麗婷.金銀花不同品種及不同部位木犀草素含量的比較[J].中華中醫(yī)藥雜志，2007，22(10)：666.王麗婷，楊敏麗.高效液相色譜法同時(shí)測定金銀花及葉中的黃酮類物質(zhì)[