腫瘤疫苗的研究進(jìn)展

腫瘤疫苗的研究進(jìn)展

腫瘤疫苗是利用腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞裂解物或腫瘤特定激活器官網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)激活腫瘤細(xì)胞的免疫效應(yīng)。它是一種治療性的、新型的腫瘤治療方法,也是一種主動(dòng)性免疫療法。隨著腫瘤免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展,腫瘤與機(jī)體之間的相互作用、腫瘤免疫耐受以及腫瘤抗原鑒定都取得了很大的進(jìn)展,這也促進(jìn)了腫瘤疫苗的發(fā)展。目前,很多腫瘤疫苗在動(dòng)物水平和臨床試驗(yàn)已取得令人鼓舞的效果,能誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞效應(yīng)(cytotoxicT-lymphocyteseffect)且不良反應(yīng)少。因此,腫瘤疫苗作為一種低毒、高效的腫瘤免疫療法具有極大發(fā)展?jié)撃堋?免疫因子t細(xì)胞kra-pcr腫瘤細(xì)胞作為抗原引起機(jī)體免疫反應(yīng)需要兩個(gè)活化信號(hào),第一活化信號(hào)是抗原提呈細(xì)胞(antigenpresentingcells,APCs)攝取并加工腫瘤抗原以MHC-Ⅰ肽或MHC-Ⅱ肽提呈給CD8+或CD4+T淋巴細(xì)胞。第二活化信號(hào)是APCs表達(dá)高水平的共刺激分子(B7.1、ICAM-1、LFA-1等)與抗原特異性T淋巴細(xì)胞表面的受體(CD28、LFA-1CD2等)結(jié)合。根據(jù)機(jī)體免疫監(jiān)控和腫瘤抗原的表達(dá),腫瘤在惡變和轉(zhuǎn)移過(guò)程中理論上應(yīng)引起免疫反應(yīng),抑制腫瘤的生長(zhǎng)。然而,機(jī)體中存在著幾個(gè)重要的機(jī)制使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊,導(dǎo)致腫瘤免疫耐受。包括腫瘤細(xì)胞表面的MHC-Ⅰ分子表達(dá)減少或缺失、共刺激分子表達(dá)減少、腫瘤抗原缺失;CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增多;HLA-G分子高表達(dá);血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)高表達(dá);吲哚胺2,3-二加氧酶(idoleamine2,3-dioxygenase,IDO)表達(dá)增加;Fas凋亡途徑相關(guān)抑制因子增加(DcR3/TR6、FAP-1、c-FLIP、TUCAN/CARD-8/CARDINAL、XIAP、Survivin),抑制腫瘤細(xì)胞凋亡;環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)高表達(dá),PGE2抑制淋巴細(xì)胞的功能。2tl和鑒定科技應(yīng)用腫瘤抗原是細(xì)胞在癌變過(guò)程中出現(xiàn)的新型抗原物質(zhì)的總稱。目前腫瘤抗原主要分為4類(1)癌/睪丸抗原:這類抗原只在睪丸和多種癌細(xì)胞中表達(dá)而在其他正常組織都不表達(dá)。如MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、GAGE、NY-ESO-1、BAGE等。(2)過(guò)表達(dá)抗原:此類抗原在正常組織和腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá),但在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。如P53、Her2/neu、CEA、PSMA、PSA、MUC-1等。(3)分化抗原:這類抗原在黑色素瘤和黑色素細(xì)胞中表達(dá)。如酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、gp100、MART-1等。(4)腫瘤特異性抗原:這類抗原只在腫瘤中表達(dá),包括B細(xì)胞和T細(xì)胞的個(gè)體基因型抗原、病毒基因產(chǎn)物和細(xì)胞突變基因產(chǎn)物等。如B-連環(huán)蛋白、caspase-8、CDK-4、突變P53等。腫瘤疫苗需要腫瘤抗原激活機(jī)體免疫系統(tǒng),隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,越來(lái)越多的腫瘤抗原被人們鑒定并被用來(lái)設(shè)計(jì)腫瘤疫苗,目前,腫瘤抗原鑒定方法主要如下:2.1CTL篩選法這是一種體外用CTL克隆篩選相應(yīng)腫瘤抗原的方法。其主要原理是用腫瘤患者T淋巴細(xì)胞和自體腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)獲得特異性CTL克隆,然后建立腫瘤細(xì)胞的cDNA文庫(kù),將提呈腫瘤抗原的HLA基因和cDNA共同轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞。再用特異性CTL克隆篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞并通過(guò)CTL殺傷效應(yīng)來(lái)鑒定出陽(yáng)性克隆,從而獲得特異性T細(xì)胞識(shí)別的腫瘤抗原。目前利用CTL篩選法獲得的抗原有MAGE、gp100、TRP-1等。這種方法可直接鑒定CTL識(shí)別的多肽,但要求建立腫瘤細(xì)胞的cDNA文庫(kù)、自體瘤細(xì)胞和特異性CTL克隆培養(yǎng),工作量較大,所以應(yīng)用范圍較小。2.2多肽洗脫法多肽洗脫法是用酸來(lái)洗脫被癌細(xì)胞致敏的抗原提呈細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面MHC結(jié)合的抗原肽,然后用HPLC法分離并純化獲得多肽,通過(guò)CTL介導(dǎo)細(xì)胞毒性試驗(yàn)和多肽結(jié)合試驗(yàn)篩選出合適的腫瘤抗原肽,最后通過(guò)質(zhì)譜確定其結(jié)構(gòu)。利用該法獲得的多肽有P946、P939等。這種方法可獲得天然的抗原肽,但是技術(shù)難度大且要求儀器水平較高,所以應(yīng)用范圍也較小。2.3血清學(xué)鑒定重組cDNA表達(dá)文庫(kù)技術(shù)由于CTL篩選法和多肽洗脫法存在一定的局限性,人們?cè)噲D用血清學(xué)的方法來(lái)篩選腫瘤抗原。1995年血清學(xué)鑒定重組cDNA表達(dá)文庫(kù)技術(shù)(serologicalanalysisofrecombinantcDNAexpressionlibraries,SEREX)被建立起來(lái)。其原理是建立腫瘤細(xì)胞cDNA文庫(kù),病人血清中可能存在高滴度IgG抗體,去除干擾抗體,對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選,測(cè)定陽(yáng)性克隆的DNA序列并到數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定。該法不需要CTL克隆和自體腫瘤細(xì)胞培養(yǎng),較簡(jiǎn)便和高效,一次鑒定的抗原量較多但所獲得的抗原不一定可被T細(xì)胞識(shí)別。目前,利用該法獲得的腫瘤抗原有NY-ESO-1、酪氨酸酶、NY-LV-12等。SEREX法已鑒定了2000多種腫瘤抗原。近期,Shigematsu等用SEREX法篩選出兩個(gè)胸膜間質(zhì)瘤的相關(guān)抗原Gene-X和THBS-2,這有利于胸膜間質(zhì)瘤的診斷、治療以及疫苗的研發(fā)。2.4表位預(yù)測(cè)法表位預(yù)測(cè)法又稱為“逆向免疫法”,它是根據(jù)基因產(chǎn)物的序列來(lái)預(yù)測(cè)與MHC-Ⅰ結(jié)合的抗原表位。目前已建立了用于預(yù)測(cè)和MHC-Ⅰ結(jié)合表位的數(shù)據(jù)庫(kù)(SYFPEITHI),通過(guò)這種方法可鑒定多個(gè)免疫原性多肽。Wang等用SYFPEITHI預(yù)測(cè)了EB病毒潛在膜蛋白2A(LMP2A)的CTL抗原表位,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種多肽LMP2A(264-272)、LMP2A(426-434)和LMP2A(356-364)能激活特異性CD8+CTL。因此,這些抗原肽有利于EB病毒相關(guān)鼻咽癌疫苗的研發(fā)。2.5組合肽庫(kù)技術(shù)組合肽庫(kù)技術(shù)(Combinatorialpeptidelibraries)是建立能激活T淋巴細(xì)胞的模擬抗原表位隨機(jī)肽庫(kù),來(lái)篩選某特定的氨基酸序列以獲得模擬抗原表位。目前,這種技術(shù)多采用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)的形式,經(jīng)過(guò)幾輪重復(fù)洗滌,洗脫,擴(kuò)增過(guò)程之后便篩選出與靶部位特異性結(jié)合的陽(yáng)性克隆。Chung等噬菌體展示組合肽庫(kù)(7肽)篩選抗-JL1白血病單克隆抗體,結(jié)果獲得與這個(gè)抗-JL1結(jié)合的模擬抗原表位的氨基酸序列。這些表位的獲得對(duì)癌癥疫苗的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。2.6蛋白組學(xué)技術(shù)蛋白組學(xué)技術(shù)是聯(lián)用二維電泳和質(zhì)譜分析細(xì)胞、組織或器官中蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。這是一種簡(jiǎn)便、有效的腫瘤抗原的鑒定方法。它的原理是利用二維電泳分離腫瘤細(xì)胞中提取的所有蛋白質(zhì),然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,以腫瘤患者的血清為一抗并以正常的血清為對(duì)照用Westernblot篩選出陽(yáng)性蛋白質(zhì),再通過(guò)質(zhì)譜分析陽(yáng)性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。Farina等用蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)胰腺癌病人膽汁進(jìn)行分析,結(jié)果鑒定了127種蛋白質(zhì),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CEACAM6和MUC1(CA19-9)在胰腺癌中呈過(guò)度表達(dá)。這種技術(shù)是以腫瘤體液免疫反應(yīng)為基礎(chǔ),但優(yōu)點(diǎn)是所鑒定出的蛋白質(zhì)具有天然的空間構(gòu)象,因此,它被廣泛用于腫瘤抗原的篩選和鑒定。2.7其他系統(tǒng)性的基因分析方法除上述方法外,還有一系列系統(tǒng)的基因分析方法用于對(duì)腫瘤抗原的鑒定。包括DNA芯片分析技術(shù)(DNAchip)、基因差異顯示技術(shù)(genedifferentialdisplay)、表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetags)數(shù)據(jù)庫(kù)、基因表達(dá)系列分析(serialanalysisofgeneexpression)等。3研制腫瘤抗原腫瘤疫苗與傳統(tǒng)疫苗的區(qū)別是它是一種治療性的主動(dòng)免疫療法,并不是預(yù)防某病原體的感染。隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展,腫瘤免疫耐受機(jī)制逐漸被認(rèn)識(shí)以及越來(lái)越多的腫瘤抗原被鑒定,這都有利于腫瘤疫苗的研制與開發(fā)。目前,大部分腫瘤疫苗(胃癌瘤苗、肺癌瘤苗、黑色素瘤瘤苗等)只在動(dòng)物模型中試驗(yàn),僅有小部分進(jìn)入臨床試驗(yàn)(宮頸癌疫苗、乳腺癌疫苗)。腫瘤疫苗的制備方法也在不斷改進(jìn),現(xiàn)已發(fā)展到基因修飾、細(xì)胞融合等方法制備腫瘤疫苗。相信在不久的未來(lái)腫瘤疫苗會(huì)成為手術(shù)、放療和化療后新型腫瘤治療手段。3.1重組細(xì)胞疫苗傳統(tǒng)的腫瘤疫苗是將腫瘤細(xì)胞用射線滅活,使其失去致瘤性然后加一些合適的免疫佐劑回輸?shù)綑C(jī)體中,誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒抗腫瘤效應(yīng)。然而,這種疫苗的效果并不理想,因?yàn)槟[瘤抗原被一些基團(tuán)掩蔽且表面MHC分子、共刺激信號(hào)減少或缺失,這都降低了腫瘤細(xì)胞的免疫原性不利于APCs激活細(xì)胞毒T細(xì)胞。目前,腫瘤細(xì)胞疫苗已用基因工程的方法改造,將編碼免疫原性的腫瘤抗原基因或共刺激信號(hào)基因、加強(qiáng)免疫反應(yīng)細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染給腫瘤細(xì)胞,然后用理化方法滅活并加入合適的免疫佐劑注射到荷瘤機(jī)體中,觀察其對(duì)腫瘤的效應(yīng)。這種疫苗在動(dòng)物水平試驗(yàn)中都取得很好的效果,能產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒抗腫瘤效應(yīng)。呂冬梅等用含IL-12基因的腺病毒載體在體外以不同的感染系數(shù)感染Lewis肺癌細(xì)胞,然后接種到C57BL/6小鼠皮下。結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘤苗不但沒(méi)有致瘤性且用Lewis肺癌細(xì)胞再次接種仍沒(méi)有腫瘤生長(zhǎng),用B16黑色素瘤接種10~12d卻長(zhǎng)出了腫瘤,這說(shuō)明了該瘤苗有特異性抗腫瘤效應(yīng)。Yang等從健康志愿者中提取的B7-H3基因轉(zhuǎn)染給人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113制成瘤苗TCV-hB7-H3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性增強(qiáng),IFN-mu表達(dá)提高,TCV-hB7-H3能加強(qiáng)抗腫瘤特異性的免疫反應(yīng)。轉(zhuǎn)基因的腫瘤細(xì)胞疫苗在動(dòng)物模型中已證明有抗腫瘤的效果,這種疫苗已經(jīng)從自體瘤發(fā)展到異體瘤了。3.2費(fèi)用抑制劑的轉(zhuǎn)化)樹突狀細(xì)胞(DC)是體內(nèi)活性最強(qiáng)的APC,它能分泌豐富的細(xì)胞因子、表達(dá)黏附分子和共刺激分子。DC的獲得是從骨髓中提取單核細(xì)胞,在細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、GM-CSF)培養(yǎng)分化并成熟。目前,以DC制備的腫瘤疫苗主要有以下3種:(1)通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法將編碼腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)染給DC,使其表達(dá)腫瘤抗原并對(duì)其加工,然后加佐劑回輸?shù)綑C(jī)體中誘導(dǎo)特異性抗腫瘤效應(yīng)。Nabekura等用人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)給DC,動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤細(xì)胞毒效應(yīng)和體液免疫反應(yīng)。表明轉(zhuǎn)基因DC疫苗有很強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)。(2)用腫瘤細(xì)胞裂解物致敏DC制備DC疫苗,這種方法能使腫瘤細(xì)胞所有抗原都和DC直接接觸,因此更有利于腫瘤抗原的加工和提呈。(3)通過(guò)細(xì)胞融合制備DC疫苗也成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),目前多采用自體腫瘤細(xì)胞在PEG或電場(chǎng)作用下與DC進(jìn)行融合制備雜交瘤。這種雜交瘤最大的優(yōu)點(diǎn)是不僅表達(dá)腫瘤抗原,也表達(dá)豐富的MHC分子。因此,這種雜交瘤具有較高的免疫原性和抗原提呈作用。Guo等用DC與Ewing’s肉瘤細(xì)胞(A673)在電場(chǎng)中融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生更強(qiáng)的CTL效應(yīng)比用抗原負(fù)載DC的方法制備瘤苗。因此,細(xì)胞融合法制備DC疫苗是一種非常有前景的腫瘤疫苗制備方法。3.3近局部的冷卻系統(tǒng)和轉(zhuǎn)體近自然森林的dna融合疫苗DNA疫苗是將編碼腫瘤抗原的DNA經(jīng)基因槍肌注或真皮內(nèi)注射。注射的DNA可被皮膚中的郎格漢斯細(xì)胞或DC攝取并表達(dá)腫瘤抗原,提呈給鄰近淋巴結(jié)T細(xì)胞,誘導(dǎo)特異性抗腫瘤效應(yīng)。目前,DNA疫苗多采用轉(zhuǎn)基因形式將目的基因與載體重組成表達(dá)質(zhì)粒,然后接種到機(jī)體內(nèi),這種DNA融合疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已取得較好的效果。Radkevich-Brown等Her-2DNA電接種到人Her-2的轉(zhuǎn)基因小鼠中(C57BL/6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠發(fā)生明顯的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此,DNA疫苗也是腫瘤疫苗的一種重要形式。3.4hsp60與運(yùn)動(dòng)細(xì)胞免疫反應(yīng)抗原提呈細(xì)胞中MHC-Ⅰ肽或MHC-Ⅱ肽能誘發(fā)抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng),這些肽都是20個(gè)氨基酸以內(nèi)免疫原性的小分子多肽。因此,對(duì)與MHC分子結(jié)合區(qū)域的研究和預(yù)測(cè),可以設(shè)計(jì)出能激活T細(xì)胞的多肽疫苗。目前,無(wú)論是從腫瘤抗原得到的多肽還是外源合成的多肽類似物做成的疫苗都顯示有抗腫瘤效果,而且有的多肽疫苗還進(jìn)入了臨床試驗(yàn)。Kenter等從HPV-16E7中分離得到的重疊長(zhǎng)肽注射到35位晚期宮頸癌病人中,IFN-r酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析顯示該長(zhǎng)肽能產(chǎn)生強(qiáng)大的細(xì)胞免疫反應(yīng)。熱休克蛋白疫苗在國(guó)內(nèi)外也是一個(gè)研究的熱點(diǎn)。熱休克蛋白本是細(xì)胞內(nèi)的分子伴侶,參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組裝與折疊,它是進(jìn)化過(guò)程中最保守的蛋白之一。熱休克蛋白家族中HSP70與腫瘤免疫最密切,在腫瘤細(xì)胞中,一些有免疫原性的多肽與HSP70結(jié)合,HSP70還有提呈抗原的作用。因此,提取腫瘤細(xì)胞中的HSP70或體外將HSP70與抗原肽融合制備多肽疫苗成為一個(gè)亮點(diǎn),研究表明,HSP70疫苗能加強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)。Jimbo等從白血病細(xì)胞A20提取HSP70注射到荷有A20的小鼠中,結(jié)果產(chǎn)生抗HSP70多肽的抗體,并對(duì)A20有細(xì)胞毒作用。隨著越來(lái)越多的腫瘤抗原被鑒定,HSP70疫苗的應(yīng)用也將越來(lái)越廣泛。3.5預(yù)防腫瘤感染流行病學(xué)研究表明,某些腫瘤與病毒感染密切相關(guān),如乙肝病毒與肝癌、人類乳頭瘤病毒與宮頸癌、EB病毒與鼻咽癌等。預(yù)防性腫瘤疫苗主要是預(yù)防某特定