共焦顯微鏡與組織病理檢查對(duì)真菌性角膜炎的診斷價(jià)值

共焦顯微鏡與組織病理檢查對(duì)真菌性角膜炎的診斷價(jià)值

0fk其他致病性感染的臨床研究真菌性角膜炎（fk）是一種高度盲的疾病。近年來(lái)，由于廣泛使用抗生素、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑以及膜接觸顯微鏡的增加，發(fā)病率顯著增加。fk有許多常見(jiàn)的病毒，如刀菌、沙丁魚(yú)、細(xì)菌等。在中國(guó)，大多數(shù)病毒都可以用刀菌和沙丁魚(yú)感染。比較了膜豆菌和革蘭氏菌在不同膜豆菌感染中的生長(zhǎng)特征。1材料和方法1.1材料表面健康成年有色兔24只,質(zhì)量2.0~2.5kg,雌雄兼用(西安交通大學(xué)動(dòng)物中心).使用前裂隙燈顯微鏡檢查,證實(shí)無(wú)眼前節(jié)病.1.2曲霉菌模型的制作實(shí)驗(yàn)前3d,給與妥布霉素眼液點(diǎn)眼4次/d.將24只兔隨機(jī)分成A,B兩組,每組12只.處死A組兔,無(wú)菌條件下摘取眼球,用φ8mm環(huán)鉆制備全厚角膜植片備用.B組兔右眼為模型眼,左眼為對(duì)照眼.皮下注射速眠新Ⅱ0.2mL/kg進(jìn)行全身麻醉,右眼10g/L地卡因液表面麻醉,5mL/L慶大霉素溶液沖洗結(jié)膜囊,用φ5mm環(huán)鉆在角膜中央劃痕,刮除劃痕中的角膜上皮.取制備好的角膜植片從內(nèi)皮面作“#”形劃痕后,用10-0尼龍線放射狀縫合8針將其固定于刮除上皮的角膜上.用注射器抽取0.1mL曲霉菌混懸液將其注入植片與植床角膜層間的中央,結(jié)膜囊涂紅霉素眼膏,3-0絲線縫合上下眼瞼.左眼與右眼制作方法相同,植片與植床角膜層間注入0.1mL生理鹽水作為對(duì)照.3d后拆除眼瞼縫線,去除角膜植片,觀察B組兔角膜情況.分別在造模后的第3,7,10,15日行裂隙燈顯微鏡、角膜刮片、角膜共焦顯微鏡(日本NIDEK公司confoscan3)、角膜病理切片檢查及真菌培養(yǎng)且分別處死3只兔,沿角膜緣切取角膜、虹膜,按子午線方向剖成兩等份,一份常規(guī)行40g/L甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE(蘇木素-伊紅)染色和PAS(高碘酸-希夫)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變并拍照,一份送培養(yǎng).2結(jié)果2.1兔視網(wǎng)膜組織病理學(xué)檢測(cè)接種真菌的12只兔眼均一次接種成功,在接種的第3日可觀察到淺層角膜真菌病變,病變角膜與健康角膜邊界清晰,角膜表面粗糙,輕度隆起,基質(zhì)混濁水腫,前房無(wú)積膿.第7日,可見(jiàn)明顯潰瘍?cè)畈⒂刑笜訅乃澜M織附著,潰瘍邊緣稍隆起毛糙不齊,部分兔角膜周邊可見(jiàn)衛(wèi)星灶,內(nèi)皮面有內(nèi)皮斑,角膜彌漫性霧狀水腫,前房可見(jiàn)積膿.第10日,潰瘍?cè)羁s小炎癥反應(yīng)減輕.第15日,上皮基本完整,可見(jiàn)瘢痕形成.對(duì)照組3d時(shí),角膜上皮基本愈合.2.2曲霉菌的分布3.9moL/L氫氧化鉀濕片法檢查,第3,7日均可查見(jiàn)較粗、長(zhǎng)、有分隔的曲霉菌菌絲,及成串的分生孢子,聚集似菊花樣.第10,15日未見(jiàn)到菌絲、孢子.2.3炎癥細(xì)胞加前房形貌早期(接種3d)見(jiàn)較直、短、分支比較少的高反光的菌絲及孢子,菌絲在角膜病灶邊緣生長(zhǎng)明顯,以垂直、斜行生長(zhǎng)方式為主,角膜基質(zhì)細(xì)胞腫脹其間伴有少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A).中期(接種7,10d)在角膜中深基質(zhì)層可見(jiàn)高反光的菌絲明顯變長(zhǎng),數(shù)量增多,周圍見(jiàn)大量的炎癥細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞等)浸潤(rùn),及局灶性團(tuán)狀無(wú)細(xì)胞區(qū),病變角膜內(nèi)皮面附著大量團(tuán)、片狀滲出物,突于前房?jī)?nèi),內(nèi)皮細(xì)胞腫脹邊界欠清晰(圖1B).后期(接種15d)可在基質(zhì)深層見(jiàn)到少量稀疏分布、短小的真菌菌絲,未見(jiàn)孢子,病變角膜局部可見(jiàn)強(qiáng)反光無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的瘢痕形成(圖1C).2.4he染色表現(xiàn)PAS染色早期(接種3d)見(jiàn)少量菌絲平行生長(zhǎng)于膠原纖維之間(圖2A).中期(接種7,10d)見(jiàn)大量菌絲斜行、垂直或平行生長(zhǎng)于基質(zhì)層,菌絲周圍可見(jiàn)圓形高反光孢子,呈串珠樣排列(圖2B).虹膜組織腫脹,血管高度擴(kuò)張充血,可見(jiàn)大量新生血管.后期(接種15d)未見(jiàn)明顯菌絲生長(zhǎng).HE染色早期(接種3d)見(jiàn)基質(zhì)細(xì)胞腫脹,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯.中期(接種7,10d)見(jiàn)基質(zhì)細(xì)胞腫脹明顯,局部組織溶解,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以中性粒細(xì)胞為多,病灶局部也可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞.后期(接種15d)見(jiàn)基質(zhì)細(xì)胞腫脹減輕,角膜小面形成,膠原纖維排列紊亂,基質(zhì)層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少(圖2C).2.5培訓(xùn)角膜標(biāo)本接種于Sabouraud培養(yǎng)皿上,將其置于25℃下培養(yǎng)可見(jiàn)有曲霉菌菌落生長(zhǎng).3臨床病理切片檢查目前,臨床診斷真菌性角膜炎的方法有刮片染色,培養(yǎng),病理切片,角膜共焦顯微鏡和多聚酶鏈反應(yīng)(PCR),然而這些方法在臨床早期診斷中都存在一定的不足.因此真菌性角膜炎的臨床早期快速診斷方法仍是目前的研究熱點(diǎn)之一.角膜共焦顯微鏡能在活體上從四維(三維空間和時(shí)間)水平對(duì)角膜組織進(jìn)行快速的、無(wú)損傷的光學(xué)斷層掃描成像.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立與真菌性角膜炎發(fā)病相似的動(dòng)物模型,應(yīng)用角膜共焦顯微鏡可直觀的看到菌絲、孢子的形態(tài),菌絲在角膜基質(zhì)內(nèi)的生長(zhǎng)方式(如垂直、斜性、平行生長(zhǎng)),侵入角膜組織的層面及角膜內(nèi)皮面的反應(yīng)情況,顯示菌絲的立體生長(zhǎng)狀態(tài).共焦顯微鏡檢查時(shí),物鏡鏡頭并不與角膜直接接觸,而是通過(guò)一種對(duì)角膜有保護(hù)作用的眼用凝膠接觸受檢查的角膜,不會(huì)對(duì)角膜造成損傷,在病情發(fā)展過(guò)程中可以反復(fù)多次的進(jìn)行檢查,為及時(shí)判斷病情,評(píng)價(jià)療效,制定治療方案提供客觀依據(jù),亦可指導(dǎo)臨床角膜刮片的再次取材部位,為提高其檢測(cè)陽(yáng)性率提供可靠的依據(jù).通過(guò)兔模型組織病理切片的常規(guī)染色和特異性染色,可觀察到某一時(shí)間點(diǎn)病變角膜中真菌菌絲形態(tài)、數(shù)量的變化,侵入角膜的范圍,區(qū)分中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況.但臨床病理切片只能通過(guò)活檢或手術(shù)后獲得,部位局限,容易漏診,且無(wú)法在活體角膜上觀察病變角膜的病情演變;而共焦顯微鏡具有無(wú)創(chuàng)性、可重復(fù)性,它可在活體對(duì)真菌性角膜炎發(fā)病過(guò)程中菌絲的形態(tài)、數(shù)量變化,生長(zhǎng)方式,侵入角膜組織的范圍、深度以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的部位進(jìn)行詳細(xì)的觀察,這也為真菌性角膜炎的臨床治療用藥,手術(shù)方式的選擇提供了重要的依據(jù).病理切片的標(biāo)本制作需經(jīng)組織切片、固定和特殊染色(如PAS染色)等處理,在此過(guò)程中不可避免的帶入了人為干擾因素,尤其在角膜只有少量菌絲生長(zhǎng)時(shí).因此在兔真菌性角膜炎造模的后期,在角膜只有少量菌絲生長(zhǎng)時(shí),很可能因人為干擾因素或切片部位的差異而病理切片未能檢到菌絲.共焦顯微鏡檢查對(duì)角膜組織進(jìn)行的是快速的光學(xué)斷層掃描成像無(wú)需特殊處理,既縮短了檢查所需的時(shí)間,也減少了標(biāo)本處理過(guò)程中可能帶入的人為干擾因素和所造成的假象.故造模后期除共焦顯微鏡仍可在角膜深基質(zhì)層見(jiàn)到少量菌絲外其余檢查均未檢見(jiàn)菌絲,也體現(xiàn)了共焦顯微鏡在真菌檢測(cè)中具有更高的靈敏性,這對(duì)真菌性角膜炎潰瘍愈合后仍需繼續(xù)用藥以防復(fù)發(fā)提供了客觀依據(jù).真菌性角膜炎的致病菌種類較多,形態(tài)各異,共焦顯微鏡對(duì)不同菌種的影像學(xué)特點(diǎn)目前尚無(wú)統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn),只能根據(jù)形態(tài)區(qū)分絲狀類真菌和孢子類真菌,而不像病理切片可確定具體菌種.它可進(jìn)行與組織病理切片同樣的關(guān)于菌絲及孢子的形態(tài)、數(shù)量變化,菌絲生長(zhǎng)方式,侵入角膜組織的范圍、深度以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的部位等詳細(xì)的觀察,但由于不能進(jìn)行活體組織染色,目前對(duì)炎癥細(xì)胞的種類上不能區(qū)分,在病變區(qū)周圍僅從形態(tài)上可辨認(rèn)出有分葉的中性粒細(xì)胞和小園形細(xì)胞可能為淋巴細(xì)胞.共焦顯微鏡雖具有無(wú)創(chuàng)性、可重復(fù)性及早期快速診斷的優(yōu)點(diǎn),但其在檢查過(guò)程中需要患者的密切配