八年制細胞與分子生物學實驗備考

八年制細胞與分子生物學實驗備考Part1十五個實驗概要Experiment1細胞有絲分裂間期：有明顯的細胞核，染色質(zhì)分布較均均，由于染色質(zhì)易與堿性染料結(jié)合，故細胞核的染色比細胞質(zhì)深。核中可見1～3個染色較淺的呈球狀的核仁前期：細胞核膨大，染色質(zhì)逐漸螺旋化為絲狀的染色絲，其后染色絲進一步縮短變粗，形成一定形態(tài)和書目的染色體（這時候的每條染色體由兩條染色單體組成，但在光鏡下一般不易看清），核膜、核仁逐漸消失中期：每條染色體中的成對染色單體逐漸分開（但著絲粒仍未分離）全部染色體（2n=16）移向細胞中央的赤道面上，形成赤道板。在赤道板到兩面有許多紡錘絲連接細胞兩極和染色體的著絲點，成為紡錘體，但不易觀察到，此時染色體形態(tài)最典型后期：著絲?？v裂為二。這是，每條染色體的兩條染色單體已完全分開，由于紡錘絲的牽引，分別向細胞的兩極移動，形成了數(shù)目相等的兩組染色體（這是所觀察到的染色體數(shù)目比原來增加1倍，是由于S期內(nèi)DNA含量倍增的結(jié)果）末期：染色體移到兩極并解旋為染色質(zhì)，細胞中部出現(xiàn)細胞板，并逐漸向邊緣發(fā)展。當染色質(zhì)構(gòu)成核網(wǎng)時，核膜、核仁重新出現(xiàn)。細胞板達到兩邊，分裂結(jié)束，形成兩個子細胞，細胞又進入間期狀態(tài)。Experiment2動物染色體的制備原理：染色體只有在分裂期的細胞，特別是中期細胞中表現(xiàn)出典型形態(tài)便于觀察和計數(shù)，所以必須采取特殊的技術(shù)方法，從發(fā)生有絲分裂的組織和細胞懸液中得到。最常用的途徑是從骨髓細胞、血淋巴細胞和組織培養(yǎng)的細胞中制備。骨髓細胞數(shù)量多、分裂旺盛，不需體外培養(yǎng)和無菌操作，便于取材。秋水仙素的作用：抑制紡錘體的形成，使細胞停留在分裂中期KCl低滲溶液：使細胞膨脹，促使中期染色體散開固定液：有固定作用，對染色體還有一定的分散作用Giemsa染色液：染色結(jié)果：低倍鏡下，可見到許多大小不等被染成紫紅色呈圓形的間期細胞核以及分散在它們之間的中期分裂象。小鼠染色體一般呈“U”形，染色體2n=40Experiment3蟾蜍血細胞的體外融合原理：細胞融合又稱體細胞雜交，通過培養(yǎng)和誘導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程。是指用人工方法使兩個或兩個以上的體細胞融合成異核體細胞，隨后異核體同步進入有絲分裂，核膜崩潰，來自兩個親本細胞的基因組合在一起形成只含有一個細胞核的雜種細胞，此雜交細胞具有很強的生命力，增殖旺盛。細胞融合技術(shù)是研究細胞遺傳、基因定位、細胞免疫、病毒和腫瘤的重要手段，也是制備單克隆細胞株的重要技術(shù)。肝素：血液抗凝PEG溶液：促進細胞凝集Hanks溶液：終止PEG作用，平衡緩沖溶液使PEG的濃度降低至誘導融合的要求。詹納斯綠：染液Experiment4AKPKm測定原理：在溫度pH和酶濃度一定時，酶促反應(yīng)初速度與底物濃度的關(guān)系滿足Km是酶的特征常數(shù)，反映了酶與特定底物的親和力大小。測定Km值通常用雙倒數(shù)法，推導上述米-曼氏方程式可得一直線方程：在橫坐標上的截距即可算出Km值。AKP最適pH為10，而酶蛋白最穩(wěn)定pH為8，測定其Km值時反應(yīng)體系選擇其最適pH。本實驗取pH為10。Experiment5葡萄糖定量方法─標準管法測定葡萄糖含量原理：在葡萄糖氧化酶的催化作用下β-D葡萄糖氧化成過氧化氫和葡萄糖酸，在過氧化酶的存在下，過氧化氫與苯酚、4-氨基安替比林與偶聯(lián)酚縮合成可被分光光度計測定的紅色醌類化合物。其紅色在510nm波長處有最大吸收峰，顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與血葡萄糖濃度成正比。結(jié)果：人體正常血糖：3.9～5.8mmol/LExperiment6蛋白質(zhì)定量測定方法─標準曲線法測定蛋白質(zhì)含量原理：雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物，在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物，此反應(yīng)即為雙縮脲反應(yīng)。含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都具有雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)含有多個肽鍵，在堿性溶液中能與銅離子絡(luò)合成紫紅色化合物。其顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，可以用比色法進行鑒定。Experiment7酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)─雙抗體夾心法原理：酶聯(lián)免疫吸附試驗是一種固相酶免疫測定的方法，目前廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的檢測。其基本原理是將抗原或抗體固定在固相載體表面，并保持其免疫活性，再與酶標記抗體或抗原聯(lián)結(jié)，并保留酶的活性，然后加入酶反應(yīng)的底物，后者被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，反應(yīng)顏色的深淺可與相應(yīng)抗原或抗體的量相關(guān)。在本實驗中（1）用一直抗體包被固相載體；（2）加入受檢的標本（含待測抗原），使抗原與固相上的抗體結(jié)合；（3）加入以辣根過氧化物酶標記的已知抗體，使之與抗原結(jié)合。標記的酶可催化底物（四甲基聯(lián)苯胺）起顯色反應(yīng)，從而指示特異性抗原抗體反應(yīng)的存在。Experiment8血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳原理：血清蛋白的pI都在7.5以下，在pH8.6的巴比妥緩沖液中以負離子的形式存在，分子大小，形狀也各有差異，所以在電場作用下，可在醋酸纖維薄膜上分離成A、α1、α2、β、γ五條區(qū)帶。電泳結(jié)束后，將醋酸纖維薄膜置于染色液，使蛋白質(zhì)固定并染色，再脫色結(jié)果：A、α1、α2、β、γExperiment9免疫電泳與對流免疫電泳原理：免疫電泳是將電泳與雙向瓊脂擴散相結(jié)合的一種抗原分析方法。首先根據(jù)抗原中各種蛋白質(zhì)組分的電荷和分子量大小的不同，在電場作用下有不同的遷移率，從而可將抗原混合物中的各種不同組分分開，然后使其與特異性抗體進行雙向擴散，發(fā)生免疫學沉淀反應(yīng)。對流免疫電泳是電泳技術(shù)與雙向瓊脂擴散技術(shù)相融合而形成的一種定向加速的凝膠內(nèi)免疫沉淀反應(yīng)。與雙向瓊脂擴散技術(shù)中抗原與抗體分別向四周自由擴散不同，對流免疫電泳在凝膠中加一直流電場，抗原和抗體受到電泳和電滲兩種力量的綜合作用而向某一方向定向加速移動，因此可以提高靈敏度，明顯縮短反應(yīng)時間。Experiment10小鼠脾單個核細胞的分離─密度梯度離心法：原理：本次實驗根據(jù)顆粒沉降原理，將不同密度的小鼠脾臟細胞置于淋巴細胞分離液上進行水平式離心，使單個核細胞在其沉降運動中位于分離液潔面上；達到分離小鼠脾單個核細胞的目的。已知小鼠淋巴細胞和單核細胞的密度約為1.088，而紅細胞與粒細胞的密度均大于1.088。因此，用密度為1.088±0.001的淋巴細胞分離液通過密度梯度離心方法，可從小鼠脾臟細胞分離得到單個核細胞。而分離人單個核細胞的淋巴細胞分離液密度為1.077±0.001.Experiment11凝膠柱層析分離鑒定蛋白質(zhì)原理：利用交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50的凝膠過濾作用，將脲酶和胰島素分開，以Folin-Denis反應(yīng)檢查流出液中的蛋白質(zhì)。此反應(yīng)主要靠蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸與含磷鉬鎢酸的酚試劑生成藍色鉬藍，藍色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比關(guān)系。以納氏試劑檢查脲酶活性，此反應(yīng)是先將脲酶流出液分解尿素產(chǎn)生胺，而氨可與納氏試劑作用生成黃色的碘代雙汞胺。脲酶試劑：分子篩層析結(jié)果：先分離出脲酶，再分離出胰島素，出現(xiàn)兩個峰值Experiment12DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析原理：聚酰胺薄膜層析是一類較特殊的吸附分配層析?；旌衔镫S流動相通過聚酰胺薄膜時，由于被分離的物質(zhì)與聚酰胺薄膜上的酰胺基團形成氫鍵，各種物質(zhì)形成氫鍵能力強弱不同，決定了吸附力的差異，吸附力強展層速度較慢，吸附力弱展層速度較快，同時展層溶劑與被分離物質(zhì)在聚酰胺粒子表面競爭形成氫鍵，選擇適當?shù)恼箤尤軇贡环蛛x物質(zhì)在溶劑與聚酰胺薄膜表面之間分配系數(shù)產(chǎn)生最大差異。一般講，易溶于展層劑的所受到的動力作用大，展層速度塊，反之速度就慢。通過各物質(zhì)的吸附力和分配系數(shù)不同，使得被分離的物質(zhì)在聚酰胺薄膜層析中得到分離。結(jié)果：聚酰胺薄膜上出現(xiàn)9～10個點。Experiment13鼠肝DNA的提取和純化原理：DNA是染色體的主要組成成分，是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。DNA在生物組織中往往以核蛋白的形式主要存在于細胞核中，分子量甚大，人的染色體DNA（單倍體23條染色體）平均分子量約為6×10（10）道爾頓，約相當于1.3×10（5）kb。提取DNA最基本的要求是保持DNA大分子的完整性及純度，避免機械張力（剪切）引起DNA分子的降解，注意對雜質(zhì)及蛋白質(zhì)的去除，防止細胞內(nèi)存在的DNA酶對DNA的酶解。苯酚-氯仿混合液：使蛋白質(zhì)變性，混合液分層冰無水乙醇及70%乙醇：乙醇吸收DNA分子周圍的水分，DNA失水形成白色絮狀沉淀RNase：降解RNA蛋白酶K：裂解細胞，消化蛋白質(zhì)，使核蛋白解聚并使細胞內(nèi)存在的DNA酶失活。結(jié)果：A260/A280接近1.80說明樣品純度越高。Experiment14PCR技術(shù)檢測β-actin基因原理：PCR的原理類似于天然DNA的復制，主要利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性，模仿體內(nèi)的復制過程，在附加的一對引物（人工合成的寡核苷酸片段，它與待擴增片段兩條鏈的兩段DNA序列分別互補）之間引發(fā)聚合酶反應(yīng)。DNA樣品：提供DNA合成的模板引物：提供3’-OH末端，特異性擴增，界定擴增范圍4種dNTP：雙鏈合成的原料TaqDNA聚合酶：5’→3’聚合，3’→5’內(nèi)切其他試劑：Mg2+：Taq酶活性中心需要Tris-HCl：提供最適pH:6.8~7.8KCl：促進引物退火（使引物加到DNA鏈上）明膠：穩(wěn)定酶的作用Experiment15瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段原理：在pH8.0-8.3的緩沖液中，核酸分子帶負電荷，向正極移動。由于不同大小和構(gòu)象的核酸分子電荷密度大致相同（忽略堿基上的部分電荷，每個核苷酸殘基都帶二個負電荷），因此在自由泳動時，各種核酸分子的遷移率相似，無法分開。然而，在濃度適當?shù)沫傊悄z中，由于分子篩效應(yīng)，使大小和構(gòu)象不同的核酸遷移率出現(xiàn)差異，從而把它們分開。溴乙錠：染色劑（吖啶橙）結(jié)果：在紫外燈下可以看見220bp的熒光帶出現(xiàn)在溴酚藍的后面。DNA片段的熒光強弱由DNA含量決定，而DNA的遷移率反映了DNA片段的大小。Part1前輩考場記題11臨八細胞與分子生物學實驗考試by趙志宇一、每題6分，共30分1、雙抗體夾心法定義、操作過程、注意事項（P75）2、聚丙烯酰胺凝膠電泳與?等電聚焦電泳區(qū)別（P5電泳技術(shù)，P16等電）3、小鼠脾單個核細胞的分離，離心后從上到下都是什么成份，然后一個計數(shù)的計算（P45）4、兩種核酸抽提的基本原則（純度、完整性）如何鑒別5、PCR原理、體系內(nèi)各組分作用（P59）二、三選二（每個5分，共10分）1、對流免疫電泳原理（P19）2、寫2種蛋白質(zhì)定量方法，就其中一種詳細說明（P47?P55蛋白質(zhì)技術(shù)）3、Ampholine（P17）、聚酰胺薄膜（P32）、秋水仙素（P92）、細胞融合中PEG（P87）的作用BY錢芳菲一、名解1、免疫電泳2、密度梯度離心法二、實驗1、一個ELISA實驗——雙抗體夾心法的概念、注意事項2、一個等電聚焦電泳實驗（要求寫出試劑、分離情況）三、問題1、Ampholine、聚酰胺薄膜、DNA提純中SDS、EDTA的作用2、PCR原理、反應(yīng)體系中各物質(zhì)作用1、PCR原理：該技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的情況下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段DNA片段來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此為起點，沿模板5’→3’方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。而新合成的鏈又可作為下一輪反應(yīng)的模板，如此循環(huán)往復，每循環(huán)一次，DNA分子數(shù)即按指數(shù)倍增（2n）。反應(yīng)體系中各物質(zhì)作用：①模板DNA：模板。②引物：開始階段結(jié)合到DNA模板的一段互補序列部位，啟動DNA雙鏈的合成。③4種脫氧核苷酸：原料。④耐熱的DNA聚合酶：催化。⑤適宜的緩沖液：用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。2、①密度梯度離心法：用離心機對小分子物質(zhì)溶液，長時間加一個離心力場達到沉降平衡，在沉降池內(nèi)從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子、細胞溶液，則溶液內(nèi)比溶劑密度大的部分就產(chǎn)生沉降，比溶劑密度小的部分就會上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子、細胞帶狀物。利用這種現(xiàn)象，測定蛋白質(zhì)、細胞等的浮游密度，或根據(jù)其差別進行分離的一種沉降平衡法。②注意事項：1、注意淋巴細胞分離液與脾細胞懸液的比例，一般以1:2~1:3為宜。2、注意離心溫度，最適溫度為18~20°C。過低則細胞丟失，過高則細胞失活。分離得到的單個細胞可暫時保存在10%FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液中，在4°C條件下（減低細胞代謝），可保存24h。取出時不要迅速升溫，以免細胞因溫度“休克”。3、加入脾細胞懸液時應(yīng)十分小心，注意保護分離液界面，切勿混淆破壞分離液密度從而影響分離效果。4、每個吸取細胞懸液的步驟，都要注意混勻細胞。5、做細胞活力檢查時，錐蘭染色后應(yīng)盡快計數(shù)完畢，時間過長則細胞活力可能降低。③設(shè)計實驗分離得到CD8+細胞：利用免疫磁珠法：磁珠表面包被CD8抗體，放入細胞混合液中，進行抗原抗體反應(yīng)，在CD8+細胞表面形成玫瑰花結(jié)，將這些細胞置于強大的磁場下，結(jié)合了磁珠的CD8+細胞就會與其他未被結(jié)合的細胞分群，具超強順磁場的磁珠脫離磁場后立即消失磁性，這樣就可以達到分離得到CD8+細胞的目的。3、雙向免疫擴散實驗：將抗原抗體分別加到瓊脂凝膠板上的小孔中，使兩者相互自由擴散，經(jīng)一段時間后，若兩者特異性結(jié)合，即在比例適當處形成可見的白色沉淀線，根據(jù)沉淀線的位置、數(shù)量、形狀以及對比各沉淀時間的關(guān)系，對抗原抗體進行定性分析的一種實驗方法。4、ELISA（酶聯(lián)免疫吸附實驗）：將可溶性的抗原或抗體吸附到固相載體上，并保持其免疫活性，使之結(jié)合并吸附結(jié)合抗體或抗原，通過洗滌去除未結(jié)合成分，再與酶標記的抗體或抗原結(jié)合，并保留酶的活性，然后加入酶反應(yīng)的底物，后者被催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)反應(yīng)顏色的深淺進行免疫反應(yīng)的定性和定量的方法。5、聚酰胺薄膜作用：混合物隨流動相通過聚酰胺薄膜時，由于被分離物質(zhì)與聚酰胺薄膜上的酰胺基團形成氫鍵，而各種物質(zhì)形成氫鍵的能力不同，決定了吸附力的差異，吸附力強展層速度快，反之展層速度慢，同時展層劑與被分離物質(zhì)在聚酰胺粒子表面競爭形成氫鍵，其與被分離物質(zhì)之間的分配系數(shù)的不同，也影響了不同物質(zhì)的展層速度。聚酰胺薄膜的作用就是通過不同物質(zhì)和展層劑，與聚酰胺薄膜上的酰胺基團競爭形成氫鍵的能力不同，從而實現(xiàn)不同種物質(zhì)的分離。6、Ampholine的作用：其化學本質(zhì)是多氨基多羧基脂肪族化合物，分子量在300~1000之間。以聚丙烯酰胺為支持物，在直流電場作用下，能從正極到負極形成一個pH逐漸升高的平滑連續(xù)而且穩(wěn)定的pH梯度，當?shù)鞍踪|(zhì)在電場力的作用下，便會在支持物中運動到相當于自身pI的pH區(qū)域中聚合成一條狹窄的區(qū)帶而停留下來，從而實現(xiàn)等電點不同的物質(zhì)的分離。7、DNA純化中EDTA（乙二胺四乙酸）的作用：絡(luò)合二價金屬離子，當Mg2+被絡(luò)合后，細胞內(nèi)釋放出來的DNA酶被抑制，避免DNA的降解，同時金屬離子絡(luò)合后，細胞膜穩(wěn)定性下降，有利于膜的裂解。SDS的作用：使蛋白質(zhì)變性，能破壞膜蛋白的構(gòu)象，使膜裂解，又能使核蛋白中的核酸與蛋白質(zhì)解離，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。8、免疫電泳：將電泳與雙向瓊脂擴散相結(jié)合的一種抗原分析方法。首先根據(jù)抗原中各種蛋白質(zhì)組分的電荷和分子量大小的不同，在電場作用下有不同的遷移率，從而可將抗原混合物中的各種不同組分分開，然后使其與特異性抗體進行雙向擴散，發(fā)生免疫學沉淀反應(yīng)。細生實驗整理by徐冰聰說明：黑體字是實驗報告上的填空和法八考試涉及到的地方電泳：一、血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳血清蛋白pI<7.5，在巴比妥緩沖液pH8.6中，以負離子形式存在分出區(qū)帶根據(jù)：蛋白質(zhì)的pI（決定了帶電正負、帶電量）、分子量分出5條帶（正極到負極）：A、α1、α2、β、γ氨基黑10B染色膜條點樣端近負極，點樣線不碰鹽橋pI與分子量都相近的蛋白質(zhì)會在一個區(qū)帶中電滲（電場中液相相對固定相的移動）：用不帶電的有色染料或有色葡萄糖點在膜中心，電泳后該點移動表示有電滲，反之則無電場太高：太熱，使蛋白質(zhì)變性，還會使水分蒸發(fā)使支持物離子濃度增加，甚至引起虹吸二、聚丙烯酰胺凝膠等電聚膠電泳分離蛋白質(zhì)等電聚焦：在pH梯度中，按蛋白質(zhì)pI大小，在pH等于其pI的位置進行聚焦的行為連續(xù)的pH梯度來自：直流電場下作用的兩性電解質(zhì)載體Ampholine配膠：水，Acr,Bis，40%Ampholine，樣品，10%過硫酸銨，20%TEMED電極緩沖液：上槽陰極0.01mol/LH3PO4，下槽陽極0.02mol/LNaOH判斷電泳結(jié)束：電流大小接近零（電荷基本不再移動）普通凝膠電泳和等電聚膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳與聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳）：利用分子量分離；利用pI分離兩個pH；連續(xù)pH梯度單磷酸化和雙磷酸化的同一蛋白質(zhì)成一條帶；兩條帶（因為它們有兩個pI而分子量近似）層析：一、凝膠柱層析交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50的過濾作用，分離分子量48000的尿酶和5700的胰島素Folim-Denis反應(yīng)檢查流出液中的蛋白質(zhì)Folim-Denis反應(yīng)：酪氨酸、色氨酸與試劑生成蘭色鉬蘭Mo3O6，深淺與蛋白質(zhì)含量成正比兩個洗脫峰：第一個是被完全排阻的尿酶，第二個是被部分排阻的胰島素蛋白質(zhì)脫鹽方法：凝膠層析、透析、超濾、冷乙醇沉淀影響分離的因素：流速穩(wěn)定、加樣時不攪動膠面、不干柱、用0.1%EDTA-Na2浸泡再用少許蒸餾水洗來去除重金屬離子二、DNS——氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析固定相：聚酰胺，樣品與其酰胺基團形成氫鍵，決定了吸附力，阻礙氨基酸流過流動相（展層溶劑，使樣品在聚酰胺薄膜表面之間分配系數(shù)差異最大）：苯-冰醋酸和甲酸-水，聚酰胺表面競爭形成氫鍵，推動氨基酸流過固定相DNS-氨基酸制備：氨基酸中加DNS-Cl丙酮溶液，40度30分鐘，熱風吹去丙酮，酸化至pH2-3，溶于乙酸乙酯。兩個相垂直的方向?qū)游鰞纱危缺?冰醋酸后甲酸-水展層劑達到膜上緣2mm處時終止層析Rf值：在流動相中溶解度越大、固定相吸附力越小，Rf越大蛋白質(zhì)定量測定方法雙縮脲反應(yīng)：雙縮脲在堿液中與二價銅離子生成紫紅色絡(luò)合物含兩個及以上肽鍵的化合物都有雙縮脲反應(yīng)，顏色深淺與濃度成正比標準曲線法：利用不同濃度標準液的吸光度，描點、連線，標出樣品點，讀出樣品濃度標準管法：樣品濃度=樣品吸光度x標準管濃度/標準管吸光度凱氏定氮法：雙縮脲法：優(yōu)點：快，不同蛋白顏色深淺相近，干擾物較少缺點：靈敏度差Folin-酚試劑法：優(yōu)點：提高雙縮脲法靈敏度缺點：試劑配制困難，費時，標準曲線不是嚴格的直線，專一性差，干擾物多紫外吸收法（280nm）：優(yōu)點：簡便，靈敏，快速，不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾缺點：準確度差，干擾物多（嘌呤、嘧啶、核酸）考馬斯亮藍法：優(yōu)點：靈敏度高，快速簡便，干擾物少缺點：受精氨酸和芳香族氨基酸含量的影響，有少量干擾物（TritonX-100細胞骨架的觀察中用到、SDS），標準曲線輕微非線性BCA比色法：優(yōu)點：單一試劑，終產(chǎn)物穩(wěn)定，干擾物少PCR一、聚合酶鏈反應(yīng)用DNA聚合酶、雙鏈DNA模板、4種dNTP、人工DNA引物，模仿體內(nèi)復制過程三十個循環(huán)，每個循環(huán)三個過程：模板高溫（95度）下變性成單鏈DNA；降溫（58度）退火、引物互補結(jié)合上模板；聚合酶最適溫度（72度）下引物延伸反應(yīng)系各成分作用：引物：正向、反向引物決定所要擴增的區(qū)域，為聚合酶提供3’-OH；模板：DNA復制的模板；4種dNTP：作為合成原料的核苷酸；Taq酶：催化反應(yīng)；鎂離子：保證酶活性；緩沖液：提供合適的環(huán)境和pH引物設(shè)計：決定所要擴增的區(qū)域，為聚合酶提供3’-OH退火溫度：Tm=2x(A+T)+4x(C+G)，退火溫度一般比Tm小5度防污染：保持實驗室秩序、手套口罩帽子、小包裝試劑一次性實驗用品、短暫離心試劑，減少手套或移液的污染二、逆轉(zhuǎn)錄PCRRNA抽提酸性異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法（AGPC）異硫氰酸胍是最強的蛋白質(zhì)變性劑，裂解釋放RNA、同時失活RNA酶。酸性環(huán)境對其活性有利苯酚、氯仿是強的蛋白變性劑酸性環(huán)境下，RNA進入上層水相，蛋白質(zhì)進入下層有機相，DNA進入上下兩層界面處的中間層異丙醇使各相迅速分離防止RNA被酶降解：玻璃器皿高溫烘烤，塑料器皿DEPC浸泡烘干；手套口罩；除Trizol所有試劑用DEPC處理；可用RNA酶抑制劑鑒定提取的RNA的純度、完整性：測定樣品在260、280的吸光度；電泳顯示RNA是否被降解細胞有絲分裂及細胞骨架觀察一、有絲分裂間期：明顯的細胞核，可見核仁前期：核膨大，染色體開始形成，核膜、核仁逐漸消失中期：每條染色體的染色單體逐漸分開，著絲粒未分開，赤道板形成，紡錘體形成，染色體形態(tài)最典型后期：著絲?？v裂，染色單體完全分開，由紡錘絲牽引向細胞兩級移動，形成數(shù)目相等的兩族染色體末期：染色體解旋為染色質(zhì)，細胞板出現(xiàn)。核膜、核仁出現(xiàn)。細胞板達到細胞兩邊，形成兩個子細胞取距離洋蔥根尖端三分之一的分生區(qū)細胞，分裂最旺盛二、細胞骨架細胞骨架由蛋白質(zhì)絲組成的復雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分微管、微絲、中間絲TritonX-100能溶解細胞中的蛋白質(zhì)、全部脂質(zhì)，而留下細胞骨架的蛋白質(zhì)考馬斯亮藍R250染色殺老鼠——動物染色體制備染色體只有在分裂期的細胞，尤其是中期細胞中表現(xiàn)出典型形態(tài)骨髓細胞數(shù)量多，分裂旺盛，不需體外培養(yǎng)、不需無菌操作，便于取材秋水仙素能阻斷紡錘體的裝配，是有絲分裂停止于中期掐死老鼠(～￣▽￣)～（頸椎脫臼法）免疫一、免疫電泳和對流免疫電泳免疫電泳：將電泳與雙向瓊脂擴散相結(jié)合的一種抗原分析方法根據(jù)蛋白質(zhì)電荷和分子量的不同，在電場作用下有不同的遷移率，從而將各組分分開，然后使其與特異性抗體進行雙向擴散，發(fā)生免疫學沉淀反應(yīng)對流免疫電泳：電泳技術(shù)與雙向瓊脂擴散技術(shù)相結(jié)合的一種定向加速的凝膠內(nèi)免疫沉淀反應(yīng)在凝膠中加一直流電場，抗原抗體收到電滲和電泳兩種力量的綜合作用而向某一方向定向加速移動，提高靈敏度、