第二章 基因工程原理及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

第二章基因工程原理及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

第一節(jié)基因工程基礎(chǔ)

（一）基因工程的定義1.基因（gene）DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)最小功能單位。2.基因組（geneome）一個生物體的全部基因序列。一、基因工程的定義、基本操作程序3.基因表達(dá)（geneexpression）遺傳信息轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。（1）轉(zhuǎn)錄。在DNA分子上合成出與其核苷酸順序相對應(yīng)的RNA的過程。（2）翻譯。在RNA的控制下，根據(jù)核苷酸鏈上每三個核苷酸決定一個氨基酸的三聯(lián)體密碼規(guī)則，合成出具有特定氨基酸順序的蛋白質(zhì)肽鏈過程。（3）逆轉(zhuǎn)錄。以RNA為模板，按照RNA中的核苷酸順序合成DNA的過程。4.重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnique）

利用限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶等酶類將不同的DNA進(jìn)行體外切割、連接構(gòu)成新的DNA分子的技術(shù)。5.基因工程（geneengineering）運用限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶等酶類將不同DNA進(jìn)行體外切割、連接構(gòu)成重組DNA，再將重組DNA經(jīng)生物介導(dǎo)或直接導(dǎo)入等轉(zhuǎn)移方法引入受體細(xì)胞進(jìn)行克隆、表達(dá)，從而改變生物遺傳性以創(chuàng)造生物新種質(zhì)，或通過大量擴增為人類提供有用產(chǎn)品等的技術(shù)。6.食品基因工程利用基因工程的技術(shù)和手段，在分子水平上定向重組遺傳物質(zhì)，以改良食品的品質(zhì)和性狀，提高食品的營養(yǎng)價值、貯藏價格性狀以及感官性狀的技術(shù)。（二）基因工程的基本操作程序1.運用合適的方法從生物體中分離或通過化學(xué)合成制備目的基因。2.采用合適的方法將目的基因與合適的載體進(jìn)行體外連接，構(gòu)建重組DNA。3.利用合適的方法將重組DNA導(dǎo)入受體生物細(xì)胞以獲得轉(zhuǎn)化體。4.采用合適的方法篩選出重組轉(zhuǎn)化體陽性克隆。5.運用合適的方法對重組轉(zhuǎn)化體陽性克隆進(jìn)一步分析以及操作，使目的基因在受體生物細(xì)胞中高效表達(dá)。

（三）基因工程的三大理論和三大技術(shù)基礎(chǔ)1.三大理論基礎(chǔ)（1）1940年代Avery等人的肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA。（2）1950年代Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)及DNA半保留復(fù)制機理。（3）1960年代Crick關(guān)于遺傳中心法則的確立，即生物體中遺傳信息是按DNA→RNA→蛋白質(zhì)方向進(jìn)行傳遞。2.三大技術(shù)基礎(chǔ)（1）如何從生物體龐大的雙鏈DNA分子中將所需要的基因片段切割下來（限制性內(nèi)切核酸酶）。（2）如何將獲得的基因片段進(jìn)行連接（DNA連接酶）。（3）如何將切割下來的基因片段進(jìn)行繁殖擴增（基因載體）。二、基因工程的工具酶

工具酶：基因工程的操作，是依賴于一些重要的酶（例如，限制酶、聚合酶、連接酶等）作為工具來對基因進(jìn)行切割和拼接等操作，這些酶被稱為工具酶。

（一）限制性內(nèi)切核酸酶與DNA甲基化酶

1.限制作用與修飾作用限制作用（restriction）：指一定類型的細(xì)菌可以通過其限制性內(nèi)切核酸酶的作用，切割降解入侵的外源DNA，使得外源DNA的入侵受到限制的現(xiàn)象。修飾作用（modification）：指在DNA甲基化酶作用下，生物體自身DNA分子在特定堿基的特定位置上發(fā)生甲基化而得到修飾，從而免遭自身限制性內(nèi)切核酸酶降解的現(xiàn)象。2.限制性內(nèi)切核酸酶與DNA甲基化酶限制性內(nèi)切核酸酶（restrictionendonuclease）：簡稱限制酶，指一類能夠識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)核苷酸序列的內(nèi)切核酸酶。DNA甲基化酶（DNAmethylase）：簡稱甲基化酶，指一類能夠識別DNA特定序列，并在其特定堿基的特定位置上引入甲基而發(fā)生修飾作用的酶。3.限制性內(nèi)切核酸酶的類型（1）Ⅰ型。由三種不同亞基組成；輔助因子為ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸；切割位點距其識別位點至少1000bp；切割作用隨機。Ⅰ型限制酶不宜作為基因工程的工具酶。（2）Ⅱ型。由兩個相同亞基組成；輔助因子僅為Mg2+；識別位點常具旋轉(zhuǎn)對稱性；切割位點與其識別位點重疊或在其附近；切割作用特異性強。Ⅱ型限制酶是基因工程理想的工具酶。（3）Ⅲ型。由兩種不同亞基組成；輔助因子為ATP和Mg2+，也受S-腺苷甲硫氨酸激活，但并非必需；切割位點一般在距其識別位點3’端24～26bp處。Ⅲ型限制酶在基因工程中也不常用。

限制性內(nèi)切核酸酶沒有種屬特異性，即限制性內(nèi)切核酸酶識別、切割特定序列的能力同底物DNA的來源無關(guān)，它可識別、切割各種來源的DNA。

DNA甲基化酶具有種屬特異性，生物體的DNA甲基化酶只修飾保護(hù)自己的DNA，而不修飾保護(hù)非己的DNA。生物體的限制性內(nèi)切核酸酶不能降解自身被修飾保護(hù)的DNA，而只能降解外源的DNA。

表4-1限制性內(nèi)切核酸酶的類型及主要特性

主要特性Ⅰ型

Ⅱ型

Ⅲ型

酶蛋白構(gòu)成三種不同亞基兩個相同亞基兩種不同亞基酶活輔助因子ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+識別序列特性EcoBⅠ:TGAN8TGCTEcoKⅠ:AACN6GTGC旋轉(zhuǎn)對稱EcoPⅠ:AGACCEcoP15Ⅰ:CAGCAG切割位點距其特異識別位點至少1000bp處隨機切割在特異切割位點上或其附近特異切割距其識別位點3’端24～26bp處特異切割4.Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶的切割方式在識別序列雙鏈DNA兩條鏈的對稱軸上同時切斷磷酸二酯鍵，形成雙鏈平齊末端。在識別序列雙鏈DNA兩條鏈的對稱軸兩側(cè)同時從3’端切斷磷酸二酯鍵，形成3’-羥基端2～5個核苷酸突出單鏈黏性末端。在識別序列雙鏈DNA兩條鏈的對稱軸兩側(cè)同時從5’端切斷磷酸二酯鍵，形成5’-磷酸端2～5個核苷酸突出單鏈黏性末端。5.影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的主要因素

（1）底物DNA制備物的純度蛋白質(zhì)、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、酚、氯仿、乙醇及高濃度的鹽離子等污染物都會抑制限制酶的活性。（2）底物DNA的甲基化程度dam甲基化酶：特異地催化DNA分子中5’GATC3’序列中的腺嘌呤N7位置的甲基化。dcm甲基化酶：催化DNA分子中5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位置的甲基化。

（3）底物DNA的結(jié)構(gòu)構(gòu)型環(huán)狀雙螺旋DNA較線性DNA穩(wěn)定。在用限制酶酶解同樣分子質(zhì)量的DNA時，環(huán)狀雙螺旋DNA所需酶量為線性DNA所需酶量的10～20倍。（4）酶反應(yīng)緩沖液的組成酶反應(yīng)體系中常含MgCl2、NaCl或KCl、三羥甲基氨基甲烷（Tris）-HCl、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA）等。Tris-HCl的作用在于使反應(yīng)液的pH值穩(wěn)定于酶活性所要求的最佳范圍內(nèi)，而后三者均有穩(wěn)定酶的作用。

（5）酶反應(yīng)的最適溫度

大多數(shù)限制酶反應(yīng)的最適溫度為37℃，少數(shù)限制酶反應(yīng)的最適溫度高于或低于此溫度。反應(yīng)溫度高于或低于其最適溫度，酶的活力均會下降。應(yīng)根據(jù)各限制酶反應(yīng)的最適溫度作相應(yīng)調(diào)整。

6.限制酶的主要用途（1）在特異位點上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制酶切割的DNA片段。（2）建立DNA分子的限制酶圖譜。

限制酶圖譜（restrictionmap）:指一系列限制酶的特異識別序列在DNA鏈上的出現(xiàn)頻率和它們之間的相對位置。

（3）構(gòu)建基因文庫?；蚬こ讨校瑢⒛撤N生物的全部基因組的遺傳信息，貯存在可以長期保存的穩(wěn)定的重組體中，以備需要時能夠隨時應(yīng)用它分離所需要的目的基因，這種保存基因組遺傳信息的材料，稱為基因文庫（genelibrary）（4）用限制酶切出相同的黏性末端，以便重組DNA。（二）DNA聚合酶

依賴于DNA的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）；大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）、耐熱的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）等。依賴于RNA的DNA聚合酶（即逆轉(zhuǎn)錄酶）優(yōu)先以RNA為模板，也可以DNA為模板。逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板催化合成雙鏈DNA。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（簡稱末端轉(zhuǎn)移酶）不以DNA或RNA為模板，而只是將核苷酸加到已有DNA分子的末端。

DNA聚合酶作用的條件（1）要有底物4種脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）為前體催化合成DNA，接受模板指導(dǎo)，產(chǎn)物的性質(zhì)與模板編碼相同。（2）不能起始合成新的DNA鏈，要有引物3’-羥基的存在。（3）催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3’-羥基末端。（4）催化DNA合成的方向是5’→3’。

1.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）一種從大腸桿菌中分離出的一條分子質(zhì)量為109KDa的多肽鏈（球蛋白）。具有三種活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以單鏈DNA為模板，以帶3’自由羥基的DNA片段為引物；②5’→3’外切核酸酶活性，從5’端既降解雙鏈DNA，也降解RNA-DNA雜交體中的RNA鏈（RNA酶H活性）；③3’→5’外切核酸酶活性，底物為帶3’自由羥基的雙鏈DNA或單鏈DNA。

主要用于：①以切刻平移法標(biāo)記DNA；②對DNA分子的3’突出尾進(jìn)行末端標(biāo)記。

2.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）一條分子質(zhì)量為76KDa的多肽鏈，一般由大腸桿菌DNA聚合酶I全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶水解獲得，也可通過克隆技術(shù)獲得。具有兩種活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以單鏈DNA為模板，以帶3’自由羥基的DNA片段為引物。②3’→5’外切核酸酶活性，底物為帶3’自由羥基的雙鏈DNA或單鏈DNA。3.TaqDNA聚合酶最初來源于水生棲熱菌（Thermusaquaticus），現(xiàn)可由基因工程途徑來生產(chǎn)。分子質(zhì)量為65KDa，是一種非常耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶。

具有一種活性：5’→3’DNA聚合酶活性，以單鏈DNA為模板，以帶3’自由羥基的DNA片段為引物。主要用于：①對DNA進(jìn)行測序。②通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）對DNA分子的特定序列進(jìn)行體外擴增。

4.逆轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶）常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：一種來自禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV），由兩條多肽鏈組成，分子質(zhì)量為170KDa。一種來自鼠白血病病毒（MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌，由單鏈多肽組成，分子質(zhì)量為84KDa。具有兩種活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以RNA或者DNA為模板，以帶3’自由羥基的RNA或DNA片段為引物。②RNA酶H活性，即5’→3’外切核糖核酸酶活性，特異地降解RNA-DNA雜交體中的RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶無3’→5’外切核酸酶活性，即無校對功能，其催化的聚合反應(yīng)容易出錯。5.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（末端轉(zhuǎn)移酶）來源于小牛胸腺，分子質(zhì)量為60KDa，是一種不需要模板的特殊的DNA聚合酶。具有一種活性：即末端轉(zhuǎn)移酶活性，在二價陽離子存在下，其催化dNTP加于DNA分子的3’-羥基端。

主要用于：①給載體DNA或cDNA加上互補的同聚尾。②以32P標(biāo)記的一種dNTP或一種rNTP來標(biāo)記DNA片段的3’端。

（三）連接酶、磷酸酶1.T4噬菌體DNA連接酶來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌，分子質(zhì)量為68KDa。具有一種活性：即催化DNA的5’磷酸基與3’羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶的核酸底物為黏性末端DNA、平齊末端DNA等。主要用于：①連接帶匹配黏性末端的DNA分子。②使平齊末端的雙鏈DNA分子互相連接或與合成接頭相連接。

2.堿性磷酸酶來源于大腸桿菌及牛小腸。包括細(xì)菌堿性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase，BAP）和牛小腸堿性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase，CIP）。具磷酸酶活性，催化去除5’磷酸的反應(yīng)。底物為單鏈或雙鏈DNA及RNA、dNTP。主要用于：①在用32P標(biāo)記5’末端前，去除DNA或RNA分子的5’磷酸。②去除DNA片段5’磷酸，以防自身環(huán)化。

三、基因工程的載體

載體（vector）：攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運載工具。基因工程載體的特性:（1）能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨立和穩(wěn)定的DNA自我復(fù)制。在插入外源基因后，仍然保持著穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)和遺傳特性。（2）易于從宿主細(xì)胞中分離，并進(jìn)行純化。（3）DNA序列中有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點，最好是單一酶切位點，并位于DNA復(fù)制的非必需區(qū)內(nèi)，可以在這些位點上插入外源DNA，但不影響載體自身DNA的復(fù)制。（4）具有能夠觀察到的表型特征，在插入外源DNA后，這些特征可以作為重組DNA選擇的標(biāo)志。

載體的報告基因（標(biāo)記基因）：基因工程中利用載體上引入的一些具有特殊標(biāo)志意義的基因，可用來證明載體已經(jīng)進(jìn)入宿主細(xì)胞，并可用來將含有目的基因的宿主細(xì)胞從其他細(xì)胞中識別區(qū)分甚至挑選出來，這種具有標(biāo)志意義的基因稱為報告基因（reportergene）或標(biāo)記基因。最常用的報告基因有抗藥性基因（例如，抗氨芐青霉素、抗四環(huán)素、抗氯霉素等抗生素抗性基因），此外，還有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT基因）、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、β-球蛋白基因和人生長激素基因等。

按照介導(dǎo)的作用目的，可將基因工程載體主要分為克隆載體和表達(dá)載體。

克隆載體：有一個松弛性復(fù)制系統(tǒng)，能使外源DNA在受體生物細(xì)胞中擴增復(fù)制。（例如，細(xì)菌質(zhì)粒載體、λ噬菌體載體、柯氏質(zhì)粒載體）

表達(dá)載體：有一個受體生物細(xì)胞所要求的包括啟動子序列在內(nèi)的調(diào)控系統(tǒng)，能使外源基因在受體生物細(xì)胞中進(jìn)行功能表達(dá)。（例如，Ti質(zhì)粒、SV40猴狀病毒）按照導(dǎo)入的受體生物，一般可將基因工程載體分為大腸桿菌（原核細(xì)胞）載體、酵母載體、植物載體、動物載體等。（一）大腸桿菌載體

1.質(zhì)粒載體質(zhì)粒:指細(xì)菌等生物細(xì)胞內(nèi)一類獨立于染色體外而能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì)。質(zhì)?？截悢?shù)（plasmidcopynumber）：一種質(zhì)粒在一個細(xì)胞中存在的數(shù)目。

（1）質(zhì)粒的生物學(xué)特性一般為雙鏈的共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），質(zhì)粒分子的長度一般為1～200kb。不同質(zhì)粒的分子質(zhì)量差異顯著，小質(zhì)粒的分子質(zhì)量約為103KDa，僅能編碼2～3種中等大小的蛋白質(zhì)；而大質(zhì)粒的分子質(zhì)量可達(dá)105KDa。

（2）質(zhì)粒的分類根據(jù)復(fù)制控制類型：一般可將大腸桿菌質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制控制質(zhì)粒和松弛型復(fù)制控制質(zhì)粒。嚴(yán)緊型復(fù)制控制質(zhì)粒:復(fù)制與宿主染色體的復(fù)制同步，并與宿主蛋白質(zhì)的合成有關(guān)，而與DNA聚合酶Ⅰ的活性無關(guān)。如果宿主蛋白質(zhì)的合成終止，質(zhì)粒與宿主染色體的復(fù)制也停止。每個宿主細(xì)胞中只能達(dá)到1至數(shù)個拷貝。松弛型復(fù)制控制質(zhì)粒:復(fù)制與宿主染色體的復(fù)制不同步，其與DNA聚合酶Ⅰ的活性有關(guān)，而與蛋白質(zhì)的合成無關(guān)。當(dāng)宿主蛋白質(zhì)的合成終止時，質(zhì)粒仍可復(fù)制。每個宿主細(xì)胞中的質(zhì)?？截悢?shù)可達(dá)10～200個。（3）質(zhì)?？寺≥d體的條件①分子結(jié)構(gòu)中具有多個單一限制酶切位點，具有易被檢測的選擇標(biāo)記基因，且切點位于選擇標(biāo)記基因上。②能插入、運載一定大小的外源基因。③在攜帶外源基因前后在宿主細(xì)胞內(nèi)均能自主復(fù)制。④在與外源基因構(gòu)建重組質(zhì)粒后具有轉(zhuǎn)化功能。⑤分子質(zhì)量小，易于操作，一般為松弛型復(fù)制控制。⑥容易控制，安全可靠?，F(xiàn)已通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建了許多質(zhì)?？寺≥d體供基因工程應(yīng)用，例如，pBR322、pUC系列等。

（4）質(zhì)粒pBR322

組成①氨芐青霉素抗性基因（ampr）②四環(huán)素抗性基因（tetr）③DNA復(fù)制起始點（ori）

優(yōu)點①分子質(zhì)量小。②具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。③較高的拷貝數(shù)。

（5）pUC質(zhì)粒載體組成①來自pBR322的復(fù)制起始點（ori）②大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱為lacZ’基因。③氨芐青霉素抗性基因（ampr），但其核苷酸序列有變化，不含原來內(nèi)切限制酶的單位識別位點。④位于lacZ’基因中的靠近5’端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)，但它并不破壞該基因的功能。

優(yōu)點①更小的分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)。②適用于組織化學(xué)方法檢測重組體。③有多克隆區(qū)位點。2.噬菌體載體（1）噬菌體的生物學(xué)特性不同種類的噬菌體（顆粒）在外形上差別很大。大多數(shù)噬菌體顆粒由呈20面體的頭部及尾部構(gòu)成，例如，λ噬菌體；還有一些噬菌體顆粒為線狀體形，例如，M13。在結(jié)構(gòu)上，噬菌體顆粒比質(zhì)粒復(fù)雜。噬菌體顆粒的外殼是蛋白質(zhì)，內(nèi)部是核酸。該核酸最常見的構(gòu)型是線狀雙鏈DNA，此外，還有環(huán)狀雙鏈DNA、線狀單鏈DNA、環(huán)狀單鏈DNA等。（2）λ噬菌體載體λ噬菌體顆粒由頭與尾兩部分組成。頭部裝載了其整個基因組λDNA。λDNA為一長度約48.5kb的線狀雙鏈DNA分子，可以分為三個區(qū)段：左臂、中央?yún)^(qū)和右臂。在左臂和右臂的5’處各有12個堿基長的互補單鏈（從而構(gòu)成黏性末端）。當(dāng)λ噬菌體感染宿主細(xì)胞時，λDNA被注入宿主細(xì)胞后會迅速通過黏性末端的互補作用形成環(huán)狀雙鏈DNA分子。λ噬菌體載體的優(yōu)點：①可攜帶較長的外源DNA片段。②重組后的DNA分子可在體外被包裝成噬菌體顆粒。③重組的噬菌體容易篩選和貯存。λ噬菌體的必要基因：λDNA至少包括61個基因。其中大約半數(shù)基因參與噬菌體生命周期活動，位于其左臂和右臂，這類基因稱作λ噬菌體的必要基因。λ噬菌體的非必要基因：另一部分基因在被外源基因取代后并不影響噬菌體的生命周期活動，位于其中央?yún)^(qū)，這類基因稱作λ噬菌體的非必要基因。cos位點（cohesive-endsite）：由黏性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段。

λ噬菌體載體的分類：根據(jù)插入方式，一般可將λ噬菌體載體分為插入型載體和置換型載體。插入型載體（insertionvector）：指在基因組的非必要基因區(qū)內(nèi)有一種或不止一種限制酶的單一酶切位點可供外源DNA插入，而不缺失其本身任何片段的λ噬菌體載體。由插入型載體得到的重組DNA分子都比原載體長。插入型載體可容納的外源DNA片段相對較小，一般在10kb以內(nèi)。廣泛應(yīng)用于cDNA以及小片段DNA的克隆。

置換型（取代型）載體（replacementvector）：指在基因組的非必要基因區(qū)內(nèi)兩個或兩個以上的限制酶切位點間的DNA區(qū)段可被插入的外源DNA片段所置換的λ噬菌體載體。置換型載體容納外源DNA片段大小的范圍一般在9～22kb之間。

有些λ噬菌體載體兼有插入和置換兩種外源DNA片段的插入方式，這具體取決于載體與外源DNA末端匹配的限制酶切位點的種類和數(shù)目等。3.柯斯質(zhì)粒載體（Cosmidvector）也稱黏粒載體，指一類由人工構(gòu)建的含有抗性基因、單一克隆位點、λDNA的cos位點和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。分子質(zhì)量較小，一般為4～6kb。（1）柯斯質(zhì)粒載體的組成①1個質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)域復(fù)制子（基因組中能獨立進(jìn)行復(fù)制的單位）；②至少1個抗藥性選擇標(biāo)記基因；③至少1個限制酶的單一識別切割位點；④1個λ噬菌體黏性末端片段cos位點。（2）柯斯質(zhì)粒載體的特點①具有質(zhì)粒載體的特性：它帶有質(zhì)粒的復(fù)制子，能像質(zhì)粒DNA一樣在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，也能在氯霉素的作用下進(jìn)行擴增。帶有抗生素抗性基因，有些還帶有基因插入失活的克隆位點，為重組體的篩選提供了簡便的標(biāo)記。②具有λ噬菌體載體的特性：它在與適宜長度的外源DNA片段重組后，可在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效地轉(zhuǎn)入對λ噬菌體敏感的大腸桿菌宿主細(xì)胞。進(jìn)入宿主細(xì)胞后，也能像λ噬菌體一樣進(jìn)行環(huán)化。③具有高容量的克隆能力：質(zhì)粒載體的克隆容量一般為10kb，λ噬菌體載體的克隆容量理論極限值是23kb，一般為15kb左右，而柯斯質(zhì)粒載體的克隆極限可達(dá)45kb左右。（一）基本原理在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，利用DNA聚合酶催化合成反應(yīng)，體外擴增特異DNA片段。在進(jìn)行PCR擴增時，通常需要設(shè)計合成一對與目的DNA片段兩側(cè)翼序列分別互補的寡核苷酸引物。其中一引物與目的區(qū)段上游一條模板鏈的序列相互補，而另一引物與目的區(qū)段下游另一條模板鏈的序列相互補。四、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)將熱變性后分開的兩條模板鏈與摩爾數(shù)大大過量的兩個引物共同溫育復(fù)性產(chǎn)生的模板－引物雜交體作為作用底物，利用耐熱的TaqDNA聚合酶催化延伸合成反應(yīng)。在第一輪擴增完畢后，將反應(yīng)混合物再加熱使新構(gòu)成的雙鏈DNA變性，然后再度溫育使模板鏈與引物復(fù)性，進(jìn)入第二輪特異性合成。由于耐熱的TaqDNA聚合酶在熱變性步驟中不失活，可直接進(jìn)入第二輪特異性合成而不需要另外補加DNA聚合酶等。PCR的每個循環(huán)包括3步（1）變性（denaturation）。通過加熱至一定溫度使雙鏈DNA兩鏈間的氫鍵斷裂，DNA雙鏈離解形成兩條DNA單鏈。（2）復(fù)性（退火，annealling）。當(dāng)反應(yīng)體系溫度突然降低時，由于模板DNA分子的結(jié)構(gòu)比引物DNA分子復(fù)雜得多，而且在反應(yīng)體系中引物的量大大多于模板，因此引物和與其互補的模板配對形成局部雜交雙鏈，而變性后離解形成的兩條模板DNA單鏈之間互補配對的機會則較少。（3）延伸（extension）。在4種脫氧核糖核苷三磷酸底物、Mg2+等存在的條件下，TaqDNA聚合酶以模板－引物雜交體分別為模板和引物催化DNA鏈沿5’→3’方向合成延伸。每個循環(huán)的擴增產(chǎn)物作為下一循環(huán)的模板。

2.PCR的操作體系和反應(yīng)條件（1）模板。待測的核苷酸（DNA或RNA）分子；雙鏈DNA可直接用于反應(yīng)，而RNA則需要用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，然后用作聚合酶反應(yīng)的模板。（2）DNA聚合酶。最初采用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow