植物源農(nóng)藥的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定修改版

植物源農(nóng)藥的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定張龍來Email：798223330@2014.10.20

一、基本概念1、提?。豪眠m當(dāng)?shù)娜軇┗蚍椒?，將所要成分盡可能從原料中完全提出的過程。2、分離：將提取物中所含的各種成分一一分開，并將得到的單體加以精制的過程。第一節(jié)植物源農(nóng)藥的提取

水親水性有機(jī)溶劑親脂性有機(jī)溶劑二、提取方法超臨界流體萃取法（SFE）水蒸氣蒸餾法溶劑提取法升華法壓榨法溶劑（一）溶劑提取法根據(jù)天然成分的溶解性不同，選用對所需成分溶解度大而對其他成分溶解度小的溶劑，將所需成分從生物材料中溶解出來的一種提取方法。

溶劑提取是指溶劑進(jìn)入生物體細(xì)胞，溶解或分散其有用物質(zhì)而變成浸出物的全過程。包括浸潤、解吸和擴(kuò)散三個階段。1、溶劑提取法的原理選擇溶劑依據(jù)相似相溶原理。

浸潤：滲透階段溶劑通過細(xì)胞壁滲透到細(xì)胞中。解吸：溶解階段細(xì)胞內(nèi)容物與細(xì)胞組織之間有親和力，溶劑破除這種親和力。擴(kuò)散：置換階段利用細(xì)胞內(nèi)的滲透力產(chǎn)生的壓差而抽提出來，用溶劑占領(lǐng)內(nèi)容物的位置而將內(nèi)容物置換出來。

擴(kuò)散過程表達(dá)式：dt:擴(kuò)散時間F：擴(kuò)散面積，以粉碎度表示濃度差D：擴(kuò)散系數(shù)ds:在dt時間內(nèi)的擴(kuò)散量2、選擇溶劑的要點(diǎn)*對所要成分溶解度大*沸點(diǎn)適中容易回收*低毒安全*廉價天然產(chǎn)物成分中，萜、甾等大環(huán)、稠環(huán)化合物極性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等極性溶劑中；酸堿性成分因存在狀態(tài)不同溶解性不同。最常用的溶劑為乙醇。3、溶劑的分類*強(qiáng)極性溶劑：水*親水性有機(jī)溶劑：能與水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）*親脂性有機(jī)溶劑：不與水任意混溶，可分層（正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、環(huán)己烷、石油醚）常用溶劑的極性大小順序：石油醚<四氯化碳<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇（甲醇）<水4、化合物的結(jié)構(gòu)與親水性、親脂性的關(guān)系（1）分子結(jié)構(gòu)中親水性基團(tuán)（羧基、羥基、氨基）越多，極性越大，親水性越強(qiáng)，反之則親脂性越強(qiáng)。（2）分子中非極性部分越大，碳鏈越長或結(jié)構(gòu)越大，則親脂性越強(qiáng)。（3）結(jié)構(gòu)母核相同的成分，分子中功能基的極性越大，或極性功能基數(shù)量越多，則整個分子的極性越大，親水性越強(qiáng)，親脂性越弱。5、溶劑的選擇

(1)水：為價廉、易得、使用安全的強(qiáng)極性溶劑。適于提取無機(jī)鹽、糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸鹽、生物堿鹽、苷類等。(2)親水性有機(jī)溶劑：以乙醇最常用。高濃度提取親脂性成分，低濃度提取親水性成分。(3)

親脂性有機(jī)溶劑：具有較強(qiáng)的選擇性，對揮發(fā)油、油脂、葉綠素、樹脂、內(nèi)酯、某些生物堿及一些苷元均可提取出來。優(yōu)缺點(diǎn)：沸點(diǎn)低，濃縮回收方便，但易燃、有毒、價貴，穿透力差。6、溶劑提取的方法溶劑提取的方法連續(xù)回流提取法煎煮法（煎中藥）滲漉法浸漬法（泡藥酒）

以水或稀醇反復(fù)提取，適于遇熱易破壞或揮發(fā)性成分及含淀粉、粘液質(zhì)較多的材料。（1）浸漬法

民間的藥酒浸制。

（2）滲漉法

以稀乙醇或酸、水作溶劑，先浸后滲，提取效率高于浸漬法。但溶劑用量大，對原料粒度要求高。實(shí)驗(yàn)室簡單滲漉裝置

（3）煎煮法

以水為溶劑，對遇熱易破壞和揮發(fā)性成分有影響，對含多量淀粉、黏液質(zhì)的原料也不適用。

傳統(tǒng)的中藥煎制。

（5）連續(xù)回流提取法

循環(huán)使用揮發(fā)性的有機(jī)溶劑，在脂肪提取器中連續(xù)提取的方法。提取效率高，節(jié)省溶劑。但不適于熱不穩(wěn)定成分的提取。

也可采用混合溶劑，常用的有水和乙醇。不同比例的溶劑可提出不同成分，如CHCl3-C2H5OH(95:5) 可提取出強(qiáng)心甙、有機(jī)酸、葉綠素等。

索式提取器的組成索式提取器連續(xù)回流提取

萃取瓶（圓底燒瓶）冷凝管脂肪提取器濾紙筒虹吸管蒸汽管

7、影響溶劑提取法的因素（1）生物材料的粉碎度

材料細(xì)，面積大，擴(kuò)散快，效果好。但是太細(xì)，吸附作用大，易糊化，擴(kuò)散慢，同時植物細(xì)胞也會遭受破壞，大量蛋白質(zhì)、淀粉被提出，產(chǎn)生沉淀或膠束狀，影響提取?；ā⑷~可適當(dāng)粗些，皮、莖、根宜細(xì)些。

（2）提取溫度

一般使用常溫，在不破壞有效成分的條件下加熱不要超過80?C。

溫度低提取時的雜質(zhì)少，溫度高時提取效率高；但含淀粉、粘液質(zhì)較多的材料，水提時避免熱提。

（3）提取時間

以提完為準(zhǔn)，是否完全可以提取也做定性實(shí)驗(yàn)，或薄層層析檢測，或以液體顏色判斷。

根據(jù)檢測結(jié)果確定是否需要延長提取時間。

（4）濃度差

根據(jù)擴(kuò)散原理，造成提取液的濃度差可以提高提取的效率。

可采取的措施有：攪拌、更換溶劑。

（5）新技術(shù)的使用

超聲波、微波促提技術(shù)的應(yīng)用，可以加快提取速度，提高提取效率。

目前實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的超聲波萃取儀是將超聲波換能器產(chǎn)生的超聲波通過介質(zhì)（通常是水）傳遞并作用于樣品，這是一種間接的作用方式，聲振強(qiáng)度較低，必須通過增加超聲波發(fā)生器功率（3300W）來提高萃取效率。但較大的超聲波功率，又會發(fā)出令人感覺不適的噪音。

超聲波促提原理：

為物理過程，無化學(xué)反應(yīng)，不改變生物活性，高能量的超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)大壓力，可造成植物細(xì)胞壁及生物體破裂，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放、擴(kuò)散、溶解。實(shí)驗(yàn)室用小型超聲儀工業(yè)生產(chǎn)用超聲儀

微波輔助技術(shù)是利用樣品中目標(biāo)物分子在微波電磁場的作用下，從原來的熱運(yùn)動狀態(tài)轉(zhuǎn)為跟隨微波交變電磁場而快速排列取向，將微波能量轉(zhuǎn)化為樣品內(nèi)的能量，從而加速目標(biāo)物從固相進(jìn)入溶劑相的過程。微波促提原理：

具有穿透力強(qiáng)，加熱效率高，操作簡便、快速、節(jié)能、高效等特點(diǎn)。缺點(diǎn)：化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)易發(fā)生變化，繼而導(dǎo)致生物活性的改變。

微波提取尤其要注意能量的控制，被提取物質(zhì)的穩(wěn)定性。工業(yè)生產(chǎn)用微波提取罐

（二）水蒸氣蒸餾法

適于具有揮發(fā)性，能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞的有效成分結(jié)構(gòu)的提取。如揮發(fā)油、小分子生物堿、酚類、游離醌類等。

水蒸氣蒸餾法是將水蒸氣通入不溶或難溶于水但有一定揮發(fā)性的有機(jī)物質(zhì)中，使該有機(jī)物在低于100℃

的溫度下，隨著水蒸氣一起蒸餾出來。原理：道爾頓分壓定律

水蒸氣蒸餾裝置

常用的水蒸氣蒸餾裝置，包括水蒸氣發(fā)生器、蒸餾、冷凝和接受器四個部分。

最常用的是二氧化碳超臨界萃取法，環(huán)保、成本低、提取分離一步完成。分子的極性、沸點(diǎn)和分子量的大小與其在二氧化碳超臨界流體中的溶解性密切相關(guān)。（三）超臨界流體萃取法

超臨界二氧化碳流體(SFE-CO2)臨界點(diǎn)(31.1℃)相當(dāng)接近室溫

利用超臨界條件下流體的特殊性能對樣品進(jìn)行提取，是20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展起來的一種提取方法。

超臨界流體不但具有與液體接近的密度，有很強(qiáng)的穿透性，接近或超過溶劑的提取效率；而且具有與氣體相近的擴(kuò)散的性能，提取效率越高。常用的超臨界流體有CO2、乙烷、丙烷等。

與普通有機(jī)溶劑提取法相比，超臨界CO2萃取技術(shù)具有無毒、常溫、不易燃、無污染等特點(diǎn)，可確保原有的色、香、味不因受熱破壞；更為可貴的是在萃取過程中可同時對萃取物進(jìn)行分離純化。該技術(shù)適宜于萃取高價值的油脂（包括天然功能性油脂）、精油、內(nèi)酯等極性較低的天然產(chǎn)物有效成分。

超臨界CO2提取的特點(diǎn)。

CO2

鋼瓶

冷溫槽

高壓泵恒溫箱

控溫面板

接受瓶

流量計(jì)

CO2

原料

玻璃珠

脫脂棉

萃取柱

超臨界CO2

萃取實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

液體CO2由高壓泵加壓到萃取工藝要求的壓力并傳送到換熱器，將CO2流體加溫到萃取工藝所需溫度后進(jìn)入萃取器，在此完成萃取過程。負(fù)載溶質(zhì)的CO2流體在分離器中改變溫度壓力，溶解度降低使萃取物得以分離。分離萃取物后的CO2流體再經(jīng)換熱器液化后回到儲罐中循環(huán)使用。超臨界CO2提取操作流程

20世紀(jì)50年代初進(jìn)入試驗(yàn)階段，如從石油中脫瀝青。

70、80年代SFE用于食品香料的提取。

90年代從植物藥中提取目標(biāo)成分，如從蛇床子、桑白皮、茵陳蒿中提取活性成分。

（四）升華法

將固體物質(zhì)受熱氣化，遇冷又凝結(jié)為固體的方法。樟木中的樟腦，茶葉中的咖啡因的提取。2-莰酮咖啡因

1、將茶葉與95%乙醇回流2h；2、濾出茶葉，濃縮提取液至適當(dāng)體積；3、濃縮液與生石灰粉混合，攪成漿狀，用蒸發(fā)皿在蒸汽浴上蒸干，除去水份；4、在蒸發(fā)皿上蓋一張刺孔向上的濾紙，再在濾紙上罩一個大小適合且頸部塞有棉花的漏斗；5、用酒精燈隔石棉網(wǎng)加熱，適當(dāng)控制溫度，白色咖啡因在濾紙上結(jié)晶。實(shí)驗(yàn)室提取咖啡因步驟：

升華

借助機(jī)械外力的作用，將油脂從榨料中擠壓出來的過程。在壓榨過程中，主要發(fā)生的是物理變化，如物料變形、油脂分離、摩擦發(fā)熱、水分蒸發(fā)等。但由于溫度、水分、微生物等的影響，同時也會產(chǎn)生某些生物化學(xué)方面的變化，如蛋白質(zhì)變性、酶的鈍化和破壞、某些物質(zhì)的結(jié)合等。壓榨時，榨料粒子在壓力作用下內(nèi)外表面相互擠緊，致使其液體部分和凝膠部分分別產(chǎn)生兩個不同過程，即油脂從榨料空隙中被擠壓出來及榨料粒子變形形成堅(jiān)硬的油餅。（五）壓榨法

第二節(jié)天然產(chǎn)物的分離與精制一、一般分離方法1、萃取法2、沉淀分離法3、結(jié)晶和重結(jié)晶4、膜分離二、柱色譜法1、吸附柱色譜2、分配柱色譜3、離子交換柱色譜4、凝膠柱色譜5、大孔樹脂柱色譜6、親和柱色譜

1)影響分離的因素①分離因子β，分配系數(shù)Kβ=Ka/Kb，Ka>Kb

K=CU/CL

CU、CL為被分離物質(zhì)在上相和下相中濃度

1、萃取法

利用混和物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的方法。

根據(jù)β值的大小可決定分離采用的方法

β>100,簡單的一次萃取，可基本分離。β≈10，數(shù)次乃至10余次萃取，CCD法β≦2，100次以上萃取，DCCC法，HSCCC法β≈1，不能分離可以根據(jù)PC法計(jì)算β值，選擇理想的分離條件。2.沉淀分離法根據(jù)溶解度的不同，控制溶液條件使溶液中的化合物或離子分離的方法統(tǒng)稱為沉淀分離法。方法的主要依據(jù)是溶度積原理。根據(jù)沉淀劑的不同，沉淀分離也可以分成用無機(jī)沉淀劑的分離法、用有機(jī)沉淀劑的分離法和共沉淀分離富集法。沉淀分離法和共沉淀分離法的區(qū)別主要是：沉淀分離法主要使用于常量組分的分離（毫克量級以上）；而共沉淀分離法主要使用于痕量組分的分離（小于1mg/mL）。常用的沉淀分離方法及試劑1、無機(jī)沉淀劑氫氧化物、硫化物、其它沉淀劑。2、有機(jī)沉淀劑草酸、銅試劑、銅鐵試。3.結(jié)晶和重結(jié)晶在化學(xué)里面，熱的飽和溶液冷卻后，溶質(zhì)以晶體的形式析出，這一過程叫結(jié)晶。重結(jié)晶是將晶體溶于溶劑或熔融以后，又重新從溶液或熔體中結(jié)晶的過程。重結(jié)晶可以使不純凈的物質(zhì)獲得純化，或使混合在一起的鹽類彼此分離。重結(jié)晶提純法的一般過程1、溶劑選擇2、固體物質(zhì)的溶解3、雜質(zhì)的除去4、晶體的析出5、晶體的收集和洗滌6、晶體的干燥4.膜分離利用膜的選擇性分離實(shí)現(xiàn)料液的不同組分的分離、純化、濃縮的過程稱作膜分離①液膜分離過程分為乳化液膜和固定液膜的分離過程；②合成膜的分離過程包括微過濾、超過濾、反滲透、氣體滲透分離、滲透蒸發(fā)、滲析及電滲析等過程。

二：柱色譜1.吸附柱色譜

吸附分類物理吸附：無選擇性吸附，吸附-解吸附發(fā)生迅速，吸附劑如硅膠、氧化鋁、活性炭等；化學(xué)吸附：不可逆吸附，如堿性氧化鋁對酚酸性成分的吸附；酸性硅膠對生物堿的吸附等；半化學(xué)吸附：聚酰胺對酚酸類、醌類的氫鍵吸附。

吸附原理：相似相吸

影響吸附過程的三要素：吸附劑（固定相）溶質(zhì)（被分離物質(zhì)）溶劑（洗脫劑、展開劑、流動相）

2、硅膠、氧化鋁

極性吸附劑：載樣量大，吸附力強(qiáng)硅膠：有中性、酸性之分，適用于各類成分分離。氧化鋁：有中性、酸性、堿性之分，不適合于分離酸性成分，多用于分離生物堿。

①被分離物質(zhì)吸附力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系

被分離物質(zhì)極性大，吸附力強(qiáng)，難洗脫，Rf值小。官能團(tuán)極性大小排列順序：-COOH>Ar-OH>R-OH>R-NH2、RNHR’、RNR’R’’>RCONRR’>RCHO>RCOR’>RCOOR’>ROR’>RH②溶劑（洗脫劑）的極性與洗脫力的關(guān)系洗脫劑極性越大，洗脫力越強(qiáng)；

大黃酸大黃素大黃酚酸性最強(qiáng)酸性其次酸性最弱溶于NaHCO3溶于Na2CO3溶于NaOH

例：從黃花夾竹桃果仁中分離到七種強(qiáng)心苷成分，根據(jù)極性大小推測從硅膠柱上的洗脫順序。

名稱RR’黃夾苷ACHO(D-glc)2黃夾苷BCH3(D-glc)2黃夾次苷ACHOH黃夾次苷BCH3H黃夾次苷CCH2OHH黃夾次苷DCOOHH單乙酰黃夾次苷BCH3H

單乙酰黃夾次苷BR’’=COCH3, 其它R’’=H

3、活性炭----非極性吸附劑

①吸附力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子量大者>分子量小者芳香族>脂肪族，活性炭和芳香族均有平面型分子的緣故。含OH、COOH、NH2多者>少者

3、活性炭----非極性吸附劑

②溶劑的洗脫力

吡啶>15%酚/醇>7%酚/H2O>醇>含水醇>H2O黃酮、生物堿的富集，糖的分離，脫色等。③應(yīng)用

4、聚酰胺（Polyamide）

由己酰胺聚合成的一類高分子化合物。分離原理：主要通過酰胺與酚、酸、醌等化合物形成氫鍵，吸附能力取決于氫鍵的強(qiáng)弱。2.分配柱色譜液-液柱色譜法，其固定相和流動相均為液體，液態(tài)固定相又稱固定液，被涂漬在惰性材料載體上構(gòu)成固定相。分配柱色譜法的優(yōu)點(diǎn)是：穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好，適用樣品的類型廣等。

固定相極性小于流動相，如HPLC反相色譜柱、反相薄層色譜板。固定相：硅膠的硅醇基與烷基結(jié)合，如RP-2、RP-8、RP-18，親脂性：RP-18>RP-8>RP-2流動相（洗脫劑）：MeOH-H2O；CH3CN-H2O洗脫順序：分離極性大的成分，極性大者先被洗脫出來。

固定相的表面修飾

3.離子交換色譜離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團(tuán)，這些帶電基團(tuán)通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質(zhì)量作用定律，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進(jìn)行交換。固定相基團(tuán)帶正電荷的時候，其可交換離子為陰離子，這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電荷，可用來與流動相交換的離子就是陽離子，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。陰離子交換柱的功能團(tuán)主要是－NH2，及－NH3：陽離子交換劑的功能團(tuán)主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3離子交換柱及-SO3H離子交換劑屬于強(qiáng)離子交換劑，它們在很廣泛的pH范圍內(nèi)都有離子交換能力；-NH2及-COOH離子交換柱屬于弱離子交換劑，只有在一定的pH值范圍內(nèi)，才能有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。

4、凝膠層析（GelPenetrationChromatography,GPC）

①葡聚糖凝膠

交聯(lián)葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和交聯(lián)劑（一般為環(huán)氧氯丙烷）以醚橋的形式互相交聯(lián)形成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)高分子材料，是水不溶性的白色球狀顆粒，酸性環(huán)境能水解，堿中穩(wěn)定。

在樣品通過一定孔徑的凝膠固定相時，由于流經(jīng)路徑的不同，使不同相對分子量的組分得以分離的方法。

表面有孔隙，其大小決定于聚糖與交聯(lián)劑的配比及反應(yīng)條件。

商品型號即按凝膠的交聯(lián)度大小分類，并以吸水量來表示，英文字母G代表葡聚糖凝膠，后面的數(shù)字表示每克凝膠吸水量，再乘以10的值，G-25的吸水量為每克2.5ml。

交聯(lián)度大→網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密→孔隙越小→吸水膨脹越少。

型號吸水量（ml/g）床體積（ml/g）分離范圍最小溶脹時間肽與蛋白質(zhì)多糖室溫沸水G-101.02~3小于700小于70031G-151.52.5~3.5小于1500小于150031G-252.54~61000~5000100~500062G-505.09~111500~3萬500~1萬62G-757.512~153000~7萬1000~5萬243G-1001015~20400015萬1000`10萬485G-1501520~305000~40萬1000~15萬725G-20020