醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)試驗(yàn)講義

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)講義浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)課程組

2012年9月3日#班級(jí) 姓名 標(biāo)本編號(hào)：分析結(jié)果：TOC\o"1-5"\h\z1 2 3 4 5—————A———— ———B——6 7 8 9 10 11 12———————————C—————————————13 14 15 16 17 18 19 20————D——— ———E———— ——F—21 22—G— 性染色體實(shí)驗(yàn)三人類染色體G帶標(biāo)本制備及觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^實(shí)驗(yàn)掌握G帶標(biāo)本制備的基本方法，學(xué)會(huì)在顯微鏡下直接觀察G帶分裂相。二、實(shí)驗(yàn)原理有許多顯示G帶的方法，最常用的是將已經(jīng)過老化的染色體制片放到37℃胰酶中進(jìn)行處理，然后用Giemsa染色。通過胰酶處理使G帶區(qū)的疏水蛋白被除去或使它們構(gòu)型變?yōu)楦杷疇顟B(tài)，由此可見在G帶區(qū)中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。Giemsa染料是由天青和伊紅組成的，染色首先取決于二個(gè)天青分子同DNA結(jié)合，在此基礎(chǔ)上結(jié)合一個(gè)伊紅分子，其次取決于一個(gè)有助于染料沉淀物積累的疏水環(huán)境。關(guān)于顯帶機(jī)理有多種論點(diǎn)，總的來說，還不能完全解釋顯帶的機(jī)理問題。三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料常規(guī)的人類體外周血染色體制片。實(shí)驗(yàn)器材恒溫水浴箱、燒杯、染缸、顯微鏡附油鏡頭、香柏油、擦鏡紙、恒溫培養(yǎng)箱、鑷子、記號(hào)筆或鉛筆等。藥品和試劑1.Hanks液NaCI 2.0gKCI 0.1gNa2HPO4.12H2O 0.0375gK2HPO4 0.015g葡萄糖 0.25g加雙蒸水250ml及1%酚紅0.5ml，成Hanks液。2．胰酶液稱取胰酶0.2g溶于100mlHanks液中，攪拌半小時(shí)，用1NNaOH調(diào)pH7.0?7.2，冷凍保存。（最好現(xiàn)配現(xiàn)用）3．磷酸緩沖液（pH6.8）4.Giemsa染液5．生理鹽水四、實(shí)驗(yàn)步驟.先將胰酶液水浴加熱到37℃。.將染色體標(biāo)本浸入胰酶液中，作用時(shí)間幾秒到幾十秒不等，依樣本存放時(shí)間長(zhǎng)短而定。（標(biāo)本需預(yù)先經(jīng)60?70℃烤2小時(shí)，或37℃恒溫老化5?7天。標(biāo)本太新鮮，染色體有些毛）.取出玻片標(biāo)本，在生理鹽水中過一下，再經(jīng)過蒸餾水洗。.Giemsa染液染色8分鐘。.自來水洗、晾干。.鏡檢。選擇分散及顯帶良好的分裂相，在油鏡下觀察。如觀察到染色體變粗并顯得毛糙邊緣，有時(shí)甚至呈糊狀，是處理過度了。觀察細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞完整，輪廓清晰，染色體在同一平面上均勻分布。染色體形態(tài)和分散良好，最好無重疊現(xiàn)象，即使染色體個(gè)別重疊，也要能明顯辨別。所觀察的染色體長(zhǎng)短大致一樣，處于同一有絲分裂時(shí)期。在所觀察的染色體周圍沒有多個(gè)或單個(gè)散在的染色體。五、注意事項(xiàng)1．帶效果的好壞，主要決定于染色體的標(biāo)本質(zhì)量。標(biāo)本染色體要長(zhǎng)，染色體分散合適，背景無胞漿，標(biāo)本未老化即保存時(shí)間過長(zhǎng)。2．要注意胰酶處理的溫度和時(shí)間，穩(wěn)定顯帶的條件，才能保證顯帶效果。.磷酸緩沖液的pH值不要過堿，偏酸為宜，否則著色不鮮明。.G帶制備有許多種方法，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室在細(xì)節(jié)處理上均不同，最好總結(jié)出適合自己實(shí)驗(yàn)室采用的方法。如果使用效果良好，不要輕易更換新方法。六、作業(yè)畫出顯微鏡下你所觀察的分裂相，要求標(biāo)明染色體號(hào)數(shù)，請(qǐng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師復(fù)核。實(shí)驗(yàn)四 Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(口乂口)基因檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誅uchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥基因(DMD)檢測(cè)的簡(jiǎn)便方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1985年，KaryMullis創(chuàng)建了聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)，簡(jiǎn)稱PCR技術(shù)。PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)，對(duì)待檢原始材料質(zhì)量要求低等特點(diǎn)。PCR反應(yīng)是由變性(denaturation)、模板與引物結(jié)合(復(fù)性annealing)及延伸(extension)m個(gè)步驟為一個(gè)周期的不斷重復(fù)過程，經(jīng)過25?30次循環(huán)之后，理論上可擴(kuò)增109倍。PCR反應(yīng)中通常只有一對(duì)寡核苷酸引物，而多重PCR(multiplexPCR)則是用幾對(duì)引物在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可以同時(shí)擴(kuò)增出幾個(gè)不同專一靶區(qū)域的片段。Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchennemusculardystrophy,DMD)是一原發(fā)于肌肉組織的遺傳病，特點(diǎn)是進(jìn)行性加重的肌肉萎縮和無力，臨床表現(xiàn)腿的假性肥大，血清酶學(xué)明顯升高。本病呈X連鎖隱性遺傳，一般男性兒童發(fā)病。DMD基因定位于Xq21.2-21.3之間，全長(zhǎng)2300kb左右，由79個(gè)外顯子組成，編碼含3685個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)一抗肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(dystrophin),這種蛋白具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)的功能。DMD基因有多種突變形式，60%是外顯子缺失突變，5%是重復(fù)突變，35%可能是很小的DNA片段缺失或點(diǎn)突變。通常選擇DMD基因中9個(gè)缺失熱點(diǎn)的外顯子擴(kuò)增，可檢出缺失突變中的90%。為節(jié)省經(jīng)費(fèi)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為擴(kuò)增DMD基因中4個(gè)外顯子，其中外顯子45和48在中國(guó)患者中的檢出率分別為26%和48%。DMD基因4個(gè)外顯子的引物順序外顯子PCR產(chǎn)物大小 引物F引物R8360gtcctttacacactttacctgttgagggcctcattctcatgttctaattag19459ttctaccacatcccattttcttccagatggcaaaagtgttgagaaaaagtc45547aaacatggaacatccttgtggggaccattcctattagatctgtcgccctac48506ttgaatacattggttaaatcccaacatgcctgaataaagtcttccttaccacac三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料正常對(duì)照DNA樣本、DMD患者DNA樣本。基因組DNA稀釋至100ng/^l,備用。實(shí)驗(yàn)器材微量加樣器、槍頭(10Rl,100Rl)、Eppendorf管、PCR儀、臺(tái)式高速離心機(jī)、電泳儀、水平電泳槽、紫外透射反射儀。藥品和試劑PCR試劑盒、dNTPs、PrimerR+F混合液：包括外顯子8、19、45和48,終濃度各25pmol/山、石蠟油、瓊脂糖、6x載樣緩沖液、溴化乙錠、pUC19/MspI、1xTBE電泳緩沖液。四、實(shí)驗(yàn)步驟.正常對(duì)照DNA樣本、DMD患者DNA樣本分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR操作如下：每一個(gè)薄壁離心管中加入：(反應(yīng)總體積為25|il)雙蒸水 17.5Rl10xBuffer 2.5rlMgCl2 2RldNTPs 0.5RlPrimerR+F（混合） 2|ilDNA模板 0.5pilTaq-DNA聚合酶 0.3pil石蠟油 1滴放置在PCR循環(huán)儀上，循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：Step1（1個(gè)循環(huán)）94℃5分鐘Step2（30個(gè)循環(huán)）94℃30秒T56℃30秒L72℃30秒Step3（1個(gè)循環(huán)）72℃7分鐘.PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（1）配制2%的瓊脂糖凝膠配制1XTBE電泳緩沖液70ml于三角燒瓶中，稱取1.4g的瓊脂糖粉放入后，沸水鍋或微波爐內(nèi)加熱熔化,冷卻至60℃,加入溴化乙錠至終濃度為0.5口g/ml,混勻凝膠，倒入電泳槽中，插入梳子，待凝固。（2）向電泳槽中倒入1XTBE,其量以沒過膠面2mm為宜，小心移去梳子。（3）取PCR擴(kuò)增樣品103加入3四l的6x載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi)。（4）接通電源，一般紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)（靠近加樣孔的一端為負(fù)極）。電壓為1~5V/cm（長(zhǎng)度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算）。140V,電泳2小時(shí)左右。根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳。（5）卸下凝膠，紫外儀上觀察電泳條帶，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)MarkerpUC19/MspI比較，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的有無及片段大小。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以觀察到正常對(duì)照樣本有4條帶，從負(fù)極往正極分別為外顯子45、48、19和8。DMD患者缺失不同的外顯子，如有缺失需3次以上的重復(fù)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)泳道1、2、5、7和8是正常對(duì)照；泳道3、4和9是第19外顯子缺失的患者；泳道6是外顯子48缺失的患者;泳道10和11是外顯子45缺失的患者。M：pUC19/MspI。六、注意事項(xiàng).引物設(shè)計(jì)時(shí)長(zhǎng)度15~30個(gè)堿基為宜，G+C含量一般為40%~60%。.退火溫度決定PCR反應(yīng)的特異性，退火溫度高，PCR反應(yīng)的特異性好；溫度低，有時(shí)會(huì)有非特異性條帶。.Mg2+濃度對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性及產(chǎn)量有顯著影響，Mg2+濃度低，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性好，但有時(shí)產(chǎn)量低；Mg2+濃度高，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性差，有非特異性條帶。.PCR循環(huán)的次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上25~30次循環(huán)后PCR產(chǎn)物積累即可達(dá)到最大值。在滿足產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。實(shí)驗(yàn)五遺傳病基因突變分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^實(shí)驗(yàn)掌握DNA的提取、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）以及DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）等幾種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，并了解SSCP分析法是檢測(cè)基因突變的一種基本方法。二、實(shí)驗(yàn)原理.DNA抽提核基因DNA可以從任何有核細(xì)胞中提出，人外周靜脈血的淋巴細(xì)胞是抽提核基因DNA最方便的材料。EDTA抗凝的外周靜脈血經(jīng)離心處理后，可分離得到大量淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核。由于DNA在細(xì)胞核內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的，因此提取過程中必須將其中的蛋白質(zhì)除去，蛋白酶K可用于消化細(xì)胞核膜及核內(nèi)蛋白質(zhì)，消化的蛋白質(zhì)用飽和NaCl沉淀，核DNA最后用酒精析出。.聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）是一種體外由引物介導(dǎo)的特定DNA序列的酶擴(kuò)增方法，由于此方法對(duì)樣本要求的微量性以及它特異、敏感、高速的特性，近年來得到廣泛應(yīng)用。全過程是基于一套“三步曲”的若干輪次的循環(huán)組合而成的。依次為DNA模板熱變性，雙鏈DNA解鏈成單鏈；在低溫下與引物退火，引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)；在適宜溫度下TaqDNA聚合酶催化引物延伸。以上三步為一個(gè)循環(huán)，循環(huán)25?35次，模板DNA可擴(kuò)增100萬倍左右，整個(gè)反應(yīng)在2?3小時(shí)內(nèi)完成（見圖）。

+第1輪循環(huán)至擊輪循環(huán)L—[I]]IHTT+第1輪循環(huán)至擊輪循環(huán)L—[I]]IHTT=變性和引物復(fù)性弓I物延伸變性和引物復(fù)性引物延帕變性和引物復(fù)性引物延伸PC版應(yīng)原理示起圖.單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singleStrandConformationPolymorphism,SSCP)分析法是一種DNA單鏈凝膠電泳技術(shù)，該法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏和適用于大樣本篩查的特點(diǎn)，可有效檢出堿基置換、缺失、插入等基因變異。目前，已廣泛用于癌基因、遺傳病基因診斷等領(lǐng)域。SSCP原理是在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中，單鏈DNA遷移率除與DNA長(zhǎng)度有關(guān)外，更主要取決于DNA單鏈所形成的空間構(gòu)象，相同長(zhǎng)度的單鏈DNA因其順序不同或單個(gè)堿基差異，所形成的構(gòu)象就會(huì)不同。PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后進(jìn)行單鏈DNA凝膠電泳時(shí)，每條單鏈處于一定的位置，靶DNA中若發(fā)生堿基缺失、插入或單個(gè)堿基置換時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位，從而提示該片段有基因突變存在(見圖)。對(duì)于小于300bp單鏈DNA片段，SSCP分析的檢測(cè)靈敏度可達(dá)90%~99%。隨著DNA長(zhǎng)度增加，其檢測(cè)靈敏度相對(duì)減弱。野牛型野牛型DNA突變DMAvrtwtm不止膝CP原理示意圖（一條染色體）Wt：野生型R：突變型三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料人外周靜脈血實(shí)驗(yàn)器材吸管、Eppendorf管、薄壁離心管、PCR儀、高速臺(tái)式離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、紫外透射反射儀、注射器（2ml）、針頭、10ml玻璃離心管、10ml塑料離心管、各種微量加樣器、槍頭（103、1003、1000口1）、天平、各種試管架、燒杯、石蠟?zāi)?、量筒、恒溫水浴箱、記?hào)筆、不銹鋼燒鍋、高壓滅菌鍋、搪瓷盤、玻璃紙、電磁爐等。藥品和試劑1.用于DNA提取藥品和試劑10mg/m1蛋白酶K（-20℃冰箱保存）0.5MEDTA（pH8.0,滅菌保存）TE緩沖液（pH8.0,滅菌保存）緩沖液A（bufferA）：蔗糖109.536g2MTris.HCI5mlTriton-X-10010ml2MMgCI22.5ml雙蒸水加至1000mL過濾，4℃冰箱保存。2MTris.HCI（pH8.0） （滅菌保存）2MMgCI2（滅菌保存）5MNaCl（滅菌保存）10%SDS瓊脂糖（進(jìn)口分裝）5xTBE

核溶解緩沖液(nucleilysisbuffer)TOC\o"1-5"\h\z{5MNaCl 40ml核溶解緩沖液(nucleilysisbuffer)0.5MEDTA (pH8.0) 2ml2MTris.HCl (pH8.0) 2.5ml雙蒸水 455.5 ml高壓滅菌保存蛋白酶K工作液 1份樣本為2ml血10samples20samples10mg/ml蛋白酶K100Rl200Rl10%SDS100Rl200Rl0.4MEDTA5Rl10RlddH2O794Rl1590Rltotalvolume1000Rl2000RlRg/口lEB（溴乙錠）6x加樣緩沖液.用于PCR反應(yīng)10xBuffer、MgCl2、dNTPs、Taq-DNA聚合酶由所購(gòu)試劑公司統(tǒng)一提供。DNA模板：正常對(duì)照來自實(shí)驗(yàn)者的血液樣本，基因突變樣本來自1例角膜營(yíng)養(yǎng)不良癥患者。擴(kuò)增片段為角膜營(yíng)養(yǎng)不良癥基因BIGH3第11外顯子，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為223bp。引物序列如下：PrimerF：CTCGTGGGAGTATAACCAGTPrimerR：TGGGCAGAAGCTCCACCCGG.用于SSCP雙甲基丙烯酰胺（Bis）丙烯酰胺 （Acr）TEMED30%貯存液： 「Acr 29gBis 1gl溶于100ml滅菌雙蒸水中10%APS（過硫酸胺） 臨用時(shí)配1%HNO30.2%AgNO3顯影液 「Na2C03 2.96gJ雙蒸水加至100ml,臨用時(shí)配，4℃冷藏。［甲醛 臨用時(shí)加54Rl〔10%硫代硫酸鈉 臨用時(shí)加10Rl10%乙酸10%乙醇蔗糖載樣緩沖液（loadingbuffer）「95%甲酰胺?20mMEDTA1溴酚藍(lán)，少許二二甲苯氰，少許四、實(shí)驗(yàn)步驟DNA抽提(1)抽取人靜脈血2ml,EDTA抗凝。(2)加bufferA至5ml刻度線，混勻后，冰箱中冷藏保存10分鐘。7000rpm離心10分鐘，棄去上清液。重復(fù)上述操作兩次。(4)加核溶解緩沖液0.3ml,震蕩20秒。(5)力口10%SDS0.02ml和蛋白酶K工作液0.05ml,混勻后，37°C恒溫水浴箱中消化過夜。(6)消化結(jié)束后，加0.1ml飽和NaCl,劇烈震蕩后，4000rpm離心30分鐘。(7)將含有DNA的上清液吸入另一新玻璃離心管中。加兩倍體積的95%酒精，緩慢晃動(dòng)，DNA逐漸被析出來。然后將DNA移至裝有100四lTE緩沖液的eppendorf管中。(8)冰箱中放置一天后測(cè)濃度。DNA稀釋至100ng/|il備用。PCR操作每一個(gè)薄壁離心管中加入：(反應(yīng)總體積為25皿)雙蒸水 18.5310xBuffer 2.5口lMgCl2 23dNTPs 0.5口lPrimerR+F 0.7.lDNA模板 0.5口lTaq-DNA聚合酶 0.3口lTOC\o"1-5"\h\z石蠟油 1滴放置在PCR循環(huán)儀上，循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：Step1 (1個(gè)循環(huán)) 94℃ 5分鐘94。C 30秒Step2 (30個(gè)循環(huán)) 卜9°C 30秒-72。C 30秒Step3 (1個(gè)循環(huán)) 72℃ 5分鐘用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的有無。配制2%的瓊脂糖凝膠，33的6x載樣緩沖液和53的PCR產(chǎn)物混合后加樣。60V,電泳30分鐘。在紫外燈下觀察結(jié)果。SSCP實(shí)驗(yàn)步驟8%的聚丙烯酰胺凝膠10ml,包括:TOC\o"1-5"\h\z廠H2O 5.3 ml蔗糖 6%J30%聚丙烯酰胺2.7ml\o"CurrentDocument":5XTBE 2ml10%APS 50|il'--TEMED 5口l用夾子夾好后,靜置1小時(shí)聚合。聚合過程中凝膠會(huì)收縮,所以靜置一些時(shí)間,待凝膠聚合后,應(yīng)在梳子上加少量雙蒸水。DNA樣品的處理與加樣PCR產(chǎn)物與15日lloadingbuffer混合后，100℃沸水中加熱變性8分鐘，冰水浴中驟冷10分鐘，然后馬上加樣。(4)在電泳槽中，以IxTBE作為電泳緩沖液，150伏電泳約2?3小時(shí)。由PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度來決定電泳時(shí)間的長(zhǎng)短。(5)銀染用銀染的方法來檢測(cè)DNA分子是一種靈敏而簡(jiǎn)單的手段。利用銀離子可與核酸結(jié)合的特性，在甲醛作用下銀離子還原為Ag,使凝膠中DNA條帶顯黑色。銀染法具有需要樣本量少，操作簡(jiǎn)便，且無同位素污染，結(jié)果可以永久保存的特點(diǎn)，是十分方便、敏感的方法。其操作過程如下：電泳完的聚丙烯酰胺凝膠用10%的酒精浸泡5分鐘。棄酒精，加入1%HNC)33分鐘，不停搖動(dòng)。③棄HNO3液，用雙蒸水清洗兩次。加入AgNC>3染液，染色1。?20分鐘。⑤用雙蒸水清洗一次。加入顯影液，至清淅的DNA單鏈電泳條帶出現(xiàn)為止。最好是先加入少量顯影液預(yù)顯影，棄預(yù)顯影液后，第二次再加入顯影液，顯影至DNA條帶出現(xiàn)為止。棄顯影液，加入10%的乙酸定影5分鐘。棄乙酸，在雙蒸水中浸泡5分鐘以上。用玻璃紙包膠、干燥，觀察分析及記錄。(8)結(jié)果分析正常人樣品目的區(qū)帶有3條：一條雙鏈